閆化學(xué)　姜波　鐘云

摘 要 從具有典型柑橘腳腐病癥的組織中分離出疫霉菌和鐮刀菌菌株。致病性測(cè)定結(jié)果顯示，接種疫霉菌1周后，離體柑橘葉片出現(xiàn)變褐腐爛癥狀，一年生實(shí)生苗的接菌部位出現(xiàn)莖腐、流膠等腳腐病癥狀，確證了該菌株的致病性。通過對(duì)菌的形態(tài)特征，培養(yǎng)形狀和內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS及延長(zhǎng)因子TEF-1α序列進(jìn)行分析，確認(rèn)該菌為煙草疫霉菌（Phytophthora nicotianae）。依據(jù)枝條接菌結(jié)果，枳和枳橙對(duì)煙草疫霉菌有高的耐性。

關(guān)鍵詞 柑橘腳腐病 ；病原鑒定 ；煙草疫霉菌 ；抗性測(cè)定

分類號(hào) S666 ；S436.66 Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2016.01.007

Abstract Citrus foot rot or root rot， caused by Phytopathora spp.， is known as a destructive disease worldwide， resulting in seedling death and loss of fruit production. Phytophthora spp. and Fusarium spp. strains were isolated from citrus trunks with typical symptom of foot rot. The suspected pathogens were identified based on their morphological， cultural and molecular profiles. The partial sequences of internal transcribed spacer （ITS） and translation elongation factor 1 alpha gene （TEF-1α） of the pathogens were amplified by PCR and aligned in GenBank. The analysis result showed the isolated pathogen was Phytophthora nicotianae. The pathogenicity of the pathogen was confirmed by inoculating the representative isolate YMJ-03 on Citrus in vitro leaves and seedlings， which showed the symptom of leaves rot， stem rot and gummosis within a week after inoculation. P. trifoliate and Carrizo citrange （C. sinensis×P. trifoliata） showed high tolerance to P. nicotianae according to response of branches to inoculation with pathogens.

Keywords citrus foot rot ； pathogen identification ； Phytophthora nicotianae ； resistance evaluation

由疫霉菌（Phytophthora spp.）引發(fā)的柑橘腳（根）腐病在世界各柑橘產(chǎn)區(qū)廣泛發(fā)生，能夠在不同時(shí)期感染柑橘大部分器官[1]。柑橘幼苗受害時(shí)，發(fā)生立枯病，癥狀是根莖部及根系腐爛，該病能在苗圃中快速傳染，并在短期內(nèi)造成幼苗成片死亡；大樹受害時(shí)，主干基部皮層和須根腐爛，發(fā)生根腐病、腳腐病以及主干枝條的流膠病等，輕則減產(chǎn)，重則引起樹體枯萎和死亡[2]；果實(shí)感染后，發(fā)生褐腐病引發(fā)落果，潛伏感染的果實(shí)在采后貯藏中易發(fā)生腐爛[3]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球10%～30%的柑橘產(chǎn)量損失與疫霉菌直接相關(guān)[4]。疫霉菌在全球廣泛分布，中國(guó)、美國(guó)、巴西、西班牙和印度等柑橘產(chǎn)區(qū)深受其害[1，5-9]。據(jù)報(bào)道，全球約有12種疫霉菌為害柑橘，其中柑橘褐腐疫霉菌（Phytophthora citrophthora （R.E. Sm. & E.H. Sm.） Leonian）和煙草疫霉菌（Phytophthora nicotianae Breda de Haan； P. parasitica Dastur）分布最廣[10]。不同疫霉菌在不同柑橘產(chǎn)區(qū)的分布和密度與溫度緊密相關(guān)[3，11]，柑橘褐腐疫霉菌主要分布在地中海式氣候區(qū)域，煙草疫霉菌則主要分布在亞熱帶氣候區(qū)域。

在廣東，特別是高溫高濕的夏季，柑橘生產(chǎn)園和苗圃常遭受該病為害，引起幼苗發(fā)病，表現(xiàn)為莖腐、流膠、葉斑、枝梢枯及根腐等，苗圃的株發(fā)病率一般在15%～30%，個(gè)別高達(dá)50%～70%，甚至90%以上[5]。篩選或選育抗耐柑橘腳腐病品種和砧木是防治柑橘腳腐病的最佳手段[2，12-13]。已有研究表明，枳具有腳腐病抗性，采用其作砧木能夠在一定程度上控制柑橘流膠和腳腐等癥狀[3，14-15]。而在實(shí)際生產(chǎn)中，枳砧也存在立枯病和腳腐病發(fā)生的問題。本研究采用常規(guī)組織分離法，成功分離出在熱帶亞熱帶地區(qū)為害嚴(yán)重的煙草疫霉菌（P. nicotianae），通過對(duì)培養(yǎng)性狀和子實(shí)體形態(tài)、rDNA-ITS及延長(zhǎng)因子TEF序列分析及致病性檢測(cè)等幾個(gè)方面對(duì)病原菌進(jìn)行詳細(xì)鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣本采集

樣本采集地為廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所資源圃和白云基地果園，用經(jīng)2.5%次氯酸鈉溶液浸泡過的刀片從病健結(jié)合處刮取具有典型腳腐病癥狀的皮層和木質(zhì)部組織，置于干凈的收集袋中，帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分離培養(yǎng)。

1.1.2 疫霉菌的分離和培養(yǎng)

采集的樣本立即進(jìn)行組織分離。將樣品用自來水沖洗，再用70%的乙醇浸泡5～10 s，在濾紙上晾干。把晾干后的樣品切成2 mm × 2 mm大小的小塊，置于改良的PARBPH篩選培養(yǎng)基（改良PARBPH培養(yǎng)基：在玉米培養(yǎng)基基礎(chǔ)上添加10 μg/mL 匹馬菌素，200 μg/mL 氨芐青霉素，10 μg/mL 利福平，25 μg/mL 五氯硝基苯，10 μg/mL 苯菌靈，50 μg/mL 惡霉靈） [16]。24℃暗培養(yǎng)2～3 d，并檢查菌的生長(zhǎng)情況，切取純培養(yǎng)菌落的菌絲塊，轉(zhuǎn)移到馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）上保存，用于形態(tài)學(xué)鑒定。

1.2 方法

1.2.1 致病性測(cè)定

離體葉片接種參照周長(zhǎng)河等[15]的方法。摘取成熟葉片，自來水清洗后，用75%的乙醇清洗其表面，最后用滅菌蒸餾水清洗除去酒精，用接種針在葉脈中間偏右位置刺一個(gè)傷口，切取帶有新長(zhǎng)出菌絲的培養(yǎng)基，大小為4 mm×4 mm，放置在傷口處，置于培養(yǎng)盒中觀察葉片發(fā)病情況。培養(yǎng)盒中加適量滅菌蒸餾水，保持濾紙濕潤(rùn)，每隔12 h噴灑滅菌水1次，保持葉面濕潤(rùn)。

田間枝條接種參照Boava等[18]的方法。先用75%酒精擦洗接種部位，用無菌手術(shù)刀輕輕削開皮層，形成大小為2 mm×2 mm的切面，取培養(yǎng)1周的疫霉菌，菌絲面朝向傷口表面，用Parafilm薄膜纏繞固定，噴霧套袋保濕，一月后觀察并記錄接菌枝條發(fā)病情況。

1.2.2 疫霉菌的培養(yǎng)性狀和子實(shí)體形態(tài)

在培養(yǎng)1周的菌落邊緣切取大小為4 mm × 4 mm的含菌絲培養(yǎng)基，移至新的固體PDA培養(yǎng)基平板中央，24℃暗培養(yǎng)4 d后開始觀察記錄菌落的形態(tài)。期間每24 h測(cè)量菌落直徑1次，計(jì)算菌落的生長(zhǎng)速度。在顯微鏡下觀察培養(yǎng)基內(nèi)菌絲和氣生菌絲的形態(tài)，拍攝病菌的孢囊梗和孢子囊形態(tài)特征。根據(jù)觀察及測(cè)量的數(shù)據(jù)與疫霉菌的菌落形態(tài)、孢囊梗和孢子囊形態(tài)特征進(jìn)行比對(duì)，對(duì)分離得到的病原菌進(jìn)行初步鑒定。

1.2.3 rDNA-ITS及延長(zhǎng)因子TEF序列分析

利用Biospin真菌基因組DNA提取試劑盒提取疫霉菌基因組總DNA，用真菌核糖體rDNA 通用引物ITS4和ITS6，擴(kuò)增18S rDNA和28S rDNA基因之間的2個(gè)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)以及其中的5.8S基因序列，引物序列為ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′，ITS6：5′-GAAGGTGAAGTCGTAACAAGG-3′[17]。根據(jù)NCBI GenBank登陸號(hào)為EU080539.1的柑橘褐腐疫霉菌（Phytophthora citrophthora）EF序列翻譯延長(zhǎng)因子（Translation elongation factor 1 alpha gene， EF1α）序列設(shè)計(jì)引物，PcEF1F（5′-CGGGTACCTCGCAGGCCGAT-3′）和PcEF1R（5′-CAATCAAGCACCGGCGAGTA-3′），PCR擴(kuò)增目標(biāo)菌落EF1α基因片段，回收PCR產(chǎn)物并送到上海生工公司測(cè)序，使用contig軟件拼接序列，并用Bioedit和clustalx1.83軟件進(jìn)行序列比對(duì)，分析擴(kuò)增的序列與EU080539.1序列的同源性，并在NCBI上比對(duì)分析。

1.2.4 柑橘種質(zhì)抗性測(cè)定

種質(zhì)抗性評(píng)價(jià)的接菌方法參照1.3致病性測(cè)定。

離體葉片法的種質(zhì)材料為枳（P. trifoliate）、卡里佐枳橙（Carrizo citrange， C. sinensis×P. trifoliata）、聶都野橘（C. reticulata ‘Niedu）、四川紅橘（C. reticulata ‘Sichuan）、酸柚（C. grandis ‘Suanyou）和資陽香橙（C. junos ‘Ziyangxiangcheng）等，每次試驗(yàn)摘取葉片10～15片。

田間枝條接種的種質(zhì)材料為枳（P. trifoliate）、卡里佐枳橙（Carrizo citrange， C. sinensis×P. trifoliata）、四川紅橘（C. reticulata ‘Sichuan）、廣西土柚（C. grandis ‘Guangxituyou）、瑤山檸檬（C. limon ‘Yaoshan）等。

2 結(jié)果與分析

從廣東省農(nóng)科院果樹研究所資源圃和白云基地果園共取10個(gè)樣本用于分離病原菌，均分離獲得菌落特征一致的培養(yǎng)物，菌絲白色無隔膜，結(jié)構(gòu)相似，生長(zhǎng)速率一致，以下對(duì)具有代表性的YMJ-03菌株進(jìn)行描述。

2.1 致病性測(cè)定結(jié)果

離體葉片接種YMJ-03后，24～28℃氣溫下，葉片3 d后發(fā)病，呈水漬狀，變褐，1周后葉片開始呈黑褐色。接種1月后枝條表現(xiàn)出全部疫霉病癥，部分枝條出現(xiàn)流膠現(xiàn)象，揭開接菌部位皮層，木質(zhì)部出現(xiàn)褐色，且伴有明顯的水漬狀，說明分離的YMJ-03具有較強(qiáng)的致病力。

2.2 疫霉菌的形態(tài)學(xué)特征

YMJ-03在28℃暗培養(yǎng)7 d，平均生長(zhǎng)速率為6.3 mm/d，菌落呈花瓣放射狀，白色，不整齊，緊貼培養(yǎng)基生長(zhǎng)，培養(yǎng)基內(nèi)菌絲生長(zhǎng)較致密（圖1A），菌絲直徑平均為7.92 μm，氣生菌絲稀疏，直徑小于培養(yǎng)基內(nèi)菌絲，平均為4.97 μm。在蔡司體式顯微鏡下觀察菌絲無隔膜，粗細(xì)較均勻，菌絲頂端膨大，分枝基部稍縊縮（圖1B，1C）。孢囊梗分化不明顯，分枝不規(guī)則。在顯微鏡下觀察到典型的疫霉菌孢子囊結(jié)構(gòu)（圖1D，1E）。這些形態(tài)學(xué)特征與煙草疫霉菌（P. nicitianae）特征一致。

2.3 序列分析

對(duì)引物ITS4/ITS6和PcEF1F/ PcEF1R PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序并分析，分別獲得約780和640 bp的序列，條帶單一清晰，滿足回收測(cè)序要求（圖2）。測(cè)序獲得的序列在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST搜索比對(duì)，結(jié)果顯示，擴(kuò)增的序列ITS和EF1α基因序列與NCBI網(wǎng)站的煙草疫霉菌的ITS和TEF1α基因序列一致，可以鑒定YMJ-03菌株是煙草疫霉菌（Phytophthora nicotianae）。

2.4 柑橘種質(zhì)抗性測(cè)定

2.4.1 離體葉片接種

以枳、卡里佐枳橙、聶都野橘、四川紅橘、重慶酸柚和資陽香橙為研究對(duì)象，分別摘取10～15片成熟葉片，接種1周后統(tǒng)計(jì)葉片發(fā)病率。在接種3 d后，部分葉片的接菌部位開始出現(xiàn)水漬狀壞死斑，接著轉(zhuǎn)變?yōu)楹稚?，葉片開始腐爛，1周后葉片的發(fā)病率都達(dá)到了100%，只接PDA培養(yǎng)基的卡里佐葉片不出現(xiàn)病癥（圖3），根據(jù)發(fā)病順序和病斑面積分析，枳對(duì)疫霉菌有較高的耐性。

2.4.2 田間枝條接種

從圖4可知，卡里佐枳橙、四川紅橘、廣西土柚、枳、瑤山檸檬在接種YMJ-03菌株1月后，接菌枝條出現(xiàn)典型的柑橘腳腐病癥，接菌部位木質(zhì)部出現(xiàn)褐色，且伴有明顯水漬狀，廣西土柚的部分枝條出現(xiàn)流膠現(xiàn)象。同離體葉片接菌結(jié)果一致，枳對(duì)煙草疫霉菌表現(xiàn)出較高的耐性。

3 結(jié)論與討論

在廣東，柑橘生產(chǎn)園、資源圃和苗圃中都存在不同程度的發(fā)病現(xiàn)象，特別是每年的4～10月，苗圃發(fā)病嚴(yán)重，疫霉菌誘發(fā)的立枯病致使幼苗成片死亡，這可能與廣東高溫高濕的氣候適于疫霉菌繁殖和傳播有關(guān)。本研究收集的10份具有典型腳腐病癥狀的柑橘皮層和木質(zhì)部中，只分離出了煙草疫霉菌，說明煙草疫霉菌是采樣果園柑橘腳腐病的主要病原菌。且有文獻(xiàn)報(bào)道煙草疫霉菌在廣東非常流行[5]。煙草疫霉菌和柑橘褐腐疫霉菌是柑橘腳（根）腐病最主要的病原菌，而煙草疫霉菌的適宜生長(zhǎng)溫度（9～36℃）和最適溫度（31℃）要高于柑橘褐腐疫霉菌的適宜生長(zhǎng)溫度（7～31℃）和最適溫度（26℃）[19]。隨著氣溫升高，柑橘苗圃中煙草疫霉菌的數(shù)量和分布明顯高于柑橘褐腐疫霉菌[7]。

另外，本試驗(yàn)在6份樣品中分離出了鐮刀菌（Fusarium spp.），這同朱麗等[20]鑒定金橘腳腐病病原菌的結(jié)果相似，部分發(fā)生腳腐病的金橘中也能夠分離出鐮刀菌。本接種試驗(yàn)顯示，單獨(dú)接種鐮刀菌（Fusarium spp.）不會(huì)導(dǎo)致柑橘發(fā)生葉片腐爛、枝條變褐的現(xiàn)象。

篩選或選育抗耐病柑橘品種和砧木是防治柑橘腳腐病的最佳手段[2，12-13]，還可以避免因過量使用農(nóng)藥而引起的農(nóng)藥殘留和環(huán)境污染等問題。本研究從具有典型腳腐病癥的柑橘皮層和木質(zhì)部分離得到煙草疫霉菌，回接柑橘離體葉片和枝條，離體葉片在1周之內(nèi)變褐腐爛，引起枝條流膠、變褐，確證該菌株的致病性，并進(jìn)一步分析了不同柑橘種質(zhì)對(duì)煙草疫霉菌的抗性。枳作為疫霉菌病害的耐病資源，已經(jīng)在生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用，但是枳砧仍然普遍發(fā)生腳腐病和幼苗立枯病等。我國(guó)柑橘資源豐富，擁有大量的野生和半野生資源，其中就可能存在抗腳腐病的資源，可為抗病育種工作提供抗性基因，為研發(fā)出抗/耐腳腐病品種提供可能。

參考文獻(xiàn)

[1] Meitz-Hopkins J C， Pretorius M C， Spies C F J， et al. Phytophthora species distribution in South African citrus production regions[J]. Eur. J. Plant Pathol. 2014， 138（4）： 733-749.

[2] Duarte. Soilborne diseases of tropical crops.[J]. Plant Pathology， 1997， 48（5）： 677-677.

[3] Timmer L W， Duncan L W. Citrus health management[J]. Citrus Health Management， 1999.

[4] Pathology P. American Phytopathological Society[J]. Nature， 1958， 181（3）：112.

[5] 成家壯，韋小燕，范懷忠. 廣東柑橘疫霉研究[J]. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2004，25（2）：31-33.

[6] Alvarez L A， León M， Abad-Campos P， et al. Genetic variation and host specificity of Phytophthora citrophthora isolates causing branch cankers in Clementine trees in Spain[J]. European Journal of Plant Pathology， 2011， 129（1）： 103-117.

[7] Ahmed Y， D'Onghia A M， Ippolito A， et al. Phytophthora nicotianae is the predominant Phytophthora species in citrus nurseries in Egypt[J]. Phytopathologia Mediterranea， 2013， 51（3）： 519-527.

[8] Das A K.， Bawage S S， Nerkar S G， and Kumar A. Detection of Phytophthora nicotianae in water used for irrigating citrus trees by Ypt1 gene based nested PCR[J]. Indian Phytopath. 2013， 66 （2）： 132-134.

[9] Graham J H， Timmer L W， Dewdney M M. 2015 Florida citrus pest management guide： Phytophthora foot rot and root rot.http：//www.crec.ifas.ufl.edu/extension/pest/PDF/2015/Phytoph -thora.pdf.

[10] Erwin D C， Ribeiro O K. Phytophthora Diseases Worldwide[M]. APS Press， St. Paul， MN， USA.1996.

[11] Alvarez L A， Gramaje D， Abad-Campos P， et al. Seasonal susceptibility of citrus scions to Phytophthora citrophthora and P. nicotianae and the influence of environmental and host-linked factors on infection development[J]. European journal of plant pathology， 2009， 124（4）： 621-635.

[12] Furr J R， Carpenter J B. Program for breeding citrus rootstocks tolerant to Phytophthora root rot[J]. In Proceedings of Florida Station Horticultural Society. 1961， 18： 18-23.

[13] Alvarez L A， Vicent A， De la Roca E， et al. Branch cankers on citrus trees in Spain caused by Phytophthora citrophthora[J]. Plant Pathol. 2008， 57（1）： 84-91.

[14] 朱偉生，蘭曉瑜，陳 薈，等. 柑橘腳腐病研究[J]. 植物病理學(xué)報(bào)，1993，23（2）：151-155.

[15] 周長(zhǎng)河，鄧秀新，柑橘體細(xì)胞雜種對(duì)柑橘腳腐病的抗病性研究[J]. 植物病理學(xué)報(bào)，1997，27（4）：361-364.

[16] Jeffers S N， Martin S B， Comparison of two media selective for Phytophthora and Pythium species[J]. Plant Disease， 1986， 70（11）： 1 038–1 043.

[17] Cooke D E L， Duncan J M. Phylogenetic analysis of Phytophthora species based on ITS1 and ITS2 sequences of the ribosomal RNA gene repeat[J]. Mycol Res. 1997， 101（2）： 667-677.

[18] Boava L P， Cristofani-Yaly M， Mafra V S， et al. Global gene expression of Poncirus trifoliata， Citrus sunki and their hybrids under infection of Phytophthora parasitica[J]. BMC genomics. 2011， 12（1）： 39.

[19] Fawcett H S. Citrus Diseases and their Control[M]. McGraw-Hill book company， New York. NY， USA.1936.

[20] 朱 麗，趙小龍，吳礽超，等. 金橘腳腐病病原菌鑒定[J]. 植物病理學(xué)報(bào)，2011，41（6）：631-634.