曾明　程櫻　錢婷　侯伶俐

430000　武漢市，湖北省臨床檢驗(yàn)中心(曾明、錢婷);湖北省食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院(程櫻)；湖北省十堰市太和醫(yī)院(侯伶俐)

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·論著·

血小板表面相關(guān)抗體檢測對(duì)ITP的診斷作用研究

曾明程櫻錢婷侯伶俐

430000武漢市，湖北省臨床檢驗(yàn)中心(曾明、錢婷);湖北省食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院(程櫻)；湖北省十堰市太和醫(yī)院(侯伶俐)

【摘要】目的研究血小板表面相關(guān)抗體檢測對(duì)特發(fā)性血小板減少性紫癜(ITP)的診斷作用研究。方法選取2012年1月至2013年1月收治的ITP患者50例(A組)，非免疫性血小板減少患者20例(B組)，其他自身免疫性疾病患者20例(C組)，另征集20名健康志愿者作為D組。測定4組血小板膜糖蛋白Ⅱb-Ⅲa(PAC-1)以及血小板相關(guān)抗體PAIgG、PAIgA、PAIgM水平，對(duì)ITP患者進(jìn)行病情分級(jí)，并對(duì)治療后進(jìn)行療效評(píng)定，統(tǒng)計(jì)各個(gè)分級(jí)的ITP患者及不同療效患者血小板相關(guān)抗體陽性率。結(jié)果4組PLT、PAC-1、PAIgA、PAIgG、PAIgM水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。A組PAIgA、PAIgG、PAIgM均明顯高于其他3組患者(P<0.05)。ITP 1、2、3級(jí)患者PAIgA、PAIgG、PAIgM陽性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。且隨著ITP分級(jí)升高，患者PAIgA陽性率呈升高趨勢(r值分別為0.712、0.614、0.732，P<0.05)。顯效、進(jìn)步、無效組患者PAIgA陽性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且隨著治療效果的改善，PAIgA陽性率呈降低趨勢(r=0.642，P<0.05)。顯效、進(jìn)步、無效組患者PAIgG、PAIgM陽性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。且隨著療效改善，患者PAIgG陽性率呈升高趨勢(r值分別為0.723和0.721，P<0.05)。結(jié)論ITP患者血小板表面相關(guān)抗體較正常人有所升高，且血小板相關(guān)抗體高低與病情程度有一定的相關(guān)性，有助于臨床ITP的診療。

【關(guān)鍵詞】血小板表面相關(guān)抗體；ITP；PAIgA、PAIgG、PAIgM

特發(fā)性血小板減少性紫癜(ITP)是一種常見的出血性疾病，以血小板減少為主要特征。ITP在育齡期女性發(fā)病率高于男性，其他年齡階段男女比例無差別[1-3]。根據(jù)持續(xù)時(shí)間可分為新診斷、持續(xù)性(持續(xù)時(shí)間在3～12個(gè)月)及慢性(持續(xù)時(shí)間≥12個(gè)月)。ITP患者常隱匿起病，病前無明顯的病毒感染或其他疾病史，病程較長，部分患者可終身患病。由于患者血小板減少，患者常有全身散在的皮膚出血點(diǎn)，部分患者可伴有輕度出血癥狀，如鼻衄、牙齦出血等，其中紫癜及瘀斑常見于下肢及上肢遠(yuǎn)端[4-6]。血小板相關(guān)抗體是診斷出血性疾病的條件之一，有研究表明，90%左右的特發(fā)性血小板減少性紫癜患者血小板相關(guān)抗體增高，包括PAIgG、PAIgA、PAIgM等[7]。隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的不斷提高以及分子生物學(xué)領(lǐng)域的不斷深入研究，關(guān)于血小板相關(guān)抗體與出血性疾病的研究不斷開展，但關(guān)于血小板相關(guān)抗體在ITP患者的診斷作用的研究尚缺乏。為此，我院對(duì)90例出血性疾病患者以及20名健康患者進(jìn)行研究，報(bào)道如下。

1資料與方法

1.1一般資料選取湖北省十堰市太和醫(yī)院自2012至2013年收治的ITP 50例(A組)，非免疫性血小板減少患者20例(B組)，其他自身免疫性疾病患者20例(C組)，另征集20名健康志愿者作為D組，參與研究。其中A組中，男24例，女26例；年齡7～48歲，平均年齡(37±16)歲；病程3～8年，平均病程(5±4)年。B組中，男11例，女9例；年齡36～49歲，平均年齡(39±15)歲；病程2～8年，平均病程(5±4)。C組中，男12例，女8例；年齡8～47歲，平均年齡(37±16)歲；病程3～7年，平均病程(5±3)年。D組中，男10例，女10例；年齡7～48歲，平均年齡(36±15)歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：本身有嚴(yán)重呼吸、循環(huán)系統(tǒng)疾病無法保證本研究順利進(jìn)行者；對(duì)本研究所用藥物過敏者；嚴(yán)重感染或者患有HIV、乙肝等傳染病患者；依從性差，不能配合醫(yī)護(hù)人員實(shí)施操作者；入院前進(jìn)行血小板輸注治療或者使用免疫抑制劑進(jìn)行治療者。以上患者均二次確診，其中ITP患者診斷標(biāo)準(zhǔn)參考中華醫(yī)學(xué)會(huì)兒科學(xué)分會(huì)血液學(xué)組1998年公布的ITP診療建議(修訂草案)進(jìn)行。4組患者性別比、年齡、病程等具有可比性?；颊呒凹覍僦椴⑼獗敬窝芯?。

1.2方法

1.2.1ITP治療方法：對(duì)ITP患者采用醋酸潑尼松龍注射液20～40 mg/d或長春新堿2 mg/m2，1次/周進(jìn)行免疫抑制劑治療，經(jīng)免疫治療無效的ITP患者予以脾切除治療。

1.2.2血小板相關(guān)抗體測定：測量前囑患者禁食12 h，采集2組患者空腹靜脈血5～10 ml。采用離心法分離血小板抗體，轉(zhuǎn)速設(shè)定為800 r/min，離心5 min，得到富含血小板血漿，加入等量磷酸鹽緩沖液———牛血清血蛋白清洗液(PBS-BSA)，去除上清液后，再加PBS-BSA清洗液2 ml，以2 500 r/min離心5 min，去上清液。重復(fù)操作3次，獲得血小板液，4℃條件保存待用。

1.2.3用流式細(xì)胞分析技術(shù)測定PAIg(PAIgG、A及M)表達(dá)水平和血小板計(jì)數(shù)：分別將上述分離所得血小板懸液50 μl與FITC-IgG(羊抗人)/CD61-PE、FITC-IgM(羊抗人)/CD6l-PE、FITC-IgA(羊抗人)/CD61-PE、FITC-IgG(羊抗鼠)/CD61-PE抗體各10 μl。充分混勻，于室溫下避光孵育3 min，PBS-BSA清洗液清洗，并用流式細(xì)胞分析儀檢測。

1.2.4血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa檢測方法：全血標(biāo)本置于室溫放置2 h或4℃過夜后于離心20 min，取上清液作為樣品，采用上海一研生物科技有限公司生產(chǎn)的血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa檢測試劑盒操作說明書對(duì)試劑盒中的要求，配置樣品稀釋液、檢測稀釋液、檢測溶液劑底物溶液、洗滌液、終止液等。在酶標(biāo)儀器板非別設(shè)置設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔，分別將配置好的樣品加入相應(yīng)孔內(nèi)，覆膜，37℃反應(yīng)120 min，再向每內(nèi)加檢測溶液工作液 100 μl，37℃,60 min。溫再洗板，加工作液，溫育60 min，洗板，底物溶液90 μl，37℃避光顯色，肉眼可見標(biāo)準(zhǔn)品的前3～4孔有明顯的梯度蘭色，后3～4孔梯度不明顯，終止。終止溶液50 μl，終止反應(yīng)，此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色。理解采用酶聯(lián)儀在450 nm波長依序測量各孔的光密度(OD值)并計(jì)算濃度。

1.3評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

1.3.1療效標(biāo)準(zhǔn)：參考中華醫(yī)學(xué)會(huì)兒科學(xué)分會(huì)血液學(xué)組制定的療效評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)：①治愈：出血消失,血小板數(shù)>100×109/L,持續(xù)2年無復(fù)發(fā)者；②有效：出血消失,連續(xù)3次血小板計(jì)數(shù)>50×109/L,或較原水平升高值>30×109/L,持續(xù)時(shí)間達(dá)2個(gè)月以上者；③進(jìn)步：出血減輕,血小板數(shù)有所上升,持續(xù)時(shí)間不足2月者；④無效：治療4周未達(dá)標(biāo)準(zhǔn)者。

1.3.2按照國際兒童工ITP研究組2006年提出的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)兼顧血小板和出血情況,進(jìn)行分級(jí)：1級(jí)：輕度,生活狀態(tài)正常,極少的出血點(diǎn)和小的疲斑,偶爾鼻出血,按壓后可停止,口腔內(nèi)無血泡,無其他出血,PLT：(10～150)×109/L；2級(jí)：中度,生活狀態(tài)有干擾,很多新的出血點(diǎn)和大的疲斑(直徑>5 cm),反復(fù)鼻出血時(shí)間>15 min,盡管按壓可止血,反復(fù)牙跟、口腔、嘴唇、咽部或消化道出血,月經(jīng)過多,血便、血尿、咳血,PLT：(10～20)×109/L；3級(jí)：重度,危及生命,廣泛的出血點(diǎn)和大的瘀斑,持續(xù)牙跟、口、咽部出血,懷疑內(nèi)出血(肺、腦、肌肉、關(guān)節(jié)、其他),PLT：<10×109/L。

2結(jié)果

2.14組PLT、PAC-1、PAIgA、PAIgG、PAIgM水平比較4組患者PLT、PAC-1、PAIgA、PAIgG、PAIgM水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。A組PAIgA、PAIgG、PAIgM均明顯高于其他3組患者(P<0.05)其中C組PLT水平與A組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表14組患者PLT、PAC-1、PAIgA、PAIgG、PAIgM水平比較

組別PLT(×109/L)PAC-1(%)PAIgA(%)PAIgG(%)PAIgM(%)A組(n=50)46±2246±1743.3±0.548±2053.3±0.5B組(n=20)24±15*12±4*25.2±0.5*20±12*32.2±0.5*C組(n=20)42±2210±4*32.3±0.5*27±15*42.3±0.5*D組(n=20)148±24*12±6*13.5±0.5*9±4*23.5±0.5* F值11.3210.337.428.229.09 P值<0.05<0.05<0.05<0.05<0.05

注：與A組比較，*P<0.05

2.2ITP分級(jí)患者血小板相關(guān)抗體陽性率比較ITP 1、2、3級(jí)患者PAIgA陽性率分別為3例(21.5%)、5例(26.4%)、9例(52.9%)，3組患者PAIgA陽性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。且隨著ITP分級(jí)升高，患者PAIgA陽性率呈升高趨勢(r=0.712，P<0.05)。ITP 1、2、3級(jí)患者PAIgG陽性率分別為9例(42.8%)、13例(68.4%)、12例(70.6%)，3組患者PAIgG陽性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。且隨著ITP分級(jí)升高，患者PAIgG陽性率呈升高趨勢(r=0.614，P<0.05)。ITP 1、2、3級(jí)患者PAIgM陽性率分別為5例(35.7%)、8例(42.1%)、8例(47.1%)，3組患PAIgM陽性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。且隨著ITP分級(jí)升高，患者PAIgM陽性率呈升高趨勢(r=0.732，P<0.05)。見表2。

表2　各ITP分級(jí)患者血小板相關(guān)抗體陽性率比較　例(%)

2.3ITP分級(jí)患者血小板相關(guān)抗體陽性率比較3組患者PAIgA陽性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。且隨著治療效果的改善，患者PAIgA陽性率呈降低趨勢(r=0.642，P<0.05)。顯效、進(jìn)步、無效組患者PAIgG陽性率分別為20例(76.9%)、19例(82.6%)、19例(90.5%)，3組患者PAIgG陽性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。且隨著療效改善，患者PAIgG陽性率呈升高趨勢(r=0.723，P<0.05)。顯效、進(jìn)步、無效組患者PAIgM陽性率分別為5例(19.2%)、8例(34.7%)、14例(66.7%)，3組患PAIgM陽性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。且隨著療效改善，患者PAIgM陽性率呈升高趨勢(r=0.721，P<0.05)。見表3。

表3　各ITP分級(jí)患者血小板相關(guān)抗體陽性率比較　例(%)

3討論

ITP是一種常見的出血性疾病，以不明原因的血小板減少為主要表現(xiàn)特征，患者可有全身性紫癜以及輕度出血癥狀[8,9]。當(dāng)血小板在血液循環(huán)中遇到相對(duì)應(yīng)的抗體時(shí)，抗原抗體會(huì)產(chǎn)生反應(yīng)[10-12]。由于免疫介導(dǎo)作用，血小板將會(huì)被單核-巨噬細(xì)胞吞噬。這個(gè)過程不但大大縮短了血液循環(huán)中血小板的壽命，甚至?xí)?yán)重影響患者血小板的數(shù)量，引起出血性疾病。目前研究較多的血小板相關(guān)抗體主要有三種，分別為PAIgA、PAIgG、PAIgM。臨床數(shù)據(jù)表明，多數(shù)ITP患者血小板相關(guān)抗體有一定程度的升高[13]。IgM是分子量最大的Ig，也稱為巨球蛋白，一般不能通過血管壁，主要存在于血液中。同時(shí)，IgM也是早期感染的重要指標(biāo)之一，在免疫應(yīng)答時(shí)，在三種抗體中出現(xiàn)最早，但持續(xù)時(shí)間較其他兩種抗體短。PAIgM具有很強(qiáng)的補(bǔ)體激活能力，一份子IgM抗體便可以激活補(bǔ)體，引起相關(guān)反應(yīng)鏈。PAIgM還有較強(qiáng)的細(xì)胞膜溶解能力，在血小板凋亡過程中具有重要作用。IgA在正常人血清中的含量僅次于IgG，占血清免疫球蛋白含量的10%～20%。IgA具有IgG以及IgM的部分功能，但在免疫反應(yīng)中并不起重要作用。新生兒出生4～6個(gè)月后，血中可出現(xiàn)IgA，到青少年期達(dá)到高峰。因此，幼兒ITP患者IgA較成人低，可無明顯升高。兒童ITP屬良性疾病，除了少數(shù)重度血小板減少患者可并發(fā)顱內(nèi)出血之外，病死率不到1%[14]。而成人ITP自發(fā)緩解者很少，約1/3的患者對(duì)激素及脾切除無效，這些患者常常遷延不愈，約5%的患者可死于顱內(nèi)出血。因此，及早診斷對(duì)患者預(yù)后具有重要作用。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，關(guān)于ITP患者血液血小板表面抗體的研究逐漸開展。為此，本院對(duì)90例出血性疾病患者以及20名健康志愿者進(jìn)行研究，并取得了一定的成果。

文中結(jié)果顯示，特發(fā)性血小板減少性紫癜患者PAIgA 、PAIgG、PAIgM均明顯高于其他3組患者(P<0.05)。提示特發(fā)性血小板減少性紫癜患者相關(guān)抗體均明顯升高，且與其他出血性疾病有所差異。與Seymour等[15]結(jié)果相似。ITP 1、2、3級(jí)患者PAIgA、PAIgG、PAIgM陽性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。且隨著ITP分級(jí)升高，患者PAIgA陽性率呈升高趨勢(r值分別為0.712、0.614和0.732，P<0.05)。顯效、進(jìn)步、無效組患者PAIgA陽性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。且隨著治療效果的改善，患者PAIgA陽性率呈降低趨勢(r=0.642，P<0.05)。顯效、進(jìn)步、無效組患者PAIgG、PAIgM陽性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。且隨著療效改善，患者PAIgG陽性率呈升高趨勢(r值分別為0.723和0.721，P<0.05)。這與Talaat等[16]結(jié)果相似。提示PAIgA、PAIgG、PAIgM與ITP患者病情呈正相關(guān)，患者ITP病情程度越重，PAIgA、PAIgG、PAIgM越高。

綜上所述，ITP患者血小板表面相關(guān)抗體較正常人有所升高，且血小板相關(guān)抗體高低與病情程度有一定的相關(guān)性，有助于臨床ITP的診療。

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The significance of detection of platelet surface associated antibodies in diagnosis of ITP

ZENGMing*,CHENGYing,QIANTing*,etal.

*HubeiProvincialClinicalLaboratoryCenter,Wuhan430000,China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the significance of detection of platelet surface associated antibodies in diagnosis of idiopathic thrombocytopenic purpura (ITP).MethodsThe subjects in the study were divided into four groups,including 50 patients who were treated in our hospital from January 2012 to January 2013 in group A,20 patients with non immune thrombocytopenia in group B,20 patients with the other autoimmune diseases in group C,moreover, the 20 healthy subjects were served as control group (group D). The levels of platelet membrane glycoprotein Ⅱb-Ⅲa (PAC-1), platelet associated antibodies including PAIgG,PAIgA,PAIgM were detected in the four groups, and the pathogenetic condition of patients with ITP was graded.After treatment the therapeutic effects were evaluated, furthermore, the positive rates of platelet surface associated antibodies were statistically analyzed.ResultsThere were significant differences in the levels of PLT,PAC-1, PAIgA,PAIgG,PAIgM among the four groups (P<0.05). The levels of PAIgA,PAIgG,PAIgM in group A were significantly higher than those in the other three groups (P<0.05). There were significant differences in the positive rates of PAIgA,PAIgG,PAIgM among patients with ITP at grade 1,2,3(P<0.05).Moreover with the increase of ITP grading,the positive rates of PAIgA of patients with ITP were increased (r=0.712,0.614,0.732,respectively,P<0.05). There were significant differences in the positrive rates of PAIgA among excellence group,improvement group, inefficiency group (P<0.05),furthermore,with the improvement of therapeutic effects,the positive rates of PAIgA were significantly decreased (r=0.642,P<0.05).There were significant differences in the positive rates of PAIgG,PAIgM among excellence group, improvement group, inefficiency group (P<0.05),furthermore,with the improvement of therapeutic effects,the positive rates of PAIgG were obviously increased (r=0.723,0.721,respectively,P<0.05).ConclusionThe platelet surface associated antibodies in patients with ITP are increased,moreover, which are correlated to the degree of pathogenetic condition,thus which are helpful for the diagnosis and treatment of ITP.

【Key words】platelet surface associated antibodies; ITP; PAIgA; PAIgG; PAIgM

(收稿日期：2015-11-10)

【中圖分類號(hào)】R 554.6

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【文章編號(hào)】1002-7386(2016)10-1494-04

通訊作者：程櫻,430000武漢市，湖北省食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院;

doi:10.3969/j.issn.1002-7386.2016.10.015

E-mail:xxrbzgdkj62970@126.com