鄧冠群，昝林森，2，王洪寶，桂林生

(1 西北農(nóng)林科技大學(xué) 動物科技學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2 國家肉牛改良中心，陜西 楊凌 712100)

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秦川牛SIRT3基因SNPs檢測及其與體尺和肉質(zhì)性狀的關(guān)聯(lián)分析

鄧冠群1，昝林森1，2，王洪寶1，桂林生1

(1 西北農(nóng)林科技大學(xué) 動物科技學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2 國家肉牛改良中心，陜西 楊凌 712100)

[摘要]【目的】 研究秦川牛SIRT3基因的多態(tài)性及其對秦川牛體尺、肉用性狀的影響，以探索改善秦川牛體尺、肉用性狀的分子育種方法?！痉椒ā?隨機(jī)選擇相近飼喂條件下468頭18～24月齡健康秦川母牛，采用DNA直接測序技術(shù)進(jìn)行SIRT3基因全區(qū)域遺傳變異檢測。運用SPSS16.0軟件中最小二乘法擬合線性模型，對SIRT3基因不同基因型與秦川牛體尺(體斜長、體高、腰高、尻長、腰角寬、胸深、胸圍和坐骨端寬)和肉質(zhì)性狀(背膘厚、眼肌面積和肌肉脂肪含量)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析?！窘Y(jié)果】 經(jīng)DNA測序發(fā)現(xiàn)，秦川牛SIRT3基因在第4內(nèi)含子上存在2個突變位點，分別為C22522T突變和C22680G突變，均存在3種基因型。χ2檢驗表明，C22522T和C22680G位點均處于Hardy-Weinberg極度不平衡狀態(tài)(P<0.01)。關(guān)聯(lián)性分析表明，秦川牛SIRT3基因2個突變位點的不同基因型與體斜長、體高、尻長、腰角寬、胸深、胸圍和背膘厚、眼肌面積、肌肉脂肪含量有顯著或極顯著相關(guān)關(guān)系?！窘Y(jié)論】 SIRT3基因?qū)η卮ㄅ２糠煮w尺、肉質(zhì)性狀有顯著的影響，可以嘗試作為秦川肉牛新品系培育的主要候選基因。

[關(guān)鍵詞]秦川牛；SIRT3基因；SNPs；體尺性狀；肉質(zhì)性狀

Sirtuins是一類高度保守的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+)依賴的去乙?；?，可調(diào)節(jié)如壽命和代謝等生物學(xué)功能[1]。研究表明，Sirtuins在進(jìn)化過程中高度保守，自細(xì)菌到人類的生物機(jī)體內(nèi)均存在其同源體，其家族包含7個細(xì)胞定位和靶蛋白各不相同的成員(SIRT1～SIRT7)，其中，SIRT1和SIRT2定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中，SIRT3、SIRT6和SIRT7定位于線粒體基質(zhì)中，而SIRT4和SIRT5則定位于線粒體中，該基因家族各成員參與基因沉默、DNA雙鏈斷裂修復(fù)、組蛋白去乙酰化、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)和抗衰老等生理生化過程[2]。

眾所周知，線粒體是細(xì)胞能量代謝最重要的細(xì)胞器，在細(xì)胞代謝、能量產(chǎn)生、細(xì)胞凋亡和胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等生理過程中發(fā)揮著重要的作用。作為Sirtuins家族重要的成員之一，SIRT3定位于線粒體基質(zhì)中，通對多種細(xì)胞因子去乙?；饔茫M(jìn)而調(diào)控機(jī)體的能量代謝[3]。敲除SIRT3基因會導(dǎo)致機(jī)體的線粒體過度乙?；斐杉?xì)胞能量代謝及有絲分裂過程發(fā)生異常。乙酰輔酶A合成酶2 (AceCS2)是SIRT3基因的重要底物，對其去乙酰化作用后，機(jī)體的三羧酸循環(huán)產(chǎn)能進(jìn)程受到影響[4]，這說明SIRT3在ATP的生成中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。此外，SIRT3基因通過作用于過氧化物酶體增殖子激活受體(PGC1-α)，能間接促進(jìn)線粒體生物合成和脂肪酸氧化代謝[5]。白藜蘆醇作為一種有效的抗氧化劑，可以調(diào)控線粒體活性并上調(diào)SIRT3基因的表達(dá)量，而SIRT3被證實能夠抑制3T3-L1脂肪細(xì)胞的脂肪形成并且能改變脂肪量[6]。以上研究表明，SIRT3通過在線粒體中發(fā)揮一系列作用，可調(diào)控機(jī)體的能量和脂質(zhì)代謝。

但目前有關(guān)SIRT3基因多態(tài)性的研究尚未見報道。鑒于SIRT3基因在機(jī)體能量代謝過程中的重要調(diào)控機(jī)制，本研究將該基因作為影響秦川牛肉用性狀的一個候選基因，研究其多態(tài)性與秦川牛生長及肉質(zhì)性狀間的多態(tài)性效應(yīng)，為加快秦川牛肉用性狀的改善提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1血樣的采集從陜西省秦川肉牛良種繁育中心、陜西省農(nóng)牧良種場和西北農(nóng)林科技大學(xué)國家肉牛改良中心良種繁育場隨機(jī)選擇飼喂條件相近的18～24月齡健康秦川母牛468頭，頸靜脈采血10 mL/頭，ACD抗凝(V(ACD)∶V(血液)=1∶6)，輕微振蕩混勻后-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2主要試劑和儀器蛋白酶K購自德國默克公司；EDTA、Tris飽和酚、Tris、N,N’-亞甲基雙丙烯酰胺(Bis)、硼酸、二甲基亞砜(DMSO)、N,N,N,N’-四甲基乙二胺(TEMED)、含染料Reaction MIX、DNA Marker、甲醛、瓊脂糖等，均購自天根生化科技(北京)有限公司；十二烷基磺酸鈉(SDS)、去離子甲酰胺，均購自北京鼎國昌盛生物科技有限公司。

凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad公司，美國)，PCR儀(Bio-Rad公司，美國)，冷凍高速離心機(jī)(CENTURION，英國)，電泳槽、穩(wěn)流穩(wěn)壓電泳儀(北京市六一儀器廠，北京)，恒溫培養(yǎng)箱(上海精宏實驗設(shè)備有限公司，上海)。

1.2秦川牛體尺指標(biāo)及肉質(zhì)指標(biāo)的測定

實地測量秦川牛體斜長、體高、腰高、尻長、腰角寬、胸深、胸圍和坐骨端寬等體尺指標(biāo)，并使用獸用B超儀活體測定相應(yīng)個體的背膘厚、眼肌面積和肌間脂肪含量等肉質(zhì)指標(biāo)。

1.3秦川?；蚪MDNA的制備

采用傳統(tǒng)的酚氯仿抽取法提取牛的血樣基因組DNA[7]，用TE緩沖液溶解后，用0.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測其純度，同時用紫外分光光度計測定其質(zhì)量濃度并調(diào)整到50 ng/μL，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4秦川牛SIRT3基因的序列分析

1.4.1引物的設(shè)計與合成參考GenBank中提供的牛SIRT3基因序列(GenBank登錄號：NM_001206669.1)，利用 Primer 5.0 軟件設(shè)計編碼區(qū)引物，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，其相關(guān)信息見表1。

表 1　秦川牛SIRT3基因突變區(qū)域引物信息

1.4.2SIRT3基因的PCR擴(kuò)增PCR反應(yīng)體系為15 μL：0.5 UTaqDNA聚合酶(含0.20 mg dNTPs)，2.5 mmol/L MgCl2的Mix 7.5 μL，DNA(50 ng/μL)1.0 μL，5 μmol/L混合引物(上、下游引物濃度均為10 pmol/μL)0.6 μL，ddH2O 5.9 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 30 s，60.9 ℃ 退火30 s，72 ℃ 35 s，37個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠以5 V/cm電泳20 min檢測。引物序列、擴(kuò)增產(chǎn)物長度、退火溫度和位置見表1。

1.4.3PCR產(chǎn)物純化與測序隨機(jī)選取8個DNA樣本構(gòu)建DNA池進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物使用凝膠回收試劑盒回收純化，并送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測序。使用SeqMan (5.2) 軟件對測序結(jié)果進(jìn)行比對以尋找突變位點，結(jié)果顯示，第4內(nèi)含子上存在2個突變位點，分別是22 522位核苷酸C→T的突變和22 680位核苷酸C→G的突變，由于在這2個突變位點上未發(fā)現(xiàn)合適的酶切位點，且SSCP方法復(fù)雜等原因，本試驗468個樣本采用直接測序法分析，測序公司為上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。

1.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

Yij=μ+Gi+Fj+eij。

式中：Yij為個體表型值，μ為群體均值，Gi為標(biāo)記基因型效應(yīng)，F(xiàn)j為牧場種群效應(yīng)，eij為隨機(jī)誤差。

2結(jié)果與分析

2.1秦川牛SIRT3基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果

圖1顯示，PCR擴(kuò)增獲得了307 bp的片段，長度與預(yù)期結(jié)果一致，且條帶清晰、特異性好，可直接用于后期的DNA直接測序。

圖 1　秦川牛SIRT3基因的PCR擴(kuò)增部分結(jié)果

2.2秦川牛SIRT3基因的測序及序列分析

通過使用SeqMan(5.2)軟件，對比分析秦川牛SIRT3基因的測序結(jié)果，發(fā)現(xiàn)了2個多態(tài)位點，均處于第4內(nèi)含子，分別命名為C22522T(B1)和C22680G (B2)。分析發(fā)現(xiàn),B1位點存在CC、CT和TT 3種基因型，B2位點存在CC、CG和GG 3種基因型(圖2)。

2.3秦川牛SIRT3基因突變區(qū)域遺傳多態(tài)性分析

從群體遺傳學(xué)角度分析秦川牛SIRT3基因各突變位點的基因型頻率、等位基因頻率、遺傳純合度、遺傳雜合度、有效等位基因數(shù)和多肽信息含量等遺傳指標(biāo)，結(jié)果(表2)顯示，B1位點TT是優(yōu)勢基因型，T為優(yōu)勢等位基因，位點處于低度多態(tài)狀態(tài)；B2位點CC是優(yōu)勢基因型，C為優(yōu)勢基因，位點處于中度多態(tài)狀態(tài)。χ2檢驗表明，B1、B2處于Hardy-Weinberg極度不平衡狀態(tài)(P<0.01)。

圖 2　秦川牛SIRT3基因突變區(qū)域基因型突變序列比對

表 2　秦川牛SIRT3基因B1和B2位點突變的遺傳多樣性

2.4秦川牛SIRT3基因各突變位點不同基因型與體尺和肉質(zhì)性狀的關(guān)聯(lián)分析

2.4.1秦川牛SIRT3基因各突變位點不同基因型與體尺性狀的相關(guān)性由表3可知，B1位點不同基因型在體斜長、體高、尻長、腰角寬和胸深方面差異顯著(P<0.05)，胸圍方面差異極顯著(P<0.01)，CC基因型個體均值顯著高于TT基因型個體均值；而在其他體尺性狀方面基本遵循CC基因型個體均值略高于TT基因型個體均值的趨勢，但無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。B2位點不同基因型在體高、尻長、腰角寬、胸深和胸圍方面差異顯著(P<0.05)，體斜長方面差異極顯著，CC基因型個體均值顯著高于CG基因型個體均值；而在其他體尺性狀方面遵循CC基因型個體均值略高于CG基因型個體均值的趨勢，但無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。關(guān)聯(lián)性分析表明：秦川牛SIRT3基因不同突變位點的不同基因型個體與體斜長、體高、尻長、腰角寬、胸深和胸圍顯著相關(guān)(P<0.05)或極顯著相關(guān)(P<0.01)。

2.4.2秦川牛SIRT3基因各突變位點不同基因型與肉質(zhì)性狀的相關(guān)性由表4可知，B1位點的TT基因型個體在背膘厚方面顯著高于CC基因型個體(P<0.05)，在肌間脂肪含量方面顯著高于CT基因型個體(P<0.05)，而在眼肌面積方面CC基因型個體均值略高于CT和TT基因型個體均值，但無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。B2位點不同基因型在眼肌面積方面差異極顯著(P<0.01)，CC基因型個體平均值顯著高于GG基因型個體平均值；而在背膘厚和肌間脂肪含量CC基因型個體均值略高于CG和GG基因型個體均值，但無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。關(guān)聯(lián)性分析表明：秦川牛SIRT3基因不同突變位點的不同基因型與背膘厚、眼肌面積和肌間脂肪含量顯著相關(guān)(P<0.05)或極顯著相關(guān)(P<0.01)。

表 3　秦川牛SIRT3基因各突變位點不同基因型與體尺性狀的關(guān)聯(lián)性分析

注：同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。下同。

Note:Different lowercase letters mean significant difference (P<0.05)；while different uppercase letters mean extremely significant difference(P<0.01).The same below.

表 4　秦川牛SIRT3基因各突變位點不同基因型與肉質(zhì)性狀的關(guān)聯(lián)性分析

3討論與結(jié)論

蛋白質(zhì)組學(xué)研究顯示，乙?；诰€粒體中是一種常見的翻譯后修飾，大概有三分之一以上的蛋白質(zhì)出現(xiàn)乙?；覅⑴c代謝的蛋白質(zhì)優(yōu)先發(fā)生乙?；痆8-9]。作為最主要的一種NAD+依賴性的去乙?；竅10]，SIRT3被證實可以與諸多底物結(jié)合，如LCAD、SOD2，GDH及OTC等[11-14]，并調(diào)節(jié)其乙酰化水平，進(jìn)而在動物主要的代謝途徑(包括糖酵解、三羧酸循環(huán)、尿素循環(huán)、脂肪酸代謝以及糖原代謝)中發(fā)揮關(guān)鍵的調(diào)控作用[13]。基于此，筆者預(yù)測SIRT3基因可能在牛糖脂代謝過程中發(fā)揮重要的作用，進(jìn)而影響其生長發(fā)育和肉質(zhì)性狀。作為本試驗的研究對象，秦川牛以屠宰率高、肉用潛力較大、遺傳穩(wěn)定、耐粗飼和抗逆性強(qiáng)而著稱，為我國五大黃牛品種之一。然而，相對于國外商業(yè)品種(如日本和牛)而言，秦川牛同樣存在后軀不充實、載肉率和肌間脂肪含量低等缺陷[15]。因此，運用標(biāo)記輔助選擇(Marker assisted selection,MAS)方法對秦川牛育種效率進(jìn)行改良和提高意義重大。

目前，針對SIRT3基因的研究主要集中在老鼠和人，尚未發(fā)現(xiàn)關(guān)于牛SIRT3基因多態(tài)分析的相關(guān)報道。本研究利用DNA直接測序技術(shù)，對秦川牛SIRT3基因全區(qū)域進(jìn)行SNPs篩查，結(jié)果在第4內(nèi)含子上發(fā)現(xiàn)2個突變位點，分別為C22522T和C22680G，關(guān)聯(lián)性分析結(jié)果顯示這2個突變均能夠影響秦川牛生長發(fā)育和肉質(zhì)性狀。盡管這2個位點位于內(nèi)含子區(qū)域，均不編碼蛋白質(zhì)序列，然而隨著現(xiàn)在研究的不斷深入，到目前為止，內(nèi)含子的傳統(tǒng)觀念已被打破，越來越多的試驗結(jié)果表明內(nèi)含子可能在基因表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮著重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)含子突變夠能影響附近的剪切供體和調(diào)節(jié)原件[16]，進(jìn)而導(dǎo)致基因編碼蛋白發(fā)生改變[17]。目前諸多研究驗證了這一結(jié)論。Mohr等[18]研究發(fā)現(xiàn)，牛的CSN1S1第4內(nèi)含子剪切供體末端(+6)的一個堿基突變引起了前體mRNA加工過程中上游外顯子的跳讀，導(dǎo)致了奶牛αs1-casein A蛋白表達(dá)量的下降。高建斌等[19]發(fā)現(xiàn)，秦川牛DKK1基因的G523A位于第1內(nèi)含子上，該位點突變對體高和尻長有顯著的影響。本研究中，基于SIRT3基因檢測到的2個突變位點對秦川牛部分生長及肉質(zhì)形狀的分析結(jié)果，推測可能是由于這2個突變導(dǎo)致了某些基因的表達(dá)水平或者調(diào)控機(jī)制發(fā)生了變化，具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究分析。

本試驗研究結(jié)果表明，秦川牛SIRT3基因B1和B2位點均處于Hardy-Weinberg極度不平衡狀態(tài)(P<0.01)，可能是由于這2個突變基因型的個體在自然選擇和人工選育過程中容易被淘汰，也可能是本試驗樣本量不足，導(dǎo)致雜合子過少所致。秦川牛雖然經(jīng)過長期肉用選育，效果顯著，但是其群體生長和生產(chǎn)性能還有待進(jìn)一步提高。因此，加大選擇強(qiáng)度是提高秦川牛生長和生產(chǎn)性能的必要手段。本研究秦川牛SIRT3基因各突變位點不同基因型與體尺和肉質(zhì)性狀的關(guān)聯(lián)性分析結(jié)果表明，不同位點的不同基因型與體斜長、體高、腰角寬、尻長、胸深、胸圍、背膘厚、眼肌面積和肌間脂肪含量顯著 (P<0.05)或極顯著相關(guān)(P<0.01)。由此推測，C22522T位點的等位基因T、C22680G位點的等位基因G都可能影響秦川牛的體尺和肉質(zhì)性狀指標(biāo)，因此SIRT3基因可能是影響體斜長、體高、尻長、腰角寬、胸深和胸圍等體尺性狀，以及背膘厚、眼肌面積和肌間脂肪含量等肉質(zhì)性狀的主效QTL或與之緊密連鎖。因此，SIRT3可考慮用于選育秦川肉牛新品種(系)標(biāo)記輔助選擇的主效候選基因。

秦川牛SIRT3基因2個SNPs對秦川牛體斜長、體高、尻長、腰角寬、胸深和胸圍的體尺性狀以及背膘厚、眼肌面積和肌肉脂肪含量的肉質(zhì)性狀均有不同程度的影響，可以嘗試將其作為秦川肉牛新品系培育的主效候選基因或與主基因緊密連鎖的分子標(biāo)記。由于本試驗樣本量較少，且僅限于對秦川牛體尺和肉質(zhì)性狀的關(guān)聯(lián)性分析，未與其他品種的牛進(jìn)行比較，所以本研究結(jié)果還需要進(jìn)一步驗證分析，以便有效地提高選擇準(zhǔn)確性，更好地為秦川肉牛新品種的培育提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

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Association ofSIRT3 gene polymorphism with body measurements and meat traits of Qinchuan cattle

DENG Guan-qun1,ZAN Lin-sen1,2,WANG Hong-bao1,GUI Lin-sheng1

(1CollegeofAnimalScienceandTechnology,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi712100,China;2NationalBeefCattleImprovementCenterinChina,Yangling,Shaanxi712100,China)

Abstract:【Objective】 The study investigated the polymorphism of SIRT3 gene and the association with body measurements and meat traits of Qinchuan cattle to find molecular breeding methods for improving body measurements and meat traits of Qinchuan cattle.【Method】 In this study,468 Qinchuan heifers with the age of 18 to 24 months under similar feeding conditions were randomly selected.Direct DNA sequencing methods were used to detect the polymorphisms in SIRT3 gene.Least squares fitting linear model incorporated in SPSS16.0 program was used to analyze the relationship of genotype with body measurements and meat traits.【Result】 Two SNPs,C22522T and C22680G,were detected in SIRT3 gene.PCR-RFLP analysis showed that three genotypes were found in C22522T and C22680G,respectively.χ2 test showed C22522T and C22680G were in Hardy-Weinberg disequilibrium (P<0.01).The genotypes of different mutations in SIRT3 gene were found to be significantly related to body length,withers height,hip height,rump length,pin bone width and back-fat thickness,lion muscle area,and intramuscular fatty content.【Conclusion】 SNPs of the SIRT3 gene had significant effects on body measurements and meat traits of Qinchuan cattle.Thus,it could be used as a major candidate gene for new strain breeding of Qinchuan cattle.

Key words:Qinchuan cattle;SIRT3 gene;polymorphism;body measurement;meat trait

[文章編號]1671-9387(2016)01-0001-06

[中圖分類號]S823.8+12

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

[作者簡介]鄧冠群(1991-)，男，湖南婁底人，碩士，主要從事動物生物技術(shù)研究。E-mail:dengguanqun.789@163.com[通信作者]昝林森(1963-)，男，陜西扶風(fēng)人，教授，博士，博士生導(dǎo)師，主要從事肉牛遺傳改良與種質(zhì)創(chuàng)新研究。E-mail:zanlinsen@163.com

[基金項目]“十二五”國家“863”計劃項目(2013AA102505，2011AA100307-02)；國家科技支撐計劃項目(2011BAD2804-03)；國家自然科學(xué)基金項目(31272411)；國家轉(zhuǎn)基因育種專項(2011ZX08007-002)；國家肉牛牦牛產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項目(CARS-38)；陜西省科技統(tǒng)籌創(chuàng)新工程計劃項目(2011KTCL02-07)

[收稿日期]2014-05-09

DOI：網(wǎng)絡(luò)出版時間:2015-12-0214:2510.13207/j.cnki.jnwafu.2016.01.001

網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20151202.1425.002.html