周永剛，王　騏，劉偉燦，鄧　宇，李晰亮，靳　京，鄧文波，趙利旦，王興超，王　南，王法微，李曉薇，董園園，李海燕

(1 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) a生物反應(yīng)器與藥物開發(fā)教育部工程研究中心，b生命科學(xué)學(xué)院，吉林 長春130118；2 東北師范大學(xué) 附屬中學(xué)，吉林 長春 130118)

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大豆Pre-miRNAs作為內(nèi)參基因在鹽堿脅迫下的表達(dá)穩(wěn)定性分析

周永剛1a,1b，王騏2，劉偉燦1a,1b，鄧宇1a,1b，李晰亮1a,1b，靳京1a,1b，鄧文波1a,1b，趙利旦1a,1b，王興超1a,1b，王南1a,1b，王法微1a,1b，李曉薇1a,1b，董園園1a,1b，李海燕1a,1b

(1 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) a生物反應(yīng)器與藥物開發(fā)教育部工程研究中心，b生命科學(xué)學(xué)院，吉林 長春130118；2 東北師范大學(xué) 附屬中學(xué)，吉林 長春 130118)

[摘要]【目的】 對比大豆Pre-miRNAs候選內(nèi)參基因和傳統(tǒng)內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性，篩選出適合鹽、堿脅迫條件下RT-qPCR分析的最穩(wěn)定內(nèi)參基因?！痉椒ā?選用了6個保守的Pre-miRNAs基因和4個常規(guī)的內(nèi)參基因作為候選內(nèi)參基因，通過RT-qPCR的方法，利用GeNorm和NormFinder軟件，評價了10個候選內(nèi)參基因在大豆鹽、堿脅迫條件下的穩(wěn)定性?！窘Y(jié)果】 大豆鹽脅迫下，葉中表達(dá)最穩(wěn)定的基因組合是Pre-miR166和Pre-miR172，表達(dá)最穩(wěn)定的單一基因是FboX；根中表達(dá)最穩(wěn)定的基因組合是Act11和EF1A，表達(dá)最穩(wěn)定的單一基因是Act11。大豆堿脅迫下，葉中表達(dá)最穩(wěn)定的基因組合是Pre-miR393和Pre-miR172，表達(dá)最穩(wěn)定的單一基因是Pre-miR393；根中表達(dá)最穩(wěn)定的基因組合是Act11和60S，表達(dá)最穩(wěn)定的單一基因是Pre-miR172?！窘Y(jié)論】 大豆Pre-miRNAs可以與傳統(tǒng)內(nèi)參基因一樣作為內(nèi)參定量目的基因。

[關(guān)鍵詞]大豆；鹽脅迫；堿脅迫；熒光定量PCR；Pre-miRNAs(前體miRNAs)；內(nèi)參基因

熒光定量PCR是一種快捷、準(zhǔn)確、強大的定量分析技術(shù)，但其結(jié)果的可靠性取決于內(nèi)參基因是否穩(wěn)定[1-2]。傳統(tǒng)內(nèi)參基因的選擇通常選用構(gòu)成細(xì)胞器骨架基本組分或參與生物體內(nèi)基本代謝過程穩(wěn)定表達(dá)的基因[3-5]。但是，近年來的研究發(fā)現(xiàn),在不同類型的細(xì)胞和組織中、發(fā)育的不同階段以及各種試驗條件等情況下,這些穩(wěn)定表達(dá)基因的表達(dá)水平通常變異較大。由此發(fā)現(xiàn)，傳統(tǒng)的內(nèi)參基因并不能完全滿足定量分析對內(nèi)參基因的要求[6]。因此，新種類內(nèi)參基因的挖掘仍具有重要意義。

MicroRNA在生物體內(nèi)存在多種形式，如Pri-miRNA、Pre-miRNA、成熟miRNA。目前已有報道表明，成熟miRNA作為內(nèi)參基因比傳統(tǒng)內(nèi)參基因具有更高的穩(wěn)定性，它不僅可用于定量其他的成熟miRNA，也可用于定量編碼蛋白基因[6]。而目前有關(guān)成熟miRNA基因的前身Pre-miRNA相比傳統(tǒng)內(nèi)參基因穩(wěn)定性的評價尚未見報道。本研究選用6個保守的大豆Pre-miRNAs基因與4個傳統(tǒng)內(nèi)參基因，利用GeNorm[7]和NormFinder[8]軟件，分析了鹽、堿脅迫條件下大豆根和葉2種組織中的表達(dá)穩(wěn)定性，并篩選出最適合RT-qPCR的內(nèi)參基因，為進(jìn)一步研究大豆鹽、堿2種不同脅迫條件下的基因表達(dá)差異，以及應(yīng)用Pre-miRNAs作為新的內(nèi)參基因資源提供參考。

1材料與方法

1.1植物材料和處理方法

本試驗使用大豆(Williams 82)品種作為基礎(chǔ)研究材料。用改良的Hoagland培養(yǎng)液培養(yǎng)大豆，待大豆第2對復(fù)葉萌發(fā)時進(jìn)行如下脅迫處理：(1)鹽脅迫處理：110 mmol/L NaCl；(2)堿脅迫處理：110 mmol/L NaHCO3。各處理脅迫0，3，6，9 h后，分別取根和葉片組織，在液氮中速凍后保存在-80 ℃冰箱,備用。

1.2RNA的提取

采用RNAiso plus(Takara：Code No.9108/9109)試劑對檢測樣本Total RNA進(jìn)行提取，使用Nanodrop2000對RNA濃度和質(zhì)量進(jìn)行檢測，利用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的完整性。

1.3反轉(zhuǎn)錄cDNA

樣品反轉(zhuǎn)錄采用Takara公司PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser-Perfect Real Time試劑盒(Takara：Code No.RR047A),具體操作依據(jù)試劑盒說明。將得到的cDNA在-20 ℃保存。

1.4候選看家基因的選擇和引物設(shè)計

根據(jù)文獻(xiàn)[9-12]中報道的與大豆相關(guān)的傳統(tǒng)內(nèi)參基因和本實驗室已有的內(nèi)參評價數(shù)據(jù),選擇了4個在大豆中最穩(wěn)定的傳統(tǒng)內(nèi)參基因(EF1A、FboX、Act11和60S)；并嘗試選取了6個大豆Pre-miRNA基因(Pre-miR156、Pre-miR166、Pre-miR167、Pre-miR171、Pre-miR172和Pre-miR393)作為候選內(nèi)參基因。傳統(tǒng)內(nèi)參基因的引物設(shè)計可參照常規(guī)熒光定量引物的設(shè)計原則。Pre-miRNAs基因的引物設(shè)計與常規(guī)定量引物不同的是考慮了Pre-miRNAs家族各成員的同源性，設(shè)計的引物具有家族成員通用性。所有引物均由蘇州金唯智生物科技有限公司合成(表1)。

1.5熒光定量PCR

本研究采用Takara公司的SYBR Premix ExTaqTM(Tli RNaseH Plus)試劑盒，其定量部分操作均在Mx3000PTMReal time PCR儀上進(jìn)行，其操作系統(tǒng)為Stratagene(Mx3000P)。每個樣品設(shè)置2個重復(fù)和NTC對照。經(jīng)優(yōu)化后反應(yīng)體系為：SYBR Premix ExTaqTM(2×)10 μL，PCR 正向引物(10 μmol/L)0.8 μL，PCR 反向引物(10 μmol/L)0.8 μL，Rox Reference DyeⅡ(10 μmol/L)0.4 μL，RT 反應(yīng)液 2.0 μL，DEPC水 6 μL。兩步法PCR擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)程序：預(yù)變性95 ℃ 30 s；PCR反應(yīng)95 ℃ 5 s，62 ℃ 20 s，40個循環(huán)。熔解曲線95 ℃ 20 min，62 ℃ 30 s，95 ℃ 20 s。

表 1　10個候選基因引物序列及相關(guān)數(shù)據(jù)

注:由于Pre-miRNA基因家族成員間的同源性較高，設(shè)計的引物具有基因家族通用性，因此同一對引物在不同家族成員中的擴(kuò)增產(chǎn)物長度具有差異。

Note:Since the Pre-miRNA gene homology between family members is high,universal primers were designed with gene family.Therefore there are differences in the same primers for different members of the family.

1.6數(shù)據(jù)分析

引物的擴(kuò)增效率(E)和相關(guān)系數(shù)(R2)計算公式為E=10(-1/斜率)-1，可由Mx3000p系統(tǒng)對樣本稀釋曲線各稀釋點的測定結(jié)果自動計算得出。候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性分析采用GeNorm[7]和NormFinder[8]軟件。GeNorm軟件可以顯示逐步去除最不穩(wěn)定候選內(nèi)參基因后的各內(nèi)參基因的平均表達(dá)穩(wěn)定值M，M值越小，說明基因表達(dá)越穩(wěn)定；同時,GeNorm軟件可給出內(nèi)參基因的配對變異數(shù)Vn/(n+1)柱形圖，該圖顯示了準(zhǔn)確量化時需要選擇的內(nèi)參基因數(shù)目。Vn/(n+1)的選擇閾值為0.15，當(dāng)Vn/(n+1)>0.15時,表明需選擇n個以上的基因組合作為量化標(biāo)準(zhǔn)；當(dāng)Vn/(n+1)≤0.15時,表明只需選擇n個內(nèi)參基因作為量化標(biāo)準(zhǔn)。NormFinder的運行原理與GeNorm程序類似, 也是通過計算基因表達(dá)穩(wěn)定值M,然后根據(jù)穩(wěn)定值M的大小排序,M值越大穩(wěn)定性越差；反之,具有最小穩(wěn)定值M的基因為最穩(wěn)定的基因。

2結(jié)果與分析

2.1鹽堿脅迫后大豆葉和根總RNA質(zhì)量檢測

本研究利用RNAiso plus方法對脅迫后的大豆葉和根的總RNA進(jìn)行了提取，并用Nanodrop2000對其濃度和質(zhì)量進(jìn)行檢測，保證提取的RNA OD260/OD280值在1.8～2.2，最后對提取的RNA進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳，條帶清晰，質(zhì)量完整，無明顯降解(圖1)。說明提取的RNA可以用于后續(xù)的反轉(zhuǎn)錄及實時熒光定量PCR，將其稀釋至800 ng/μL，放入-80 ℃冰箱待用。

2.2各候選內(nèi)參基因引物PCR擴(kuò)增效率及特異性

為了熒光定量分析的準(zhǔn)確性，本研究對RT-qPCR反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，確保了各候選內(nèi)參基因引物的擴(kuò)增效率在95%～110%，稀釋曲線相關(guān)系數(shù)R2>0.99(表2)，符合RT-qPCR對引物擴(kuò)增效率的基本要求。為了保證10個候選內(nèi)參基因的引物特異性，本研究對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行了1.0%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果顯示擴(kuò)增產(chǎn)物與目的片段大小一致，沒有出現(xiàn)引物二聚體(圖2)；同時10個候選內(nèi)參基因的熔解曲線,也都只出現(xiàn)單一峰(圖3),且不加模板的陰性對照檢測不到熒光信號，說明各候選內(nèi)參基因引物的特異性好。因此，各內(nèi)參基因引物的擴(kuò)增特性均符合RT-qPCR的要求。

圖 1　大豆總RNA樣品的電泳檢測結(jié)果

基因Gene擴(kuò)增效率/%PCRefficiency稀釋曲線相關(guān)系數(shù)R2基因Gene擴(kuò)增效率/%PCRefficiency稀釋曲線相關(guān)系數(shù)R2Act1198.10.997Pre-miR166108.30.996EF1A95.31.000Pre-miR16799.90.99660S100.00.998Pre-miR171106.50.987FboX100.70.999Pre-miR17296.30.999Pre-miR15697.80.990Pre-miR39399.90.995

圖 3　候選內(nèi)參基因引物特異性擴(kuò)增的熔解曲線

2.3大豆堿脅迫下候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性

為了發(fā)掘大豆堿脅迫下穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因，本研究利用GeNorm和NormFinder軟件，分別對大豆不同組織堿脅迫條件下10個候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行了評價。GeNorm分析結(jié)果(圖4)顯示，在堿脅迫下，各候選內(nèi)參基因在大豆根、葉片中的表達(dá)穩(wěn)定性有所差異。其中在葉片中候選內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性(根據(jù)穩(wěn)定值M大小排序，M值越小越穩(wěn)定)由高到低依次為Pre-miR393/Pre-miR172(0.142)>FboX(0.154)>Act11(0.180)>Pre-miR166(0.223)>60S(0.268)>EF1A(0.301)>Pre-miR156(0.336)>Pre-miR171(0.373)>Pre-miR167(0.405)；在根中候選內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性由高到低依次為Act11/60S(0.125)>EF1A(0.234)>FboX(0.286)>Pre-miR167(0.346)>Pre-miR172(0.383)>Pre-miR171(0.431)>Pre-miR156(0.485)>Pre-miR166(0.528)>Pre-miR393(0.577)。

GeNorm柱形圖分析結(jié)果(圖5)顯示,所有的Vn/(n+1)值都小于程序所推薦值0.15，說明無需加入第3個基因進(jìn)行校正,最合適的內(nèi)參基因數(shù)目是2個。葉中表達(dá)最穩(wěn)定的基因組合是Pre-miR393和Pre-miR172，根中表達(dá)最穩(wěn)定的基因組合是Act11和60S。同時,NormFinder分析結(jié)果(表3)顯示，堿脅迫的葉片中Pre-miR393表達(dá)最穩(wěn)定，而Pre-miR167、EF1A和Pre-miR156表達(dá)穩(wěn)定性差；堿脅迫的根中Pre-miR172表達(dá)最穩(wěn)定，而Pre-miR393、Pre-miR166和Pre-miR156表達(dá)穩(wěn)定性差。

綜上所述，通過對比GeNorm和NormFinder分析結(jié)果，發(fā)現(xiàn)2種軟件得到的結(jié)果基本一致，不同的是GeNorm軟件分析可得到內(nèi)參基因的最優(yōu)組合，而NormFinder軟件只能選擇單個最穩(wěn)定的內(nèi)參基因。盡管2種軟件部分基因排序稍有不同，但這種差異經(jīng)證實是由這2種軟件計算方法不同引起的[13-18]。

圖 4　GeNorm軟件分析堿脅迫中內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定值排序

圖 5　GeNorm軟件分析確定堿脅迫中用作標(biāo)準(zhǔn)化的最適內(nèi)參基因數(shù)目

穩(wěn)定性排序Order葉Leaves基因Gene穩(wěn)定值Stability根Roots基因Gene穩(wěn)定值Stability穩(wěn)定性排序Order葉Leaves基因Gene穩(wěn)定值Stability根Roots基因Gene穩(wěn)定值Stability1Pre-miR3930.045Pre-miR1720.0956Pre-miR1660.19960S0.2772Act110.108FboX0.1667EF1A0.258Pre-miR1670.3273Pre-miR1720.109EF1A0.2138Pre-miR1560.277Pre-miR1560.3414FboX0.129Act110.2419Pre-miR1710.319Pre-miR1660.477560S0.182Pre-miR1710.26810Pre-miR1670.340Pre-miR3930.484

2.4大豆鹽脅迫下候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性

為了發(fā)掘大豆鹽脅迫下穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因，本研究利用GeNorm和NormFinder軟件分別對大豆不同組織鹽脅迫條件下，10個候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行了評價。GeNorm分析結(jié)果(圖6)顯示，在鹽脅迫下葉中候選內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性從高到低依次是Pre-miR166/Pre-miR172(0.076)>FboX(0.097)>Pre-miR171(0.146)>Pre-miR167(0.171)>Pre-miR393(0.213)>Act11(0.248)>60S(0.275)>EF1A(0.301)>Pre-miR156(0.346)；根中候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性從高到低依次是Act11/EF1A(0.038)>60S(0.093)>FboX(0.122)>Pre-miR172(0.145)>Pre-miR156(0.166)>Pre-miR393(0.187)>Pre-miR166(0.240)>Pre-miR171(0.301)>Pre-miR167(0.414)。同時，GeNorm柱形圖分析結(jié)果(圖7)顯示，所有的Vn/(n+1)值都小于程序所推薦值0.15，說明無需加入第3個基因進(jìn)行校正,最合適的內(nèi)參基因數(shù)目是2個。葉中表達(dá)最穩(wěn)定的基因組合是Pre-miR166和Pre-miR172，根中表達(dá)最穩(wěn)定的基因組合是Act11和EF1A。NormFinder分析結(jié)果(表4)顯示，鹽脅迫的葉片中候選內(nèi)參基因FboX表達(dá)最穩(wěn)定，而Pre-miR156、Pre-miR167和EF1A表達(dá)穩(wěn)定性差；鹽脅迫的根中Act11表達(dá)最穩(wěn)定，而Pre-miR166、Pre-miR171和Pre-miR156表達(dá)穩(wěn)定性差。綜上所述，通過對比GeNorm和NormFinder分析結(jié)果，發(fā)現(xiàn)2種軟件得到的結(jié)果基本一致。

圖 6　GeNorm軟件分析鹽脅迫中內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定值排序

圖 7　GeNorm軟件分析確定鹽脅迫中用作標(biāo)準(zhǔn)化的最適內(nèi)參基因數(shù)目

3結(jié)論與討論

熒光定量PCR是一個功能強大的定量分析技術(shù)，為了確保試驗結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，RT-qPCR需要選用合適的內(nèi)參基因作為基因表達(dá)分析時衡量目的基因表達(dá)量的參照標(biāo)準(zhǔn)，以消除不同樣品間可能存在的差異,通常選用的內(nèi)參基因是表達(dá)較為穩(wěn)定的看家基因[18]。但是，近年來大量的研究結(jié)果表明,并沒有絕對穩(wěn)定表達(dá)的基因,任何一種內(nèi)參基因的穩(wěn)定只是在一定試驗條件下的相對穩(wěn)定[6,19]。因此，如何選擇一個合適的內(nèi)參基因就顯得尤為重要。

本研究選用了6個保守的大豆Pre-miRNAs基因和4個傳統(tǒng)內(nèi)參基因作為候選內(nèi)參基因，利用GeNorm和NormFinder軟件，分析了10個候選內(nèi)參基因在大豆鹽、堿脅迫下根和葉2種組織中的表達(dá)穩(wěn)定性，結(jié)果顯示，大豆鹽脅迫下，葉中表達(dá)最穩(wěn)定的基因組合是Pre-miR166和Pre-miR172，表達(dá)最穩(wěn)定的單一基因是FboX，根中表達(dá)最穩(wěn)定的基因組合是Act11和EF1A，表達(dá)最穩(wěn)定的單一基因是Act11；大豆堿脅迫下，葉中表達(dá)最穩(wěn)定的基因組合是Pre-miR393和Pre-miR172，表達(dá)最穩(wěn)定的單一基因是Pre-miR393,根中表達(dá)最穩(wěn)定的基因組合是Act11和60S，表達(dá)最穩(wěn)定的單一基因是Pre-miR172。值得注意的是，Pre-miRNAs在大豆鹽、堿脅迫的葉中表達(dá)穩(wěn)定性優(yōu)于傳統(tǒng)內(nèi)參基因，分析原因可能有以下幾個方面：其一，Pre-miRNAs作為小分子RNA受RNA降解影響更小；其二，Pre-miRNAs比傳統(tǒng)的內(nèi)參基因表達(dá)豐度較低，更適用于定量分析表達(dá)豐度較低的目標(biāo)基因[12,19]；其三，Pre-miRNAs基因為小分子RNA，其反轉(zhuǎn)錄必須使用隨機引物,而傳統(tǒng)看家基因反轉(zhuǎn)錄常使用oligodT,這可能會使二者的反轉(zhuǎn)錄效率不同而影響基因表達(dá)水平的可比性。

綜上所述，Pre-miRNAs基因作為新的內(nèi)參基因資源為研究者提供了新的參考。另外，Pre-miRNAs作為內(nèi)參基因可使用與編碼蛋白基因定量分析相同的普通定量試劑體系，不增加技術(shù)困難和成本。因此，進(jìn)一步開發(fā)和研究Pre-miRNAs內(nèi)參基因具有重要意義。

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Stability of Pre-miRNAs in soybean as reference genes for quantitative polymerase chain reaction under salt and alkali stresses

ZHOU Yong-gang1a,1b,WANG Qi2,LIU Wei-can1a,1b,DENG Yu1a,1b,LI Xi-liang1a,1b，JIN Jing1a,1b,DENG Wen-bo1a,1b，ZHAO Li-dan1a,1b,WANG Xing-chao1a,1b,WANG Nan1a,1b,WANG Fa-wei1a,1b,LI Xiao-wei1a,1b,DONG Yuan-yuan1a,1b,LI Hai-yan1a,1b

(1 aMinistryofEducationEngineeringResearchCenterofBioreactorandPharmaceuticalDevelopment,bCollegeofLifeSciences,JilinAgriculturalUniversity,Changchun,Jilin130118,China;2HighSchoolAttachedtoNortheastNormalUniversity,Changchun,Jilin130118,China)

Abstract:【Objective】 This study selected the appropriate reference genes for RT-qPCR by comparing the stability of candidate precursor miRNAs and traditional housekeeping genes in different tissues of soybean under different stress treatments.【Method】 Six conservative Pre-miRNAs genes and four regular housekeeping genes in soybean were selected as candidate reference genes to evaluate their expression stability under salt and alkali stresses during RT-qPCR process using GeNorm and NormFinder.【Result】 In leaves,the most stable combination of genes under salt stress was Pre-miR166 and Pre-miR172 whereas the best single gene under this stress was FboX.While,in roots,the most stable combination of genes under salt stress was Act11 and EF1A whereas the best single gene was Act11.Under alkali stress conditions,the most stable combination of genes in leaves was Pre-miR393 and Pre-miR172 whereas the best single gene was Pre-miR393.The most stable combination of genes in roots was Act11 and 60S whereas the best single gene was Pre-miR172.【Conclusion】 Precursor miRNAs reference genes can be used as reference genes together with traditional housekeeping genes.

Key words:soybean;salt stress;alkali stress;RT-qPCR;Pre-miRNAs;reference gene

[文章編號]1671-9387(2016)01-0061-07

[中圖分類號]Q-03;S-3

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

[通信作者]李海燕(1971-)，女，吉林長春人，教授，博士，博士生導(dǎo)師，主要從事植物抗逆分子生物學(xué)與基因工程研究。

[作者簡介]周永剛(1989-)，男，吉林圖們?nèi)?，在讀碩士，主要從事植物抗逆分子生物學(xué)與基因工程研究。

[基金項目]國家轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項(2014ZX08010-002)；國家自然科學(xué)基金項目(31271746，31201144)；吉林省發(fā)改委項目(JF2012C002-04)

[收稿日期]2014-05-20

DOI：網(wǎng)絡(luò)出版時間:2015-12-0214:2510.13207/j.cnki.jnwafu.2016.01.010

網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20151202.1425.020.html

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