唐軍榮鄭 元劉惠民馬煥成陳 詩劉忠美（.西南林業(yè)大學(xué)西南地區(qū)生物多樣性保育國家林業(yè)局重點實驗室，云南昆明650224；2.西南林業(yè)大學(xué)云南省高校林木遺傳改良與繁育重點實驗室，云南昆明650224）

?

牛角瓜組培快繁過程中生理生化指標的變化

唐軍榮1，2鄭 元1劉惠民1馬煥成1陳 詩1劉忠美1
（1.西南林業(yè)大學(xué)西南地區(qū)生物多樣性保育國家林業(yè)局重點實驗室，云南昆明650224；2.西南林業(yè)大學(xué)云南省高校林木遺傳改良與繁育重點實驗室，云南昆明650224）

摘要：以牛角瓜組培苗為材料，對牛角瓜組培快繁過程中不同階段的幾種生理生化指標進行了測定，為其組培器官發(fā)生的調(diào)控提供依據(jù)。結(jié)果表明：牛角瓜增殖和生根過程中的形態(tài)變化與SOD、POD、CAT活性、可溶性糖和可溶性蛋白含量存在一定的相關(guān)性；在增殖過程中SOD活性變化先升后降，POD活性變化規(guī)律總體呈現(xiàn)下降趨勢，CAT的活性變化呈現(xiàn)上升趨勢，可溶性蛋白含量變化先降后升，可溶性糖含量呈上升趨勢。在生根過程中SOD、POD和CAT酶的活性變化趨勢基本一致，總體呈現(xiàn)“上升—下降—上升”，可溶性蛋白含量總體變化趨勢為“升高—下降—緩慢升高”，可溶性糖含量總體變化趨勢為先緩慢升高，后又緩慢下降。

關(guān)鍵詞：牛角瓜；抗氧化酶活性；可溶性蛋白；可溶性糖；組培快繁

牛角瓜（Calotropis gigantea）屬蘿藦科（Asclepiadaceae）牛角瓜屬（Calotropis）直立灌木，產(chǎn)于云南、四川、廣西和廣東等省區(qū)，生長于低海拔向陽山坡、曠野地及海邊［1］。牛角瓜的光合特性研究顯示，牛角瓜對高溫、高光照具有較強的耐性［2］，其種子采用水浸處理能有效提高種子發(fā)芽率［3］。牛角瓜的果實纖維屬天然纖維，是一種新型生態(tài)環(huán)保的紡織材料，具有廣闊的開發(fā)前景［4］。

植物生長是通過細胞分裂和伸長完成的，不同的生長發(fā)育時期，其生理生化方面的性質(zhì)也會發(fā)生相應(yīng)的變化，對組培苗形態(tài)發(fā)生過程中生理生化的變化研究，有助于觀察分析組培過程中組織的形成、分化、發(fā)育。目前，對該項研究已有較多報道，如周潔［5］通過研究沙棘（Hippophae rhamnoides）組培苗生根的生理生化機制，為提高沙棘組培苗生根率提供了重要依據(jù)；張有鐸等［6］對菜用大黃（Rheum rhaponticum）組培苗不同生根培養(yǎng)階段的形態(tài)指標和生理指標進行了觀察研究，探討了生理生化指標與組培苗移栽成活率之間的關(guān)系；郎賢波［7］對樹莓（Rubus corchorifolius）莖段增殖和發(fā)根過程中主要生理指標變化與形態(tài)發(fā)生的相關(guān)性進行了探討，對樹莓的組培苗生產(chǎn)具有積極指導(dǎo)意義。對于牛角瓜的組培研究，李克烈等［8］以牛角瓜的葉片為外植體，開展了牛角瓜的組織培養(yǎng)研究，通過葉片誘導(dǎo)出愈傷組織，最后分化出不定芽，試管苗生根培養(yǎng)后，其移栽成活率可達85%以上，而關(guān)于牛角瓜組培過程中的生理生化指標研究則未見相關(guān)報道。試驗以前期建立的牛角瓜離體快繁體系為基礎(chǔ)，分析牛角瓜組培過程中不同時期生理生化指標的變化，探討牛角瓜組培過程中這些生理生化指標與增殖、生根的關(guān)系，為牛角瓜組培苗的離體再生提供理論依據(jù)，并為進一步遺傳轉(zhuǎn)化和倍性育種奠定堅實的基礎(chǔ)，同時也對其他木本植物形態(tài)建成條件的探索，調(diào)控離體器官形態(tài)發(fā)生等具有實際意義。

1　材料與方法

1.1試驗材料

在牛角瓜組培過程中的增殖和生根階段，分別取組培苗作為試驗材料。

1.2方法

1.2.1樣品采集

1）增殖階段：增殖培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/ L 6-BA+0.1 mg/ L NAA+30 g/ L白砂糖+5.1 g/ L瓊脂粉，pH為5.8。每瓶接種4枚莖段，在相同條件（光照、溫度）下進行培養(yǎng)，分別在接種后第20 d（不定芽形成）、30 d（不定芽伸長生長）和40 d（不定芽木質(zhì)化）時進行取樣，稱取完后備用。試驗重復(fù)3次，取樣3次。

2）生根階段：生根培養(yǎng)基為1/2MS+0.2 mg/ L IBA+15 g/ L白砂糖+5.1 g/ L瓊脂粉+0.1 g/ L活性炭，pH值為5.8，培養(yǎng)條件同上，每瓶接種4株。生根培養(yǎng)分別于接種時第14 d（不定根形成）、24 d（不定根伸長生長）和30 d（不定根木質(zhì)化）時進行取樣，稱取完后備用。試驗重復(fù)3次，取樣3次。

1.2.2測定方法

具體方法［9-10］：超氧化物岐化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）的活性采用分光光度計法測定，可溶性蛋白含量采用紫外吸收法測定，可溶性糖含量采用蒽酮比色法測定。

1.2.3數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2003和SPSS 17.0進行統(tǒng)計分析。

2　結(jié)果與分析

2.1增殖過程中生理生化變化

2.1.1增殖過程中SOD、POD、CAT的酶活性變化

牛角瓜在增殖時，根據(jù)形態(tài)變化大致劃分為3個部分，20 d以前以不定芽形成為主，在21～30 d時以不定芽的伸長生長為主；在31～40 d時以營養(yǎng)物質(zhì)積累為主。外部形態(tài)及內(nèi)部的酶活性都發(fā)生著相應(yīng)的變化，見圖1。

由圖1可知，SOD呈倒“V”字型變化，不定芽的伸長生長階段時SOD活性最高，這說明牛角瓜在形成不定芽時，細胞內(nèi)產(chǎn)生的活性氧少，而對超氧陰離子自由基等活性氧具有清除能力的SOD活性也低。當處于伸長生長階段時超氧陰離子自由基等活性氧含量增加，誘導(dǎo)SOD酶的活性相應(yīng)達到最大，因而更好的詮釋了SOD與不定芽的形成和伸長生長關(guān)系緊密。POD在整個增殖階段一直呈下降趨勢，在啟動階段，芽原基已經(jīng)大量形成，不定芽開始大量產(chǎn)生，此時POD活性最高，POD能使組織中所含的某些碳水化合物轉(zhuǎn)化成木質(zhì)素，增加木質(zhì)化程度。因此，隨著芽體的伸長生長，增殖過程的不斷進行，POD活性開始出現(xiàn)下降，表明組培苗在前期活動較為劇烈，不斷進行新芽的分化。而CAT含量隨著培養(yǎng)時間的增長則表現(xiàn)出緩慢上升的趨勢，表明隨著CAT活性的增加，其對H2O2的清除能力也在增加，能夠減少細胞內(nèi)的活性氧，使組培苗免受傷害。

圖1　牛角瓜增殖階段的酶活性變化Fig.1 The changes of enzyme activity in the proliferation stage

2.1.2增殖過程中可溶性蛋白含量變化

可溶性蛋白含量變化見圖2。在不定芽形成期，蛋白質(zhì)含量最高，說明此時增殖材料代謝活躍，為不定芽的分化提供充足的蛋白質(zhì)；隨著不定芽的生長，此時，蛋白質(zhì)大量消耗，含量開始快速下降，到最后趨于平穩(wěn)，表明體內(nèi)共需達了平衡。蛋白質(zhì)是細胞的重要組成成分，在細胞的生命活動中起重要作用。在不定芽形成期，新的蛋白質(zhì)還沒有合成，而細胞啟動所需的物質(zhì)是由細胞內(nèi)原有可溶性蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)變而來；隨著不定芽的生長，對蛋白質(zhì)的消耗量增加，從而使得牛角瓜可溶性蛋白質(zhì)含量呈下降趨勢；到后期，牛角瓜的不定芽生長緩慢，木質(zhì)化程度增加，細胞合成的大量蛋白質(zhì)超過了不定芽的需要量，即可溶性蛋白含量呈現(xiàn)出上升趨勢。

圖2　增殖過程中可溶性蛋白含量變化Fig.2 The changes of soluble protein content in the process of proliferation

2.1.3增殖過程中可溶性糖含量變化

可溶性糖是光合作用的初級產(chǎn)物，也是植物體內(nèi)多糖、蛋白質(zhì)等大分子化合物合成的基礎(chǔ)，增殖過程中可溶性糖含量變化見圖3。由圖3可知，在牛角瓜增殖過程中，牛角瓜組培苗可溶性糖含量變化先趨于平緩，后期表現(xiàn)出快速上升。糖類物質(zhì)在增殖過程中的變化，將直接反映牛角瓜在形態(tài)結(jié)構(gòu)上的變化情況，在不定芽形成及伸長生長階段，可溶性糖的消耗和產(chǎn)生基本維持平衡，后期含量逐漸升高，可能是隨著組培苗的生長發(fā)育，可溶性糖得到大量的積累。

圖3　增殖過程中可溶性糖含量變化Fig.3 The changes of soluble sugar content in the process of proliferation

2.2生根過程中生理生化變化

2.2.1生根過程中SOD、POD、CAT的酶活性變化

將增殖結(jié)束后的牛角瓜組培苗進行生根培養(yǎng)，在生根過程中形態(tài)變化見表1，酶活性變化見圖4。酶活性的總體變化趨勢為先升后降，最后再上升。當無根組培苗接種到生根培養(yǎng)基后，原有的生長狀態(tài)被打破，導(dǎo)致SOD活性升高；隨著不定根的形成和伸長生長，新的平衡狀態(tài)得以形成，酶活性下降；但又由于后期根系伸長生長后，組培苗在營養(yǎng)和空間方面產(chǎn)生了競爭，使得酶活性又逐漸升高。POD的變化趨勢是先上升，后緩慢下降，之后又開始升高，因為在根的起源和生長過程中POD主要通過氧化IAA而起作用，根未形成時POD的活性處在較低水平，降解IAA能力弱，使內(nèi)源IAA得到積累，對誘導(dǎo)根原基有利，隨著根系長出，POD活性迅速增加，降解IAA作用增強，IAA水平下降，有利于根原基的生長和根的發(fā)育。CAT活性的變化趨勢為先上升，后下降，最后緩慢上升。當根開始伸長生后，植株能夠通過根系大量從培養(yǎng)基中吸收營收，不利狀態(tài)得以改變，使得POD和CAT出現(xiàn)降低；后期生長速度加快，在一定條件下，組培苗之間產(chǎn)生營養(yǎng)和空間競爭，CAT、POD活性又出現(xiàn)了升高。

表1　牛角瓜的生根過程中的形態(tài)變化Table 1 The changes of Calotropis gigantea morphology in the process of rooting

圖4　生根過程中的酶活性變化Fig.4 The changes of enzyme activity in the process of rooting

2.2.2生根過程中可溶性蛋白含量變化

可溶性蛋白雖只占蛋白質(zhì)的一部分，但是生物體能吸收利用的主要是可溶性蛋白，它在生命體活動中發(fā)揮著運輸協(xié)調(diào)、免疫保護、產(chǎn)生和傳導(dǎo)神經(jīng)活動、控制生長分化等功能。由圖5可知，牛角瓜組培苗可溶性蛋白含量變化先升高，然后緩慢下降，之后又呈現(xiàn)緩慢上升趨勢。后期酶活性的升高，其抵抗力增加，有利于蛋白的合成，則可溶性蛋白含量升高。說明在生根的不同時期，牛角瓜組培苗可溶性蛋白的表達量不一致，而這些可溶性蛋白可能對根的形成有一定的促進作用。

圖5　生根過程中可溶性蛋白質(zhì)含量的變化Fig.5 The changes of soluble protein content in the process of rooting

2.2.3生根過程中可溶性糖含量變化

由圖6可知，牛角瓜組培苗可溶性糖含量變化先緩慢上升，后緩慢下降，可溶性糖含量變化幅度小。由于組培苗剛接種在生根培養(yǎng)基上時，其切口處受到生長素的刺激，在切口處慢慢形成根原基，同時牛角瓜的可溶性糖在慢慢的積累，用于前期根的誘導(dǎo)需求；根系長出后，根的伸長生長和苗高的生長需要大量能量，導(dǎo)致自身貯備的可溶性糖開始降低。另一方面，生根苗已經(jīng)可以通過根系從培養(yǎng)基中快速獲取營養(yǎng)，并滿足自身部分需求，一定程度上使得下降趨于平緩。

圖6　生根過程中可溶性糖含量的變化Fig.6 The changes of soluble sugar content in the process of rooting

3　結(jié)論與討論

在植物組培過程中，組培苗的外部形態(tài)變化受培養(yǎng)基種類、繼代周期、培養(yǎng)條件等影響，在外部形態(tài)的變化過程中，其內(nèi)部相關(guān)的生理生化指標也會呈現(xiàn)出規(guī)律性變化。組培苗在培養(yǎng)過程中，其培養(yǎng)基中的激素對組培苗影響最大，特別是分裂素與生長素的比值決定了組培苗的生長發(fā)育方向。由于激素的添加，導(dǎo)致了組培苗原有的激素水平被破壞，使組培苗處于一定的逆境中，為了適應(yīng)新的環(huán)境，其酶活性等指標也不斷發(fā)生著變化。超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）和過氧化氫酶（CAT）在植物體內(nèi)普遍存在，并相互協(xié)調(diào)，清除植物體內(nèi)過剩的自由基，使自由基維持在一個低水平上，有效防御活性氧對生物體的毒害作用，從而防止自由基對植物細胞造成傷害［11-12］。不定芽的形態(tài)發(fā)生和早期芽原基的形成與過氧化物酶、可溶性糖、可溶性蛋白的含量有一定的相關(guān)性［13］。此外，可溶性糖作為一種能源消耗物質(zhì)，在植物不定芽發(fā)生時，為新陳代謝活躍的胚細胞提供充足的能源，反映了體內(nèi)作為有效營養(yǎng)物的碳水化合物和能量水平［14］。

牛角瓜的生理生化指標在組培過程中的變化情況為：在增殖階段，SOD呈先升后降趨勢，POD呈下降趨勢，CAT呈上升趨勢，可溶性蛋白含量呈先降后緩慢上升趨勢，可溶性糖的含量則一直呈上升趨勢；在生根過程中，SOD、POD和CAT酶活性的總體變化規(guī)律相對較一致，先升后降，最后又上升，可溶性蛋白含量則呈“上升—下降—緩慢上升”的趨勢，可溶性糖含量先緩慢上升，后又緩慢下降，變化幅度小。牛角瓜增殖過程中CAT活性的變化趨勢與鵝掌楸（Liriodendron chinese）組織培養(yǎng)中增殖時的CAT變化趨勢一致，但可溶性糖含量的變化則不相同，這可能與植物種類或者添加的激素種類有關(guān)［15］。沙棘組培苗生根過程中，POD呈現(xiàn)先上升后下降，再上升的變化趨勢，但其活性較低，表明植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)可以通過調(diào)節(jié)體內(nèi)氧化酶活性來促進不定根的形成［5］，這也與本研究的結(jié)果相似。此外，牛角瓜組培苗生根過程中的可溶性糖含量變化與王瑞等［16］對油茶（Camellia oleifera）的組培苗生根研究結(jié)果一致；另外，在虎耳蘭的植株再生時，葉片愈傷組織的誘導(dǎo)，以及后期不定芽的產(chǎn)生及生長階段，其體內(nèi)的可溶性蛋白也發(fā)生著相應(yīng)的動態(tài)變化［17］。

牛角瓜在組培過程中，由于激素的刺激，導(dǎo)致其形態(tài)發(fā)生了變化，增殖階段表現(xiàn)為不定芽的形成、伸長生長和木質(zhì)化；而在生根階段，則表現(xiàn)為不定根的形成、伸長生長及木質(zhì)化。這些形態(tài)變化之前，其生理生化指標已發(fā)生，外部形態(tài)和內(nèi)部生理指標間存在著較大的關(guān)聯(lián)性，因此，其研究結(jié)果對于牛角瓜優(yōu)良單株離體再生體系的建立及優(yōu)化，都具有一定的理論指導(dǎo)性。為了更好地提示組培過程中各個環(huán)節(jié)的動態(tài)變化，今后可以借助切片技術(shù)從細胞水平更加直觀地觀察其細胞結(jié)構(gòu)變化與外部形態(tài)變化的相關(guān)性。

［參考文獻］

［1］中國科學(xué)院.中國植物志（第63卷）［M］.北京：科學(xué)出版社，1977：384-386.

［2］高柱，王小玲，余發(fā)新，等.干熱河谷牛角瓜光合特性［J］.東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報，2014，42（3）：19-23.

［3］鄭元，羅明燦，高柱，等.牛角瓜的研究動態(tài)［J］.西南林業(yè)大學(xué)學(xué)報，2015，35（5）：97-103

［4］黃惠民.一種紡紗用牛角瓜纖維棉條及其加工方法和設(shè)備.中國，CN101565860［P］.2009-10-28.

［5］周潔.沙棘組培快繁體系的建立及組培苗生根的生理生化機制研究［D］.沈陽：沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)，2005.

［6］張有鐸，蔡祖國，趙一鵬.菜用大黃組培苗生根特性研究［J］.湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，48（11）：2759-2761.

［7］郎賢波.豐滿紅樹莓組培快繁及其生理生化特性的研究［D］.延邊：延邊大學(xué)，2007.

［8］李克烈，羅聯(lián)忠，陳偉，等.牛角瓜的組織培養(yǎng)［J］.廣西農(nóng)業(yè)生物科學(xué)，2007，26（3）：247-248.

［9］李合生.植物生理生化實驗原理和技術(shù)［M］.北京：高等教育出版社，2000：267-268.

［10］洛文靜，李奕松.植物生理學(xué)實驗教程［M］.北京：中國林業(yè)出版社，2000：267-268.

［11］孫國榮，彭永臻，閻秀峰，等.干旱脅迫對白樺實生苗保護酶活性及脂質(zhì)過氧化作用的影響［J］.林業(yè)科學(xué)，2003，39（1）：165-167.

［12］陳少瑜，郎南軍，賈利強，等.干旱脅迫對坡柳等抗旱樹種幼苗膜脂過氧化及保護酶活性的影響［J］.植物研究，2006，26（1）：88-92.

［13］蔣波.芥菜離休培養(yǎng)芽再生過程中的生理生化變化研究［D］.重慶：西南大學(xué)，2010.

［14］陳陸琴.五種木本植物的組織培養(yǎng)及其生理生化研究［D］.大連：遼寧師范大學(xué)，2002.

［15］路承香.鵝掌楸組織培養(yǎng)及其再生過程中生理生化特性研究［D］.蘭州：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)，2008.

［16］王瑞，陳永忠，王湘南，等.油茶組培苗生根過程中生理生化指標的變化［J］.經(jīng)濟林研究，2015，33（2）：68-72.

［17］楊銀萍.虎耳蘭離體再生體系的建立及其生理生化研究［D］.上海：上海交通大學(xué)，2004.

（責任編輯韓明躍）

第1作者：唐軍榮（1982—），男，講師。研究方向：植物快繁和育種。Email：306740911＠qq.com。

Changes of Physiological and Biochemical Index of Calotropis gigantea in the Process of Tissue Culture and Rapid Propagation

Tang Junrong1，2，Zheng Yuan1，Liu Huimin1，Ma Huancheng1，Chen Shi1，Liu Zhongmei1
（1.Key Laboratory of State Forestry Administration for Biodiversity Conservation in Southwest China，Southwest Forestry University，Kunming Yunnan 650224，China；2.Key Laboratory for Forest Genetic and Tree Improvement＆Propagation in Universities of Yunnan Province，Southwest Forestry University，Kunming Yunnan 650224，China）

Abstract：Taking tissue culture seedling of Calotropis gigantea as the material，some physiological-biochemical index were studied during different growth periods in the process of tissue culture and rapid propagation，and it provided the basis for the regulation of the morphology of plant′s organs.The results were as follows：There were some relationships between the morphosis and the activity of SOD，POD，CAT and the content of soluble sugar and soluble protein in the stage of proliferation and rooting.During the proliferation stage，SOD activity was first increased and then decreased，and POD activity showed a declining tendency as a whole，and CAT activity showed an increasing tendency，and the content of soluble protein was firstly decreased and then increased，and the content of soluble sugar was increased.During the rooting stage，activity of SOD，POD and CAT showed a same tendency of “rise-fall-rise”，and the content of soluble protein was firstly increased，then decreased and finally increased slowly，and the content of soluble sugar was firstly increased slowly and then decreased slowly.

Key words：Calotropis gigantea；anti-oxidant enzyme activity；soluble protein；soluble sugar；tissue culture and rapid propagation

通信作者：劉惠民（1957—），男，教授。研究方向：經(jīng)濟林培育。Email：hmliu＠swfc.edu.cn。

基金項目：國家林業(yè)局林業(yè)公益性行業(yè)項目（201304810）資助；西南林業(yè)大學(xué)云南省省級重點學(xué)科（林學(xué)）資助；西南地區(qū)生物多樣性保育國家林業(yè)局重點實驗室開放基金資助。

收稿日期：2015-10-14

doi：10.11929/ j.issn.2095-1914.2016.03.009

中圖分類號：S723.1

文獻標志碼：A

文章編號：2095-1914（2016）03-0049-05