張釗華、遲紹明、盤振杰、李志文、李亞娟、胡天鳳、陳艷梅、趙 焱

云南師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院、云南 昆明 650500

熒光光譜法研究20(S)-原人參三醇與牛血清白蛋白的相互作用

張釗華、遲紹明、盤振杰、李志文、李亞娟、胡天鳳、陳艷梅、趙 焱*

云南師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院、云南 昆明 650500

用熒光光譜和紫外-可見吸收光譜研究了20(S)-原人參三醇(PPT)與牛血清白蛋白(BSA)的相互作用、結(jié)果表明：PPT對(duì)BSA熒光的猝滅類型為靜態(tài)猝滅。在溫度為298、308、318 K時(shí)的結(jié)合常數(shù)分別是0.926 3×103、0.618 2×103、0.414 4×103L·mol-1、結(jié)合位點(diǎn)均接近于1。PPT與BSA結(jié)合過程中主要的驅(qū)動(dòng)力為氫鍵和范德華力。與PPT結(jié)合后、BSA分子中色氨酸殘基部位的結(jié)構(gòu)變得更加緊密。依據(jù)F?ster的熒光共振能量轉(zhuǎn)移理論得出PPT與BSA的結(jié)合距離r為2.62 nm、能量轉(zhuǎn)移效率E為0.32。

20(S)-原人參三醇； 牛血清白蛋白； 熒光光譜法； 相互作用

引 言

20(S)-原人參三醇(PPT)是一種從三七、西洋參或人參等植物中分離出來人參皂苷元、為達(dá)瑪烷型四環(huán)三萜類天然產(chǎn)物[1]。研究表明、PPT在抗疲勞、抗氧化延緩衰老、調(diào)節(jié)血糖、改善心腦血管供血不足和調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)等方面均具有廣泛的生物活性[2]。尤其在抑制腫瘤方面、PPT具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化等抗腫瘤活性[3]。由于PPT顯著的抗腫瘤細(xì)胞活性、且毒副作用小、其作為一種前景看好的抗腫瘤候選藥物引起了國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注[2-3]。

血清白蛋白是生命體內(nèi)含量最豐富且最重要的蛋白質(zhì)之一、它主要用于貯藏及運(yùn)輸內(nèi)源代謝產(chǎn)物和外源藥物小分子[4]。研究有機(jī)小分子與蛋白質(zhì)相互作用的特征、有助于從分子水平了解它們之間的作用機(jī)理、這在促進(jìn)蛋白質(zhì)組學(xué)、藥理學(xué)以及毒理學(xué)的研究等方面有重要意義[5-6]。牛血清白蛋白(BSA)由于價(jià)廉且易得、所以常將其用于與藥物作用機(jī)制的研究。遺憾的是、目前尚未見PPT與BSA相互作用的研究報(bào)道。因此本文運(yùn)用熒光光譜法對(duì)PPT與BSA相互作用進(jìn)行研究、探究了它們之間的猝滅類型、結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)、作用力類型以及結(jié)合距離。這將有助于了解PPT的藥理作用、PPT和BSA間的結(jié)合方式以及PPT對(duì)BSA構(gòu)象的影響。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器及試劑

Hitachi F-4600熒光光譜儀、UV-1901紫外-可見光譜儀、DNP-9022型電熱恒溫箱、AL204分析天平、pHS-29A pH計(jì)。

2×10-4mol·L-1的PPT溶液(購買于中國(guó)科學(xué)院昆明植物所、純度>98%)； 1×10-4mol·L-1的BSA溶液(購買于Sigma試劑公司、分子量：68 000)； 9%的NaCl溶液； 0.05 mol·L-1pH(7.40±0.01)的Tris-HCl緩沖液； PPT與BSA摩爾比為1∶1、濃度cPPT=cBSA=2×10-5mol·L-1的混合溶液。

1.2 方法

在10 mL容量瓶中依次加入9%的NaCl溶液、Tris-HCl緩沖液各1 mL、BSA溶液2 mL以及一定量的PPT溶液、定容至刻度、定容后PPT濃度分別是0 、0.6×10-5、1.2×10-5、1.8×10-5、2.4×10-5、3.0×10-5mol·L-1。取3 mL上述溶液置于石英比色皿中、在激發(fā)波長(zhǎng)為280 nm、狹縫寬度均為5 nm、掃描速度為1 200 r·min-1的條件下、分別掃描T=298、308、318 K時(shí)、BSA在285～500 nm之間的熒光光譜。同時(shí)測(cè)定Δλ為15和60 nm時(shí)BSA的同步熒光光譜。另外、運(yùn)用紫外-可見光譜儀測(cè)定PPT與BSA摩爾比為1∶1的混合液在200～500 nm之間的吸光度值。

2 結(jié)果與討論

2.1 PPT與BSA的熒光猝滅光譜

因?yàn)锽SA分子中含有酪氨酸、色氨酸殘基、因而具有比較強(qiáng)的內(nèi)源熒光[7]。由圖1可看出、298 K、激發(fā)波長(zhǎng)280 nm時(shí)、在340 nm處出現(xiàn)了BSA的最強(qiáng)熒光發(fā)射峰。實(shí)驗(yàn)表明、在相同的實(shí)驗(yàn)溫度下、隨著PPT濃度的增大、BSA的熒光強(qiáng)度逐漸減弱、且最強(qiáng)熒光發(fā)射峰的峰位發(fā)生微小的藍(lán)移、但其峰型保持不變、這表明PPT與BSA之間發(fā)生了相互作用。

圖1 不同濃度PPT對(duì)BSA熒光強(qiáng)度的影響(298 K)

Fig.1 Emission spectra of BSA in the presence of various concentrations of PPT (cBSA=2.0×10-5mol·L-1,cPPT/10-5mol·L-1From 0 to 3.0: 0,0.6,1.2,1.8,2.4,3.0)

2.2 PPT與BSA的熒光猝滅類型

熒光猝滅類型一般分為靜態(tài)猝滅與動(dòng)態(tài)猝滅。動(dòng)態(tài)猝滅是指隨著溫度的升高、離子的有效碰撞次數(shù)增加、能量的轉(zhuǎn)移也隨之加劇、導(dǎo)致猝滅常數(shù)增大； 而靜態(tài)猝滅是隨著溫度的升高、降低了復(fù)合物的穩(wěn)定性、進(jìn)而導(dǎo)致猝滅常數(shù)減小。

假設(shè)PPT與BSA的相互作用是動(dòng)態(tài)猝滅過程、則滿足Stern-Volmer方程[8-10]：

(1)

F0與F分別表示加入猝滅劑前后BSA的熒光強(qiáng)度值、[Q]是猝滅劑PPT的濃度、KSV表示猝滅常數(shù)、Kq表示雙分子猝滅速率常數(shù)、τ0表示沒有猝滅劑存在時(shí)熒光分子的平均壽命。由式(1)可知、熒光強(qiáng)度之比F0/F與猝滅劑濃度[Q]之間為線性關(guān)系。以F0/F對(duì)[Q]作圖可得T=298、308、318 K時(shí)的Stern-Volmer圖、如圖2、曲線呈現(xiàn)良好線性關(guān)系、而直線斜率即猝滅常數(shù)KSV。該猝滅過程在不同溫度時(shí)的Kq和KSV見表1。

由表1可知、隨著溫度的升高猝滅常數(shù)KSV逐漸減小、且Kq均大于各種猝滅劑的最大動(dòng)態(tài)猝滅常數(shù)(2.0×1010L·mol-1·s-1)、結(jié)果說明PPT與BSA的猝滅過程為靜態(tài)猝滅過程。

2.3 PPT與BSA的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)

靜態(tài)猝滅過程的結(jié)合常數(shù)(Kb)與結(jié)合位點(diǎn)數(shù)(n)、可根據(jù)雙對(duì)數(shù)方程式(2)計(jì)算[11-12]

(2)

以lg[(F0-F)/F]對(duì)lg[Q]作圖、如圖3所示、根據(jù)直線的斜率與截距可相應(yīng)的求出結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n與結(jié)合常數(shù)Kb、具體數(shù)據(jù)見表2。

圖2 不同溫度下PPT對(duì)BSA猝滅的Stern-Volmer曲線

表1 不同溫度下PPT對(duì)BSA熒光猝滅的Stern-Volmer方程及猝滅常數(shù)

圖3 不同溫度下PPT對(duì)BSA雙對(duì)數(shù)曲線

Fig.3 Plot of lg[(F0-F)/F] against lg[Q] at different temperatures

由圖3及表2可得、PPT對(duì)BSA的雙對(duì)數(shù)方程呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系、并且結(jié)合常數(shù)Kb隨溫度的升高而減小、說明形成的復(fù)合物熱穩(wěn)定性不好、隨溫度的升高而發(fā)生解離。由表2可知結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n都接近于1、說明PPT與BSA形成了1∶1的復(fù)合物。

表2 不同溫度下PPT對(duì)BSA結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)

2.4 PPT與BSA的作用力類型

BSA與藥物小分子間的作用力主要包括氫鍵、靜電引力、范德華力及疏水作用力等。一般根據(jù)熱力學(xué)參數(shù)中的焓變(ΔH)和熵變(ΔS)可以判斷其作用力類型[13]、具體判斷依據(jù)如表3所示。

表3 作用力類型與熱力學(xué)參數(shù)關(guān)系

當(dāng)反應(yīng)溫度變化不大時(shí)、焓變(ΔH)可認(rèn)為是一常數(shù)。熱力學(xué)公式如下

(3)

由式(3)可知lnK與1/T是線性關(guān)系、以1/T為橫坐標(biāo)lnK為縱坐標(biāo)作圖、由斜率及截距求出ΔH及ΔS、如圖4所示。表4列出了PPT和BSA結(jié)合過程中的相關(guān)熱力學(xué)參數(shù)。結(jié)合表3和表4可知、PPT和BSA結(jié)合過程以氫鍵及范德華力為主要的驅(qū)動(dòng)力。

圖4 不同溫度下lnK對(duì)1/T曲線

2.5 PPT對(duì)BSA構(gòu)象的影響

在BSA的結(jié)構(gòu)中、色氨酸及酪氨酸殘基能夠產(chǎn)生一定熒光、因此可利用同步熒光光譜法研究PPT對(duì)BSA構(gòu)象產(chǎn)生的影響。根據(jù)Miller等提出理論、當(dāng)激發(fā)波長(zhǎng)與發(fā)射波長(zhǎng)的間距Δλ=15 nm時(shí)、同步熒光表現(xiàn)出的是酪氨酸殘基的光譜特征、而Δλ=60 nm時(shí)展現(xiàn)的是色氨酸殘基的光譜特征。如圖5所示、當(dāng)A→F逐漸增加PPT濃度時(shí)無論是酪氨酸還是色氨酸殘基的同步熒光強(qiáng)度、均隨PPT濃度的增加而降低。同時(shí)由圖5(a)可知、Δλ=15 nm時(shí)、酪氨酸光譜的最大發(fā)射峰波長(zhǎng)未見發(fā)生位移、說明PPT對(duì)BSA酪氨酸部位的結(jié)構(gòu)無影響。而由圖5(b)可知、Δλ=60 nm時(shí)、色氨酸光譜的最大發(fā)射峰波發(fā)生了明顯的藍(lán)移、說明PPT的加入、使BSA分子中色氨酸殘基部位的結(jié)構(gòu)變得更加緊密。

表4 不同溫度下PPT與BSA結(jié)合過程的熱力學(xué)參數(shù)

圖5 同步熒光光譜(a)：Δλ=15 nm,(b)：Δλ=60 nm (T=298 K,cBSA=2.0×10-5mol·L-1,cPPT/10-5mol·L-1,A→F: 0,0.6,1.2,1.8,2.4,3.0)

Fig.5 Synchronous fluorescence spectra of BSA (a) Δλ=15 nm,(b)：Δλ=60 nm (T=298 K,cBSA=2.0×10-5mol·L-1,cPPT/10-5mol·L-1、A→F: 0,0.6,1.2,1.8,2.4,3.0)

2.6 PPT與BSA的結(jié)合距離

藥物小分子與BSA相互作用的結(jié)合距離可根據(jù)F?ster 1948年提出的熒光共振能量轉(zhuǎn)移理論計(jì)算得到[15-16]、該理論的能量轉(zhuǎn)移效率滿足式(4)

(4)

(5)

式(5)中F(λ)是受體在波長(zhǎng)等于λ時(shí)的熒光強(qiáng)度、ε(λ)是受體在波長(zhǎng)等于λ時(shí)的摩爾吸光系數(shù)。繪制PPT與BSA摩爾比為1∶1時(shí)的熒光光譜與吸收光譜的重疊光譜圖、如圖6所示。

通過計(jì)算可得J=5.61×10-15cm3·L·mol-1、E=0.32、R0=2.31 nm、r=2.62 nm。PPT與BSA的結(jié)合距離r<7 nm、表明偶極-偶極非輻射能量轉(zhuǎn)移是引起B(yǎng)SA發(fā)生熒光猝滅的另外一個(gè)原因。

圖6 吸收光譜和熒光光譜的重疊圖(T=298 K、cBSA=cPPT=2.0×105mol·L-1

Fig.6 The overlap of BSA fluorescence and PPT absorbance spectra (T=298 K、cBSA=cPPT=2.0×10-5mol·L-1)

[1] TANG Wei-zhuo,ZHAO Yu-qing(唐偉卓、趙余慶). Ginseng Research(人參研究),2010,22(3): 20.

[2] DOU De-qiang,JIN Ling,CHEN Ying-jie(竇德強(qiáng)、靳 玲、陳英杰). Journal of Shenyang Pharmaceutical University(沈陽藥科大學(xué)學(xué)報(bào)),1999,16(2): 151.

[3] DENG Jing,JIANG Yong-xin(鄧 晶、蔣永新). Modern Oncolog(現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)),2009,17(11): 2234.

[4] LIU Jian-bo,ZHANG Jun-cai,WANG Xiao-ling,et al(劉建波、張君才、王曉玲、等). Chinese Journal of Spectroscopy Laboratory(光譜實(shí)驗(yàn)室),2013,30(3): 1157.

[5] YAN Cheng-nong,LIU Jing,LIU Yi(顏承農(nóng)、劉 晶、劉 義). Journal of Yangtze University (Nat. Sci. Edit)(長(zhǎng)江大學(xué)學(xué)報(bào)·自然科學(xué)版),2010,7(3): 41.

[6] YAN Cheng-nong,TONG Jin-qiang,XIONG Dan,et al(顏承農(nóng)、童金強(qiáng)、熊 丹、等). Chinese J. Anal. Chem.(分析化學(xué)),2006,34(6): 796.

[7] XIE Xian-chuan,WANG Xiao-rong,ZHANG You-kuan,et al(謝顯傳、王曉蓉、張幼寬、等). Chinese J. Anal. Chem.(分析化學(xué)),2010,10(10): 1479.

[8] LIN Hai-bin,ZHENG Lin,LIN Yu-qin,et al(林海彬、鄭 琳、林玉琴、等). Chem. J. Chinese Universities(高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報(bào)),2013,34: 1818.

[9] CHEN Ning-sheng,FANG Rui-ping,ZHANG Ying,et al(陳寧生、方瑞萍、張 穎、等). Chinese Journal of Spectroscopy Laboratory(光譜實(shí)驗(yàn)室),2013,30(1): 367.

[10] WU Chun-hui,YE Hong-de,WU De-hong,et al(吳春惠、葉紅德、吳德洪、等). Spectroscopy and Spectral Analysis(光譜學(xué)與光譜分析),2013,33(1) : 120.

[11] FU Cai-xia,RONG Xian-guo,LI Feng(付彩霞、榮先國(guó)、李 鳳). Chinese Journal of Spectroscopy Laboratory(光譜實(shí)驗(yàn)室),2013,30(4): 1610.

[12] YAO Xiao-jing,ZHAO Wei,KAN Hong,et al. Chinese Journal of Biochemistry and Molecular Biology,2012,28(7): 666.

[13] NI Yong-nian,LIU Qiu-hong(倪永年、劉秋紅). Journal of Nanchang University(Natural Science)(南昌大學(xué)學(xué)報(bào)·理科版),2009,33(3): 244.

[14] WU Xin,ZHAO Jin-zhong,ZHANG Jian-gang,et al(武 鑫、趙晉忠、張建剛、等). Chinese Journal of Analysis Laboratory(分析試驗(yàn)室),2013,32(4): 20.

*Corresponding author

Fluorescence Spectroscopic Studies on Binding of 20(S)-Protopanaxatriol with Bovine Serum Albumin

ZHANG Zhao-hua,CHI Shao-ming,PAN Zhen-jie,LI Zhi-wen,LI Ya-juan,HU Tian-feng,CHEN Yan-mei,ZHAO Yan*

College of Chemistry and Chemical Engineering,Yunnan Normal University,Kunming 650500,China

The interaction between 20(S)-protopanaxatriol (PPT) and bovine serum albumin ( BSA) was studied with fluorescence quenching technique and ultra-violet absorption spectroscopy. The results indicated that PPT led to the intrinsic fluorescence quenching of BSA through a static quenching process .The binding constants of PPT with BSA obtained with fluorescence quenching method were calculated as 0.926 3×103(298 K),0.618 2×103(308 K),0.414 4×103L·mol-1(318 K),respectively; while the number binding sitesnwere close to unity. The results showed that the driving force of the interaction between PPT and BSA was hydrogen bond and Van der Waals force. The result of synchronous fluorescence spectra showed that binding of PPT with BSA could induce conformational changes in BSA,that the part of tryptophan became more closely. According to F?ster fluorescence resonance energy transfer theory,the binding distancerand energy-transfer efficiencyEwere respectively 26.2 nm and 0.32.

20(S)-Protopanaxatriol； Bovine serum albumin； Fluorescence spectroscopic; Interaction

Nov. 12,2015; accepted Mar. 5,2016)

2015-11-12、

2016-03-05

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(21062030、21362046)資助

張釗華、女、1988年生、云南師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院碩士研究生 e-mail: ZZH6210@163.com *通訊聯(lián)系人 e-mail: zhaooyann@163.com

R446

A

10.3964/j.issn.1000-0593(2016)12-3991-05