李雨萌，洪　盼，蘭海楠，吳天成，鄭　鑫

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科技學(xué)院，吉林 長春 130118)

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生長激素受體激活劑的制備及鑒定

李雨萌，洪盼，蘭海楠，吳天成，鄭鑫

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科技學(xué)院，吉林 長春 130118)

[摘要]【目的】 制備生長激素受體的單克隆抗體，探討其對生長激素受體的激活作用，為研究生長激素模擬物提供新思路?！痉椒ā?以生長激素受體胞外域(GHBP)免疫BALB/c鼠，通過雜交瘤技術(shù)制備抗生長激素受體的單克隆抗體，用流式技術(shù)篩選抗體，通過流式、激光共聚焦顯微鏡觀察研究該單克隆抗體對生長激素受體的激活作用，然后通過Western-blot等技術(shù)手段研究其胞內(nèi)的信號通路?！窘Y(jié)果】 通過雜交瘤技術(shù)共獲得了30個分泌抗生長激素受體的單克隆抗體，經(jīng)流式分析篩選到具有受體激動劑活性的單克隆抗體(命名為L8)。競爭性結(jié)合分析結(jié)果表明，L8在受體上的結(jié)合表位與生長激素重疊；激光共聚焦觀察結(jié)果表明，L8不但能結(jié)合到細(xì)胞表面的生長激素受體，而且還能內(nèi)化進入胞體。經(jīng)Western-blot和流式分析表明，L8能與轉(zhuǎn)染GHR基因的CHO-GHR638細(xì)胞表面的生長激素受體結(jié)合，并啟動JAK2-STAT5、ERK1/2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，且呈現(xiàn)出劑量依賴性?！窘Y(jié)論】 生長激素受體抗體可以作為受體的激動劑，其可能是通過誘導(dǎo)受體構(gòu)象變化的方式激活受體，并啟動JAK2-STAT5等信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。

[關(guān)鍵詞]生長激素；抗生長激素受體抗體；信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路

生長激素(Growth hormone,GH)是由垂體分泌的多肽，經(jīng)循環(huán)系統(tǒng)運送至靶器官上發(fā)揮相應(yīng)的生物效應(yīng)，由191個氨基酸組成，分子質(zhì)量為22 ku[1-2]。研究表明，GH對動物的生長發(fā)育有著極其重要的作用，同時在免疫、生殖、代謝等方面亦有許多重要生理功能，是動物機體最重要的內(nèi)分泌激素之一[3-4]。

GH生理作用的發(fā)揮主要通過生長激素受體(Growth hormone receptor，GHR)介導(dǎo)。GHR屬于典型的Ⅰ類生長因子受體，由620個氨基酸組成，包括胞外域、跨膜域和胞內(nèi)域[5]。GH與相應(yīng)靶細(xì)胞的GHR相結(jié)合發(fā)揮其生理作用，產(chǎn)生相應(yīng)的生長因子和免疫調(diào)節(jié)因子，如胰島素樣生長因子(insulin-like growth factors-1，IGF1)、白介素-6(interleukin-6，IL6)、白介素-2(interleukin-2，IL2)等，胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑主要包括janus激酶(janus kianse，JAK)-信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子(Signal transducers and activators of transcription，STAT)、JAK-絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)和JAK-細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular signal-regulated kinases 1 and 2，ERK1/2)途徑，GHR介導(dǎo)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)開啟靶基因通過旁分泌和自分泌的方式發(fā)揮相應(yīng)的生理作用[5-6]。Cunningham等[7]首次利用晶體試驗證實，一分子GH與兩分子的GHR相結(jié)合產(chǎn)生二聚體而激活GHR，其結(jié)合位點一個為高親和性的位點(site1)，一個為低親和性的位點(site2)。 Herrington等[8]研究表明，GH高親和性位點先與GHR結(jié)合，導(dǎo)致GH發(fā)生翻轉(zhuǎn)，再與低親和性位點相結(jié)合形成二聚體，進而啟動信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。然而近年來研究表明，僅形成二聚體不足以啟動信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，GH與GHR結(jié)合后須經(jīng)過GHR的旋轉(zhuǎn)才能啟動信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[9]。

隨著人們對動物產(chǎn)品安全性要求的逐步提高，動物生產(chǎn)中過量使用激素造成的殘留問題引起社會廣泛關(guān)注。外源性的生長激素是被禁止在動物生產(chǎn)中使用的，但GH在動物生長發(fā)育過程中具有重要作用，所以研究開發(fā)可替代GH的生物制劑尤為重要。本課題組多年來一直致力于GH可替代物的研究，從多個角度研究和開發(fā)了GHR激活劑，如使用肽類物質(zhì)[10]和抗獨特型抗體等[11]，都取得了一定的效果。在筆者嘗試使用新的方法制備GHR激活劑的過程中，通過查閱文獻發(fā)現(xiàn)，1991年科學(xué)雜志(Science)首先報道了生長激素與其受體的晶體結(jié)構(gòu)(GH-GHR)，晶體結(jié)構(gòu)表面一分子GH與兩分子GHR結(jié)合，當(dāng)時科學(xué)家認(rèn)為GHR的激活機制是二聚化(即1個GH分子將2個GHR分子招募到一起，形成二聚化的受體GH-(GHR)2)。Fuh等[12]研究發(fā)現(xiàn)，部分抗GHR抗體能夠使表達(dá)有GHR的細(xì)胞增殖，但若將抗GHR抗體降解為單價的Fab后，其則失去了促進細(xì)胞增殖的功能，這再次驗證了GHR的激活是通過二聚化完成的。此外，Rowlinson等[13]通過制備一系列的抗GHR抗體，發(fā)現(xiàn)部分抗體能夠促進有GHR表達(dá)的細(xì)胞增殖。Wan等[14]對一個激活性抗GHR單克隆抗體進行表位作圖發(fā)現(xiàn)，抗GHR的抗體誘導(dǎo)受體產(chǎn)生相應(yīng)的構(gòu)象變化。這一系列研究似乎表明抗GHR抗體能夠激活GHR，為此推測抗GHR抗體也能夠作為GH的模擬物，但目前國內(nèi)尚未見相關(guān)的研究報道。為此，本試驗采用雜交瘤技術(shù)制備抗GHR單克隆抗體，并就其對GHR的激活作用進行了研究，旨在為GH替代物的開發(fā)提供新的思路。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1試驗動物6周齡BALB/c雌性小鼠，共6只，平均體質(zhì)量22 g/只，購自吉林大學(xué)動物實驗中心。

1.1.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染大鼠全長GHR基因的中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO)，由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)細(xì)胞生物學(xué)實驗室制備，命名為CHO-GHR638細(xì)胞。小鼠骨髓瘤細(xì)胞(SP2/0)由華程生物公司提供。

1.1.3主要試劑與儀器HAT選擇性培養(yǎng)基、HT選擇性培養(yǎng)基、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記羊抗兔及抗鼠IgG、四甲基異硫氰酸(FITC)、羅丹明(TRITC)、ImmunPureIgG1Fab&F(ab′)2、4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)、鑰孔血藍(lán)蛋白(KLH)、ImmunPureIgG1Fab&F(ab′)2抽提試劑盒，購自Sigma公司；RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清，購自GIBCO公司；小鼠單抗Ig亞類檢測試劑盒、非免疫鼠IgG (對照用)購自華程生物公司；磷酸化與非磷酸化酪氨酸激酶(JAK2、STAT5、ERK1/2)抗體，購自CST公司。激光共聚焦顯微鏡LV1000型，日本奧林巴斯公司產(chǎn)品；流式細(xì)胞儀，美國BD公司產(chǎn)品；大鼠生長激素受體胞外域(GHBP)，由華程生物公司提供。

1.2方法

1.2.1熒光標(biāo)記生長激素標(biāo)記抗GHR單克隆抗體 (L8)、非免疫對照抗體標(biāo)記FITC的制備方法參照文獻[15]，為保證標(biāo)記的熒光分子不影響被標(biāo)記物的生理活性，本研究選擇熒光分子與所標(biāo)記蛋白之間的分子比例為2∶1。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)用含體積分?jǐn)?shù)10%滅活胎牛血清、青霉素100 IU/mL、鏈霉素100 IU/mL的RPMI-1640 培養(yǎng)基培養(yǎng)CHO-GHR638細(xì)胞，培養(yǎng)條件37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2。

1.2.3抗GHR單克隆抗體的制備選取6周齡雌性BALB/c鼠6只，首免以100 μg GHBP與等體積弗氏完全佐劑乳化后免疫BALB/c鼠(免疫劑量為50 μg/只)，并以14 d為間隔進行加強免疫，劑量與首免相同(不同的是與弗氏不完全佐劑乳化)，每次加強免疫后3 d采尾靜脈血測效價，直至效價達(dá)到1∶20 000以上時，取鼠脾臟細(xì)胞與SP2/0融合，融合過程參照文獻[16]的方法。將融合后的細(xì)胞分散于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，經(jīng)含有HAT的培養(yǎng)基篩選培養(yǎng)10 d后，利用間接ELISA篩選陽性克隆，將陽性克隆轉(zhuǎn)移到20孔培養(yǎng)板，擴大培養(yǎng)。

為篩選到能與GHR特異性結(jié)合的單克隆抗體，以表達(dá)GHR638的CHO細(xì)胞為模型對上述ELISA檢測陽性孔進行進一步篩選。取ELISA檢測陽性孔上清液500 μL與CHO-GHR638(細(xì)胞密度為1×104mL-1)4 ℃孵育30 min，以ELISA檢測陰性孔同樣處理作對照，PBS洗滌細(xì)胞3次，洗滌后1 000 r/min離心10 min沉淀細(xì)胞并加入FITC標(biāo)記羊抗鼠IgG抗體(二抗)(1∶200稀釋)，37 ℃避光孵育30 min。然后用PBS洗滌細(xì)胞，進行流式細(xì)胞儀檢測，通過CellQuest軟件分析流式數(shù)據(jù)，擴大培養(yǎng)經(jīng)3次流式檢測均為陽性的雜交瘤細(xì)胞，通過小鼠體內(nèi)誘生腹水的方法制備腹水，采用辛酸-飽和硫酸銨法純化腹水，純化后的抗體(IgG)保存?zhèn)溆谩?/p>

單克隆抗體的F(ab′)2部分制備參照ImmunPureIgG1Fab&F(ab′)2抽提試劑盒說明書進行。亞類分析采用鼠單抗Ig亞類檢測試劑盒說明書鑒定。

1.2.4競爭性結(jié)合受體分析以PBS洗滌新消化的CHO-GHR638細(xì)胞，用無血清RPMI-1640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為1×104mL-1，37 ℃平衡30 min。將定量的FITC-GH(60 ng/mL)分別與2，4，6，8，10，12，14，16，18，20 ng/mL的未標(biāo)記GH或純化的抗GHR抗體混合，并與CHO-GHR638細(xì)胞4 ℃共孵育60 min，PBS洗滌2次后，將各組細(xì)胞分別用500 μL PBS重懸，并移入流式管，進行流式分析。

1.2.5抗GHR單克隆抗體的激光共聚焦顯微鏡觀察用PBS洗滌新分離的CHO-GHR638細(xì)胞后，用無血清RPMI-1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，37 ℃平衡30 min，將500 μL(50 ng/mL)的FITC-L8加入1 mL細(xì)胞懸液中，37 ℃孵育30 min。PBS洗滌2次后，1 000 r/min離心5 min沉淀細(xì)胞，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛室溫固定10 min(避光)，PBS洗滌2次后，以體積分?jǐn)?shù)50%甘油重懸細(xì)胞并進行激光共聚焦顯微鏡觀察。以FITC標(biāo)記非免疫鼠IgG作對照。

1.2.6信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的Western-blot分析將新消化的CHO-GHR638細(xì)胞洗滌2次后，37 ℃平衡30 min，然后加入1 000 ng/mL的L8或GH刺激細(xì)胞，37 ℃孵育15 min，用細(xì)胞裂解液溶解細(xì)胞20 min，煮沸10 min，14 000 r/min離心30 min，取上清測定蛋白濃度。取40 μg蛋白點樣在SDS-PAGE(分離膠為12%，濃縮膠為4%)，蛋白經(jīng)電泳分離后，轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上(130 mA，4 ℃ 轉(zhuǎn)膜3 h)。TBST洗滌3次后，質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%脫脂奶粉封閉1 h，然后將膜放入1∶1 000稀釋的一抗(Anti-JAK2、Anti-pJAK2、Anti-STAT5、Anti-pstat5、ERK1/2、Anti-pERK1/2)中孵育，TBST洗滌3次后，加入HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體(1∶3 000稀釋)孵育1 h，TBST洗滌3次，DAB法顯色。以同樣處理的L8的Fab段(Fab的制備方法見材料部分)和非免疫鼠IgG抗體作為對照。

1.2.7JAK2、STAT5及ERK1/2的激活動力學(xué)流式分析將新消化的CHO-GHR638細(xì)胞用PBS洗滌2次后，調(diào)整細(xì)胞密度為1×104mL-1，1 mL/管，37 ℃平衡30 min，分別與L8(0，10，50，100，500 ng)孵育15 min后，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%多聚甲醛室溫固定10 min，Trion X-100透化細(xì)胞10 min，PBS洗滌細(xì)胞2次，1 000 r/min離心5 min、沉淀并分別加入100 μL抗磷酸化JAK2、STAT5及ERK1/2抗體(1∶100稀釋)孵育60 min， PBS洗滌3次后，加入FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體(1∶200稀釋)室溫避光孵育60 min，孵育后洗滌離心細(xì)胞并重懸于PBS中進行流式分析。

2結(jié)果與分析

2.1抗GHR單克隆抗體的篩選和鑒定

通過間接ELISA檢測融合孔的上清液，共檢測出分泌生長激素受體的單克隆抗體陽性孔30個。但這30個陽性孔中可能只有部分單克隆抗體能與活細(xì)胞表面的生長激素受體結(jié)合，因為本試驗免疫使用的是GHR胞外域而非全長GHR，因此本試驗進一步對這30個陽性克隆進行流式篩選，結(jié)果其中有13個表現(xiàn)出陽性信號，因為它們能結(jié)合到活細(xì)胞表面，這表明它們有可能與細(xì)胞表面的生長激素受體結(jié)合，與對照抗體相比，L8與細(xì)胞表面的GHR結(jié)合能力較強，因此本研究選擇流式檢測陽性信號最強的L8進行進一步分析，經(jīng)鑒定L8為IgG2a亞類(圖1)。

2.2L8與GHR的競爭性結(jié)合作用

競爭性結(jié)合分析結(jié)果表明：未標(biāo)記的生長激素與L8均以劑量依賴性競爭的方式結(jié)合CHO細(xì)胞表面GHR，而對照抗體未能表現(xiàn)出這種作用(圖2)，這表明L8與GHR上的結(jié)合表位重疊。

圖 1　抗GHR單克隆抗體L8的流式篩選結(jié)果

圖 2　L8與GHR的競爭性結(jié)合

2.3L8結(jié)合GHR的激光共聚焦顯微鏡觀察

激光共聚焦觀察結(jié)果表明，L8不但能結(jié)合到細(xì)胞表面GHR，而且還可內(nèi)化進入胞體，而對照抗體沒有表現(xiàn)出任何效果(圖3)。

圖 3　L8特異性地結(jié)合到CHO-GHR638細(xì)胞GHR的激光共聚焦顯微鏡觀察(×800)

L8屬于IgG類分子，這類免疫球蛋白具有2個抗原結(jié)合位點，因此能同時結(jié)合2個GHR，進而啟動信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。本試驗使用經(jīng)典的Western-blot方法來分析L8對磷酸化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白JAK2、STAT5和ERK1/2 (這3個信號分子為生長激素啟動胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的最重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白[17-18])的影響，結(jié)果表明，GH與L8均能激活磷酸化JAK2、STAT5和ERK1/2，而非免疫鼠IgG抗體未能表現(xiàn)出任何作用(圖4)。

圖 4　L8作用機制的Western-blot分析

本試驗采用流式分析JAK2、STAT5、ERK1/2的動力學(xué)，結(jié)果表明，L8均以劑量依賴性的方式磷酸化JAK2(圖5)、STAT5(圖6)和ERK1/2(圖7)信號蛋白。而且流式分析信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白磷酸化的技術(shù)比Western-blot更敏感，尤其是在低濃度和高濃度L8的刺激下表現(xiàn)更明顯，這與文獻[19-20]報道結(jié)果一致。

圖 5　不同劑量L8對CHO-GHR638細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白JAK2磷酸化的影響

圖 6　不同劑量L8對CHO-GHR638細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白STAT5磷酸化的影響

圖 7　不同劑量L8對CHO-GHR638細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白ERK1/2磷酸化的影響

3討論

GH屬于非對稱性分子，沒有對稱中心。然而，本研究制備的抗GHR單克隆抗體L8屬于對稱性IgG類免疫球蛋白，這類免疫球蛋白具有兩個親和性相同的抗原結(jié)合部位(Fab)，L8不但能特異性地結(jié)合CHO-GHR638細(xì)胞上受體，而且還能夠激活胞內(nèi)信號通路，這表明對稱的L8也可以作為生長激素受體激活劑，因為它激活了胞內(nèi)信號通路蛋白JAK2、STAT5、ERK1/2。

已有文獻報道，生長激素以二聚化的方式激活生長激素受體，進而開啟胞內(nèi)信號通路[12]。在本研究中，雙價的L8能夠激活JAK2、STAT5、ERK1/2等，而單價L8 Fab部分雖然能夠結(jié)合生長激素受體，但卻不能激活胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，這說明L8是通過二聚化方式使受體激活的。但是，最近Brooks等[21]研究表明，在沒有配體的情況下，生長激素受體本身以二聚體形式存在，而生長激素受體的激活是通過有GH誘導(dǎo)的受體的構(gòu)象變化而發(fā)生的。因此，筆者推測，L8很可能也是通過誘導(dǎo)受體發(fā)生構(gòu)象變化進而激活生長激素受體的，并且已有文獻報道，生長激素受體的單克隆抗體能夠誘導(dǎo)生長激素受體產(chǎn)生構(gòu)象變化，并且這個構(gòu)象變化與生長激素作用于生長激素受體引起的構(gòu)象變化相似[11]。

以往的研究表明，如果以Ⅰ類生長因子受體抗體作為激動劑，則該抗體與受體的結(jié)合位點非常重要，本研究發(fā)現(xiàn)，L8能夠與生長激素競爭性地結(jié)合生長激素受體，這表明L8的結(jié)合表位與生長激素的結(jié)合表位相近或者部分甚至全部重合。

很多研究者一直在追尋能夠模擬天然配體的物質(zhì)，最初研究人員專注于使用肽類物質(zhì)。Cwirla等[22]利用噬菌體篩選了血細(xì)胞生成素受體(EPOR)，分離到能夠與EPOR結(jié)合的肽，但發(fā)現(xiàn)肽與其他同類受體會發(fā)生交叉反應(yīng)，未能達(dá)到理想的效果。之后科學(xué)工作者開始嘗試使用抗體類物質(zhì)，其中抗獨特型抗體有著廣泛的報道[11，23-24]，但是使用生長激素受體抗體類的物質(zhì)尚未見報道。本研究制備了抗生長激素受體抗體L8，并且這個單克隆抗體表現(xiàn)出生長激素樣的活性，這為進一步探索生長激素類似物提供了新的方向。

[參考文獻]

[1]高雪，許尚忠，張英漢.生長激素作用機理的研究進展 [J].黃牛雜志，2003,29(1):50-53.

Gao X,Xu S Z,Zhang Y H.Advance in action mechanism of growth hormone [J].Journal of Yellow Cattle Science,2003,29(1):50-53.(in Chinese)

[2]馬曉，胡毅，熊鋼，等.生長激素受體及其基因研究進展 [J].湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2010,36(1):58-62.

Ma X,Hu Y,Xiong G,et al.Overview of growth hormone receptor gene and growth hormone receptor [J].Journal of Hunan Agricultural University:Natural Sciences,2010,36(1):58-62.(in Chinese)

[3]孫遜，朱尚權(quán).生長激素的結(jié)構(gòu)與功能 [J].國外醫(yī)學(xué)：生理病理科學(xué)與臨床分冊，1999,19(1):6-9.

Sun X,Zhu S Q.The structure and function of the growth hormone [J].Foreign Medical Sciences:Section of Pathophysiology and Clinical Medicine,1999,19(1):6-9.(in Chinese)

[4]鄭茂恩，王可洲，金東慶，等.生長激素在腫瘤治療方面的研究進展 [J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2013,21(4):883-886.

Zheng M E,Wang K Z,Jin D Q,et al.Research progresses of growth hormone and tumor [J].Journal of Modern Oncology,2013,21(4):883-886.(in Chinese)

[5]楊艷紅，付志玲，蘭海楠，等. 生長激素激活受體機理的研究進展 [J].中國畜牧獸醫(yī)，2013,40(10):148-151.

Yang Y H,Fu Z L,Lan H N,et al.Research progress on the mechanism of growth hormone-activated receptor [J].China Animal Husbandry &Veterinary Medicine,2013,40(10):148-151.(in Chinese)

[6]張明哲，葉丹，張志和，等.生長激素受體及其介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo) [J].細(xì)胞生物學(xué)雜志，2005,27(1):49-52.

Zhang M Z,Ye D,Zhang Z H,et al.Growth hormone receptor and signal transduction [J].Chinese Journal of Cell Biology,2005,27(1):49-52.(in Chinese)

[7]Cunningham B C,Ultsch M,De Vos A M,et al.Dimerization of the extracellular domain of the human growth hormone receptor by a single hormone molecule [J].Science,1991,254(5033):821-825.

[8]Herrington J,Carter-Su C.Signaling pathways activated by the growth hormone receptor [J].Trends in Endocrinology & Metabolism,2001,12(6):252-257.

[9]Brooks A J,Waters M J.The growth hormone receptor:Mechanism of activation and clinical implications [J].Nature Reviews Endocrinology,2010,6(9):515-525.

[10]鄭鑫，蘭海楠，劉景圣，等.一種模擬豬生長激素樣的活性肽及制備方法與應(yīng)用，中國：ZL201110442548.8 [P].2013-11-06.

Zheng X,Lan H N,Liu J S,et al.Preparation method and application of porcine growth hormone-like peptides analog,China:ZL201110442548.8 [P].2013-11-06.(in Chinese)

[11]蘭海楠，李維，鄭鑫.豬生長激素抗獨特型抗體的制備及生物活性檢測 [J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2012,40(11):7-12.

Lan H N,Li W,Zheng X.Preparation of porcine growth hormone anti-idiotypic antibody and detection of its biological activity [J].Journal of Northwest A&F University:Natural Science Edition,2012,40(11):7-12.(in Chinese)

[12]Fuh G,Cunningham B C,Fukunaga R,et al.Rational design of potent antagonists to the human growth hormone receptor [J].Science,1992,256(5064):1677-1680.

[13]Rowlinson S W,Yoshizato H,Barclay J L,et al.An agonist-induced conformational change in the growth hormone receptor determines the choice of signalling pathway [J].Nature Cell Biology,2008,10(6):740-747.

[14]Wan Y,Zheng Y Z,Harris J M,et al.Epitope map for a grow-th hormone receptor agonist monoclonal antibody,MAb 263 [J].Molecular Endocrinology,2003,17(11):2240-2250.

[15]Rapaport R,Sills I N,Green L,et al.Detection of human gro-wth hormone receptors on IM-9 cells and peripheral blood mononuclear cell subsets by flow cytometry:Correlation with growth hormone-binding protein levels [J].The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism,1995,80(9):2612-2619.

[16]鄭鑫，朱世成，李家奎，等.豬生長激素單克隆抗體的制備及其特性 [J].中國獸醫(yī)學(xué)報，2005,25(3):293-294.

Zheng X,Zhu S C,Li J K,et al.Preparation and characterization of monoclonal antibody for porcine growth hormone [J].Chinese Journal of Veterinary,2005,25(3):293-294.(in Chinese)

[17]Waters M J,Brooks A J.Growth hormone and cell growth [J].Endocr Dev,2012(23):86-95.

[18]王鷹，李蘇宜.生長激素受體及其生物學(xué)效應(yīng)的研究進展 [J].腸外與腸內(nèi)營養(yǎng)，2007,14(3):183-187.

Wang Y,Li S Y.Research progresses in growth hormone receptor tumor biology effects [J].Parenteral & Enteral Nutrition,2007,14(3):183-187.(in Chinese)

[19]Candotti F,Notarangelo L,Visconti R,et al.Molecular aspects of primary immunodeficiencies:Lessons from cytokine and other signaling pathways [J].The Journal of Clinical Investigation,2002,109(10):1261-1269.

[20]Fleisher T A,Dorman S E,Anderson J A,et al.Detection of intracellular phosphorylated STAT-1 by flow cytometry [J].Clinical Immunology,1999,90(3):425-430.

[21]Brooks A J,Dai W,O’Mara M L,et al.Mechanism of activation of protein kinase JAK2 by the growth hormone receptor [J].Science,2014,344(6185):1249783.

[22]Cwirla S E,Balasubramanian P,Duffin D J,et al.Peptide agonist of the thrombopoietin receptor as potent as the natural cytokine [J].Science,1997,276(5319):1696-1699.

[23]Wang B S,Zhang R J,Bona C A,et al.Promotion of animal growth with a monoclonal anti-idiotype specific to anti-porcine growth hormone antibody [J].Molecular Immunology,1994,31(9):651-656.

[24]Gardner M J,Morrison C A,Stevenson L Q,et al.Production of anti-idiotypic antisera to rat GH antibodies capable of binding to GH receptors and increasing body weight gain in hypophysectomized rats [J].Journal of Endocrinology,1990,125(1):53-59.

Preparation and identification of growth hormone receptor agonist

LI Yu-meng,HONG Pan,LAN Hai-nan,WU Tian-cheng,ZHENG Xin

(CollegeofAnimalScience,JilinAgriculturalUniversity,Changchun,Jilin130118,China)

Abstract:【Objective】 This study prepared monoclonal antibody of growth hormone receptor and investigated its effect on activation of growth hormone receptor to provide new ideas for studying growth hormone analog.【Method】 The monoclonal growth hormone receptor antibody to GH was prepared through hybridoma technology using immunized BALB/c mice with extracellular domain (GHBP).Then,monoclonal antibody was screened by flow cytometry.Its effect on activation of growth hormone receptor was also explored by flow cytometry and laser confocal microscope technology and the intracellular signaling pathways were explored by Western-blot.【Result】 A total of 30 monoclonal antibodies secreting anti-growth hormone receptor were obtained by hybridoma technique,and monoclonal antibody with receptor agonist activity (named as L8) was screened by flow cytometry.Competitive binding analysis showed that L8 and growth hormone overlapped on epitope of receptor.Laser confocal microscope observation showed that L8 can not only combine to growth hormone receptor on cell surface,but also internalize into cell body.L8 can bind to growth hormone receptor on the surface of CHO-GHR638 which transfected GHR gene and trigger JAK2-STAT5 and ERK1/2 signal transduction pathway with dose-dependence.【Conclusion】 Antibodies of growth hormone receptor can be used as receptor agonist.It may activate receptor by inducing conformational changes of the receptor and triggering JAK2-STAT5 signal transduction pathway.

Key words:growth hormone;anti-growth hormone receptor antibody;signal transduction pathway

DOI：網(wǎng)絡(luò)出版時間:2016-04-0709:0010.13207/j.cnki.jnwafu.2016.05.003

[收稿日期]2014-09-19

[基金項目]吉林省教育廳應(yīng)用基礎(chǔ)項目“豬生長激素模擬肽與生長激素受體結(jié)合特異性的研究”(吉教科合字[2012]第39號)；“十二五”農(nóng)村領(lǐng)域國家科技計劃項目(2013BAD10B00)

[作者簡介]李雨萌(1990-)，女，吉林大安人，在讀碩士，主要從事細(xì)胞生物學(xué)研究。E-mail：13843139909@163.comE-mail：zhengxin_3@yahoo.com

[通信作者]鄭鑫(1965-)，女，吉林長春人，教授，博士，博士生導(dǎo)師，主要從事動物營養(yǎng)免疫與調(diào)控研究。

[中圖分類號]Q575+.11

[文獻標(biāo)志碼]A

[文章編號]1671-9387(2016)05-0013-07

網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20160407.0900.006.html