韓書(shū)芝，梁會(huì)朋，張鳳蕊，平芬

（1.河北省人民醫(yī)院呼吸科，河北石家莊050051；2.河北省胸科醫(yī)院，河北石家莊050048）

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大氣細(xì)顆粒物對(duì)大鼠白細(xì)胞介素17表達(dá)的影響及連花清瘟的干預(yù)作用

韓書(shū)芝1，梁會(huì)朋2，張鳳蕊1，平芬1

（1.河北省人民醫(yī)院呼吸科，河北石家莊050051；2.河北省胸科醫(yī)院，河北石家莊050048）

摘要：目的探討大氣細(xì)顆粒物（PM2.5）急性暴露對(duì)大鼠肺部損傷的作用，及高、中、低劑量連花清瘟對(duì)其的保護(hù)作用。方法48只Wistar大鼠，隨機(jī)分為4個(gè)實(shí)驗(yàn)組（PM2.5染塵組及高、中、低劑量連花清瘟干預(yù)組）和2個(gè)對(duì)照組（空白對(duì)照組及生理鹽水對(duì)照組）。由石家莊市環(huán)境監(jiān)測(cè)中心提供空氣細(xì)顆粒物，制備PM2.5懸液，采用氣管內(nèi)滴注法?？瞻讓?duì)照組無(wú)任何干預(yù)措施；生理鹽水對(duì)照組給予氣管滴注生理鹽水（1 ml/kg）；染塵組給予一次性氣管內(nèi)滴入PM2.5懸液（7.5 mg/kg）；3組干預(yù)組首先分別連續(xù)灌胃給予低（生藥2 g/kg）、中（生藥4 g/kg）、高（生藥8 g/kg）劑量的連花清瘟溶液4 d，第4天灌胃給藥后分別經(jīng)氣管滴入PM2.5懸液（7.5 mg/kg）。應(yīng)用酶聯(lián)免疫分析（ELISA）法測(cè)定各實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物血清白細(xì)胞介素17（IL-17）及肺表面活性蛋白A （SP-A）水平，并在光鏡下觀(guān)察肺組織病理形態(tài)變化。結(jié)果空白對(duì)照組和生理鹽水對(duì)照組間血清IL-17及SP-A差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），染塵組血清IL-17及SP-A水平較生理鹽水對(duì)照組及空白對(duì)照組顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；高、中、低劑量干預(yù)組較染塵組血清IL-17及SP-A水平均有不同程度降低，中高劑量組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論P(yáng)M2.5急性暴露可以導(dǎo)致大鼠肺部損傷，連花清瘟對(duì)肺部損傷有保護(hù)作用。

關(guān)鍵詞：環(huán)境細(xì)顆粒物（PM2.5）；肺損傷；白細(xì)胞介素17；肺表面活性蛋白A；連花清瘟

大量流行病學(xué)研究表明，大氣細(xì)顆粒物（PM2.5）與呼吸系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)疾病及癌癥等的入院率、發(fā)病率、死亡率密切相關(guān)［1］。PM2.5對(duì)健康的不利影響首先表現(xiàn)在呼吸系統(tǒng)，它會(huì)增加呼吸道感染、肺結(jié)核、肺癌等呼吸系統(tǒng)疾病的發(fā)病率［2］。PM2.5通過(guò)損傷呼吸道黏膜上皮細(xì)胞，部分沉積在肺泡內(nèi)或肺間質(zhì)內(nèi)，激活肺內(nèi)的免疫細(xì)胞，引起氣道炎癥反應(yīng)，造成呼吸系統(tǒng)疾?。?］。中藥復(fù)方制劑連花清瘟膠囊具有清瘟解毒，宣肺泄熱的功效，已被廣泛地應(yīng)用于多種流感病毒感染引起的呼吸系統(tǒng)疾?。?］。本研究采集本地區(qū)大氣細(xì)顆粒物，制備PM2.5懸液，觀(guān)察PM2.5暴露及連花清瘟干預(yù)后大鼠血清中白細(xì)胞介素17（interleukin，IL-17）及表面活性蛋白A（surfactant protein，SP-A）的變化，探討PM2.5對(duì)大鼠肺的損傷作用及連花清瘟的保護(hù)作用。

1　材料與方法

1.1PM2.5懸液配制

PM2.5由石家莊市環(huán)境監(jiān)測(cè)中心提供，采用TEOM1405D雙通道顆粒物監(jiān)測(cè)儀收集大氣細(xì)顆粒物，洗脫濾膜顆粒物，冷凍干燥，使用前以滅菌注射用水配制成濃度為7.5 mg/ml PM2.5懸液，超聲震蕩混勻。連花清瘟溶液為連花清瘟干膏粉41.73 g、20.87 g及10.43 g分別加入羥甲基纖維素鈉溶液，配制成80%、40%和20%的高、中、低劑量連花清瘟溶液。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及給藥方法

48只雄性Wistar大鼠（河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供），體重180～200 g，隨機(jī)分為4個(gè)實(shí)驗(yàn)組（PM2.5染塵組及高、中、低劑量連花清瘟干預(yù)組）和2個(gè)對(duì)照組（空白對(duì)照組及生理鹽水對(duì)照組），每組8只。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在丙戊酸鈉腹腔注射麻醉下氣管注入PM2.5懸液染塵?？瞻讓?duì)照組不予任何干預(yù)措施，生理鹽水對(duì)照組給予氣管內(nèi)注入生理鹽水（1 ml/kg）1次。染塵組給予氣管內(nèi)注入PM2.5懸液1 ml/kg （7.5 mg/kg）1次。連花清瘟干預(yù)組給予連花清瘟溶液10 ml/kg（相當(dāng)于給予高、中、低劑量連花清瘟8g/kg、4 g/kg及2 g/kg）灌胃，共給藥4 d，第4天灌胃后給予PM2.5懸液染塵，劑量及次數(shù)同染塵組。

1.3標(biāo)本采集

丙戊酸鈉腹腔注射麻醉下腹主動(dòng)脈采集動(dòng)脈血5 ml后放血處死大鼠（空白對(duì)照組直接處死，生理鹽水對(duì)照組氣管注入生理鹽水后24 h處死，各實(shí)驗(yàn)組均染塵24 h后處死）。所取動(dòng)脈血1 500 r/min離心15 min，分離血清，-80℃冰箱保存。

1.4指標(biāo)檢測(cè)

采用酶聯(lián)免疫分析（ELISA）法測(cè)定（試劑盒購(gòu)自美國(guó)BG公司）血清中IL-17和SP-A水平，操作步驟按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1大鼠肺組織病理

2個(gè)對(duì)照組病理切片未見(jiàn)異常表現(xiàn)（見(jiàn)圖1、2）；染塵組（見(jiàn)圖3）光鏡下可見(jiàn)肺泡間隔增厚，肺泡腔縮小，炎癥細(xì)胞滲出，小支氣管壁增厚，管腔內(nèi)杯狀細(xì)胞增生，周?chē)装Y細(xì)胞浸潤(rùn)，肺間質(zhì)纖維組織增生，間質(zhì)水腫，毛細(xì)血管充血，小血管管壁增厚，周?chē)梢?jiàn)嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。各干預(yù)組（見(jiàn)圖4～6）可見(jiàn)隨連花清瘟劑量增加，肺泡腔內(nèi)炎癥細(xì)胞滲出逐漸減輕。

2.2對(duì)照組、染塵組及連花清瘟組血清IL-17和SP-A水平的變化

空白對(duì)照組及生理鹽水對(duì)照組大鼠血清IL-17 和SP-A水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），染塵組大鼠血清IL-17和SP-A水平均顯著高于空白對(duì)照組及生理鹽水對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；中、高見(jiàn)劑量連花清瘟干預(yù)組血清IL-17 和SP-A水平均低于染塵組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；低劑量連花清瘟干預(yù)組血清IL-17和SP-A水平低于染塵組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)附表。

圖1　生理鹽水對(duì)照組（×200）

圖2　空白對(duì)照組（×200）

圖3　PM2.5染塵組（×200）

圖4　低劑量連花清瘟干預(yù)組（×200）

圖5　中劑量連花清瘟干預(yù)組（×200）

圖6　高劑量連花清瘟干預(yù)組（×200）

附表　對(duì)照組、染塵組及連花清瘟干預(yù)組血清IL-17 和SPA水平的比較（n=8，±s）

附表　對(duì)照組、染塵組及連花清瘟干預(yù)組血清IL-17 和SPA水平的比較（n=8，±s）

分組SP-A/（mg/L）空白對(duì)照組　3.36±0.92生理鹽水對(duì)照組　3.75±1.07 IL-17/（pg/ml）98.99±12.26 96.56±10.82 PM2.5染塵組　12.49±2.53 163.51±13.26低劑量連花清瘟組　158.37±15.92　11.17±1.13中劑量連花清瘟組　132.96±15.01　8.56±1.55高劑量連花清瘟組　108.65±11.23　5.07±1.51 F值　33.62　38.31 P值　0.000　0.000

3　討論

大氣污染物經(jīng)呼吸道吸收可直接作用于呼吸系統(tǒng)，因大氣污染物含有害氣體、化學(xué)物質(zhì)及金屬等，對(duì)機(jī)體的影響可因含有的物質(zhì)不同而不同，其中顆粒物PM2.5對(duì)人體的損害較大，它不但自身有危害性，還可以吸附多種有害氣體和病原微生物［5］。PM2.5可隨空氣進(jìn)入小氣道和肺泡并持續(xù)作用，當(dāng)其到達(dá)肺泡時(shí)，被氣道纖毛系統(tǒng)清除或者被巨噬細(xì)胞吞噬［6］。PM2.5被AM吞噬過(guò)程中可通過(guò)與之相關(guān)的編碼轉(zhuǎn)錄因子和炎癥相關(guān)因子基因轉(zhuǎn)錄水平的增高誘導(dǎo)大量促炎癥因子釋放，破壞細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)平衡，從而調(diào)節(jié)和啟動(dòng)肺局部炎癥反應(yīng)，誘導(dǎo)肺部炎癥損傷。另一方面，PM2.5對(duì)肺部機(jī)械屏障作用的破壞使其清除異物作用下降，進(jìn)一步誘導(dǎo)更嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)［7］。

連花清瘟主要成分為連翹、金銀花、麻黃、杏仁、石膏、板藍(lán)根、綿馬貫眾、魚(yú)腥草、廣藿香、大黃、紅景天、薄荷腦、甘草，從中藥成分來(lái)看符合中醫(yī)治療炎癥疾病的特點(diǎn)，它除了具有明確的抗病毒作用，對(duì)急性肺部感染效果顯著，還具有一定的免疫調(diào)節(jié)作用［8］。流行病學(xué)調(diào)查及臨床試驗(yàn)證實(shí)其提高細(xì)胞免疫功能，抑制病毒感染后的肺部炎性損害［7］。研究發(fā)現(xiàn)處方中麻黃、甘草能抑制大鼠肺組織腫瘤壞死因子（tumor necrosis factorα，TNF-α），白細(xì)胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）含量升高，具有較強(qiáng)抗炎癥作用；大黃游離蒽醌也可抑制TNF-α等炎癥介質(zhì)的釋放，減輕機(jī)體炎癥反應(yīng)［9-10］。夏敬文等［11］研究也發(fā)現(xiàn)連花清瘟可顯著降低慢性阻塞性肺病大鼠模型血清、肺組織勻漿及肺泡灌洗液中IL-8和TNF-α含量，提示連花清瘟對(duì)氣道炎癥有抑制作用。

IL-17是近年來(lái)人們發(fā)現(xiàn)的一種新的細(xì)胞因子，主要由Th17細(xì)胞產(chǎn)生。IL-17是一種促炎癥細(xì)胞因子，也是炎癥反應(yīng)的早期啟動(dòng)子，因其在誘導(dǎo)炎癥方面具有強(qiáng)大的作用而備受重視。IL-17與其受體結(jié)合，主要通過(guò)NF-κB-DNA途徑和有絲分裂原激活激酶途徑發(fā)揮其生物學(xué)作用［12］。IL-17能誘導(dǎo)IL-8、IL-6、TNF-α等多種細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)。而IL-8、IL-6、TNF-α在吸煙導(dǎo)致肺損傷的發(fā)病機(jī)制中具有重要作用［13］。IL-17還可通過(guò)促進(jìn)C-X-C趨化因子誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞活化和募集，促進(jìn)氣道炎癥反應(yīng)，參與肺損傷［14-15］。本研究結(jié)果提示PM2.5染塵組IL-17明顯高于空白對(duì)照組和生理鹽水對(duì)照組，中、高劑量連花清瘟干預(yù)組IL-17明顯低于染塵組，提示PM2. 5通過(guò)誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)導(dǎo)致肺損傷，連花清瘟通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)減輕PM2.5導(dǎo)致的肺損傷。

肺表面活性物質(zhì)是覆蓋于肺泡表面，分為有4種特定表面活性蛋白A、B、C和D，SP-A、SP-D為水溶性蛋白，主要調(diào)節(jié)肺免疫功能。SP-A可通過(guò)損傷的肺泡-毛細(xì)血管膜屏障進(jìn)入血液循環(huán)而成為肺損傷的血清標(biāo)志物。血清中SP-A的量和肺損傷程度密切相關(guān)。SP-A是先天免疫系統(tǒng)的一部分，可通過(guò)與抗原遞呈細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞相互作用來(lái)調(diào)節(jié)先天免疫系統(tǒng)；也可直接作用于B淋巴細(xì)胞或間接通過(guò)刺激免疫細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子作用于B淋巴細(xì)胞，使其激活并產(chǎn)生免疫球蛋白；通過(guò)抑制某些細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)的合成與釋放，從而抑制炎癥反應(yīng)，可與特異性變應(yīng)原結(jié)合，在氣道炎癥中起重要的免疫調(diào)節(jié)作用［16］。本研究結(jié)果提示PM2.5染塵組SP-A明顯高于空白對(duì)照組和生理鹽水對(duì)照組，中、高劑量連花清瘟干預(yù)組SP-A明顯低于染塵組，提示PM2.5通過(guò)損害肺的免疫功能導(dǎo)致肺損傷，連花清瘟通過(guò)調(diào)節(jié)免疫功能拮抗PM2.5導(dǎo)致的肺損傷。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)證實(shí)PM2.5急性暴露可導(dǎo)致大鼠免疫功能受損及肺部炎癥，中、高劑量連花清瘟可保護(hù)免疫功能，抑制炎癥反應(yīng)，其具體調(diào)節(jié)機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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（張蕾編輯）

論著

Effect of surrounding fine particulate matter（PM2.5）on IL-17 expression in rats and antagonistic effects of Lianhuaqingwen

Shu-zhi Han1，Hui-peng Liang2，F(xiàn)eng-rui Zhang1，F(xiàn)en Ping1
（1. Department of Respiratory Diseases，Hebei General Hospital，Shijiazhuang，Hebei 050051，China；2. Hebei Hospital of Thoracic Diseases，Shijiazhuang，Hebei 050048，China）

Abstract：Objectives To explore the lung injury of rats due to acute exposure to PM2.5，and to discuss the antagonistic role of Lianhuaqingwen to the injury. Methods Forty-eight healthy adult Wistar rats were randomly assigned into four experimental groups（PM2.5 group，low-dose Lianhuaqingwen group，medium-dose Lianhuaqingwen group and high-dose Lianhuaqingwen group）and two control groups（control group and saline control group）. The PM2.5 suspension was prepared with fine particulates provided by Shijiazhuang Environmental Monitoring Center. The rat models were developed by exposure to PM2.5 through intratracheal drip. The saline control group was instilled with saline（1 ml /kg）once；the PM2.5 group was instilled with suspension of PM2.5 via trachea（7.5 mg/kg）；the three intervention groups were given diet supplemented with different doses of Lianhuaqingwen（2 g/kg，4 g/kg and 8 g/kg respectively）for 4 days before drip with suspension of PM2.5. Interleukin 17（IL-17）and surfactant protein A（SP-A）in the serum were measured using ELASA. Pathological changes of the lungs were observed at the same time. Results The serum levels of IL-17 and SP-A were not significantly different between the saline control group and the control group（P＞0.05）. The levels of IL-17 and SP-A in the PM2.5 group were markedly higher than those in the saline control group and the control group（P＜0.05）. The level of IL-17 was significant differentbook=17,ebook=22between the high-dose Lianhuaqingwen group and the PM2.5 group（P＜0.05），and the level of IL-17 in each intervention group was markedly changed compared with that in the PM2.5 group（P＜0.05）. Conclusions The acute exposure to PM2.5 can induce injury to rat's lungs. Lianhuaqingwen could produce antagonistic effects to inflammatory injury to rat's lung tissues.

Keywords：fine particulate matter（PM2.5）；inflammatory injury；interleukin 17；surfactant protein A；Lianhuaqingwen

中圖分類(lèi)號(hào)：R-332

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

DOI：10.3969/j.issn.1005-8982.2016.10.004

文章編號(hào)：1005-8982（2016）10-0016-04

收稿日期：2015-12-04