李建軍，王 君，任美玲，尚星晨，劉保彬，張光田

金銀花為忍冬科植物忍冬(Lonicera japonica)的干燥花蕾或帶初開(kāi)的花，有清熱解毒，涼散風(fēng)熱的功效［1－3］。主產(chǎn)于河南、山東和河北等地。中國(guó)主要栽培有毛花系、線花系兩大品系，推廣的優(yōu)良主栽品種有封丘大毛花、亞特紅蕾1號(hào)、魯峰王、九豐一號(hào)、亞特金銀花、密縣大毛花、泰瑞1號(hào)等。目前，除山東與中科院植物研究所合作研究出四倍體“九豐一號(hào)”高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、高抗新品種及亞特認(rèn)定了亞特系列4個(gè)林木良種外，其他在良種選育方面研究較少。由于長(zhǎng)期人工馴化栽培、自然變異和人工選擇，形成了很多地方品種，例如封丘大毛花、豫封一號(hào)等。同時(shí)，由于長(zhǎng)期無(wú)性繁殖存在品種退化、病蟲(chóng)害嚴(yán)重，導(dǎo)致金銀花產(chǎn)量和品質(zhì)下降，需要選育抗病、高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)的新品種。2011年作者在河南道地產(chǎn)區(qū)封丘大毛花的栽培田中發(fā)現(xiàn)生長(zhǎng)勢(shì)好、花蕾大、表皮毛密又長(zhǎng)、抗病性強(qiáng)的植株，經(jīng)過(guò)無(wú)性擴(kuò)繁獲得了綜合性狀優(yōu)良新品系豫金1號(hào)。2002年春從河北張家口引入紅白忍冬300多株，栽種于封丘，經(jīng)過(guò)多年種植擴(kuò)繁，人工選擇，篩選出綜合性狀優(yōu)良的新品系豫金2號(hào)。通過(guò)豫金1號(hào)和豫金2號(hào)與主栽品種對(duì)比試驗(yàn)和豐產(chǎn)示范試驗(yàn)，為新品種的鑒定和推廣提供依據(jù)，對(duì)于促進(jìn)金銀花產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

于2014年在新鄉(xiāng)市封丘縣賈莊進(jìn)行豫金1號(hào)豐產(chǎn)示范試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)2個(gè)處理，每個(gè)處理品種(系)即為 1個(gè)處理，封丘大毛花為對(duì)照。于2014—2015年在封丘賈莊、封丘應(yīng)舉、封丘陳固、山東平邑流峪鎮(zhèn)4點(diǎn)進(jìn)行豫金2號(hào)豐產(chǎn)示范試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)2個(gè)處理，每個(gè)處理品種(系)即為1個(gè)處理，亞特紅蕾1號(hào)為對(duì)照。田間管理均按照生產(chǎn)田方式進(jìn)行。

豫金1號(hào)與對(duì)照封丘大毛花于2014年5月采自封丘賈莊，豫金2號(hào)與對(duì)照亞特紅蕾1號(hào)于2014年5月采自封丘應(yīng)舉，藥材樣品由河南師范大學(xué)李發(fā)啟副教授鑒定為L(zhǎng).japonica，烘干，粉碎，過(guò)孔徑為(250±9)μm的4號(hào)篩。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 儀器 安捷倫1200系列高效液相色譜儀(安捷倫科技有限公司);XDB－C18色譜柱;自動(dòng)控溫自動(dòng)進(jìn)樣器;Thermo自動(dòng)雙重純水蒸餾器;FA 2104 N型電子分析天平。

1.3 測(cè)定指標(biāo)和方法

1.3.1 千蕾質(zhì)量、折干率和公頃產(chǎn)量的測(cè)定 于收獲期分別測(cè)量新品系與主栽品種的鮮、干花蕾的千蕾質(zhì)量，計(jì)算出折干率，并測(cè)量公頃產(chǎn)量。折干率=干花蕾千蕾質(zhì)量/鮮花蕾千蕾質(zhì)量×100%。1.3.2 抗性測(cè)定

1.3.2.1 抗性調(diào)查 于2014年9月，葉部病害發(fā)生盛期后進(jìn)行病蟲(chóng)害調(diào)查。地點(diǎn)設(shè)在封丘應(yīng)舉，供試品種(系):豫金1號(hào)、封丘大毛花、豫金2號(hào)、亞特紅蕾1號(hào)、泰瑞1號(hào)。每品種(系)2個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)調(diào)查10株，調(diào)查成熟葉片，記錄白粉病、褐斑病的嚴(yán)重度。

1.3.2.2 計(jì)算方法 統(tǒng)計(jì)病情指數(shù)，計(jì)算相對(duì)抗性指數(shù)，進(jìn)行抗感鑒定。參照劉喜存［4］的研究，病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)如下:0級(jí):健葉;1級(jí):病斑面積占葉片總面積5%以下;3級(jí):病斑面積占葉片總面積6%～10%;5級(jí):病斑面積占葉片面積11% ～25%;7級(jí):病斑面積占葉片總面積26% ～50%;9級(jí):病斑面積占葉片面積50%以上。病情指數(shù)計(jì)算公式、相對(duì)病情指數(shù)計(jì)算方法、相對(duì)抗性指數(shù)計(jì)算方法和抗性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)如下。

1.3.3 綠原酸含量測(cè)定

1.3.3.1 色譜條件 色譜柱填充劑為十八烷基硅烷鍵合硅膠;檢測(cè)波長(zhǎng)327 nm;進(jìn)樣量10 μL;流動(dòng)相為乙腈和 0.4%磷酸(13∶87)溶液;流速1.0 mL·min－1。

1.3.3.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備 精確稱取綠原酸對(duì)照品適量，置于棕色量瓶中，加體積分?jǐn)?shù)50%甲醇制成質(zhì)量濃度為40 g·L－1的溶液，即可得標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

近日，節(jié)水抗旱稻新品種“滬旱61”綠色生產(chǎn)現(xiàn)場(chǎng)觀摩會(huì)在上海崇明齊茂糧食合作社召開(kāi)?！皽?1”新品種的試種結(jié)果在會(huì)上揭曉：水種旱管栽培模式下，高產(chǎn)示范田塊產(chǎn)量達(dá)700kg/畝以上，百畝連片平均產(chǎn)量達(dá)600kg/畝以上，節(jié)水率達(dá)50%，節(jié)肥率超過(guò)20%。

1.3.3.3 金銀花綠原酸樣品溶液制備 分別精確稱量金銀花新品系與主栽品種的粉末各0.500 0 g，置具塞錐形瓶中，精確加入體積分?jǐn)?shù)50%甲醇50 mL，稱質(zhì)量，超聲處理(功率250 W，頻率35 kHz)30 min，放冷，再稱其質(zhì)量，用體積分?jǐn)?shù)50%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，過(guò)濾，精確量取濾液5 mL，置25 mL棕色量瓶中，加體積分?jǐn)?shù)50%甲醇至刻度，搖勻即得［5］。

1.3.3.4 測(cè)定方法 標(biāo)準(zhǔn)品與樣品溶液分別進(jìn)樣10 μL進(jìn)行液相色譜分析。按照外標(biāo)峰面積的方法計(jì)算綠原酸含量。

1.3.4 木犀草苷含量測(cè)定

1.3.4.1 色譜條件 色譜柱填充劑十八烷基硅烷鍵合硅膠;檢測(cè)波長(zhǎng)350 nm;進(jìn)樣量10 μL;流動(dòng)相:乙腈為流動(dòng)相A，0.5%的冰乙酸為流動(dòng)相B，流速1.0 mL·min－1，按照表1進(jìn)行梯度洗脫。

1.3.4.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備 精確稱取木犀草苷對(duì)照品適量，加70%乙醇制成質(zhì)量濃度為40 g·L－1的溶液，即可得標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

1.3.4.3 金銀花木犀草苷樣品制備 精確稱定金銀花新品系與主栽品種的粉末各2.000 0 g，置具塞錐形瓶中，加入體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇50 mL，稱其質(zhì)量，超聲處理(功率250 W，頻率35 kHz)1 h，放冷，再稱其質(zhì)量，用體積分?jǐn)?shù)70%乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，過(guò)濾，精確量取濾液10 mL，回收溶劑至干，殘?jiān)皿w積分?jǐn)?shù)為70%乙醇溶解，轉(zhuǎn)移至5 mL容量瓶中，加體積分?jǐn)?shù)為70%乙醇至刻度，搖勻即得［5］。

表1 高效液相法測(cè)量木犀草苷的梯度洗脫表Table 1 HPLC gradient elution of luteoloside logging table

1.3.4.4 測(cè)定方法 標(biāo)準(zhǔn)品與樣品溶液分別進(jìn)樣10 μL進(jìn)行液相色譜分析。按照外標(biāo)峰面積的方法計(jì)算綠原酸含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 金銀花新品系與主栽品種千蕾質(zhì)量、折干率和產(chǎn)量分析

金銀花新品系與主栽品種鮮、干花蕾的千蕾質(zhì)量、折干率和產(chǎn)量(5 a樹(shù)齡)見(jiàn)表2。由表2可知，豫金1號(hào)干花蕾千蕾質(zhì)量為23.95 g，較對(duì)照封丘大毛花差異極顯著，公頃產(chǎn)量較對(duì)照封丘大毛花高。

表2 金銀花新品系與主栽品種鮮、干花蕾的千蕾質(zhì)量、折干率和產(chǎn)量Table 2 The thousands of fresh，dry buds weigh，drying rate and per-hectare yield of Lonicera japonica new strain and major cultivars

豫金2號(hào)干花蕾千蕾質(zhì)量為14.69 g，較對(duì)照亞特紅蕾1號(hào)差異顯著，折干率和公頃產(chǎn)量均較對(duì)照亞特紅蕾1號(hào)高。

2.2 金銀花新品系與主栽品種抗性比較

金銀花新品系與主栽品種對(duì)白粉病、褐斑病的抗性評(píng)價(jià)見(jiàn)表3。

表3 金銀花新品系與主栽品種抗性評(píng)價(jià)Table 3 The resistance evaluation of Lonicera japonica new strain and major cultivars

由表3可知，豫金1號(hào)中抗白粉病，高抗褐斑病，對(duì)照封丘大毛花中感白粉病和褐斑病;豫金2號(hào)高抗白粉病，中抗褐斑病，對(duì)照亞特紅蕾1號(hào)中抗白粉病，中感褐斑病;泰瑞1號(hào)高感白粉病和褐斑病。

2.3 金銀花新品系與主栽品種綠原酸和木犀草苷含量比較

按1.3.3試驗(yàn)方法以同樣的色譜條件分析綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品和樣品，以綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程:Y=33.379 3 X － 52.248 0，R2=0.999 6，綠原酸在 14.2 ～142 g·L－1線性關(guān)系良好。各樣品的高效液相色譜圖見(jiàn)圖1。

按1.3.4試驗(yàn)方法以相同色譜條件對(duì)木犀草苷標(biāo)準(zhǔn)品和樣品分析，以木犀草苷標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，木犀草苷標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積為縱坐標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程:Y=25.18 X+18.01，R2=0.999 9，木犀草苷在 36 ～93 g·L－1線性關(guān)系良好。各樣品的高效液相色譜圖見(jiàn)圖2。

對(duì)豫金1號(hào)、豫金2號(hào)及其對(duì)照品種按照上述方法進(jìn)行綠原酸和木犀草苷含量的測(cè)定，并將測(cè)定值代入回歸方程得出試驗(yàn)結(jié)果，見(jiàn)表4。

由圖1、圖2和表4可知，豫金1號(hào)、豫金2號(hào)及其對(duì)照品種指標(biāo)性成分中，豫金1號(hào)綠原酸含量為22.56 g·kg－1，較對(duì)照封丘大毛花差異不顯著;豫金1號(hào)木犀草苷含量為1.65 g·kg－1，高于封丘大毛花，較其差異極顯著。

豫金2 號(hào)綠原酸含量為 24.69 g·kg－1，高于亞特紅蕾1號(hào)，較其差異不顯著;豫金2號(hào)木犀草苷含量為1.86 g·kg－1，較對(duì)照亞特紅蕾1號(hào)差異不顯著。

表4 金銀花新品系與主栽品種的綠原酸和木犀草苷含量Table 4 The content of chlorogenic acid and luteolosid of Lonicera japonica new strain and major cultivars

3 結(jié)論與討論

1)金銀花不同種質(zhì)的形態(tài)和指標(biāo)成分含量差異較大，究其原因是由于忍冬的品種、生長(zhǎng)環(huán)境、栽培措施、采收時(shí)間及烘干方法的不同等綜合因素造成的［6－9］。本試驗(yàn)將金銀花新品系與對(duì)照主栽品種種在同一塊試驗(yàn)田中進(jìn)行統(tǒng)一管理，并按照2010版《中國(guó)藥典》方法，采用HPLC測(cè)其指標(biāo)成分，以保證各品種的客觀條件等基本平行，使測(cè)定的產(chǎn)量和指標(biāo)成分更客觀、更真實(shí)地反映品種間的差異。

2)金銀花新品系與主栽品種鮮、干花蕾的千蕾質(zhì)量、折干率和產(chǎn)量對(duì)比結(jié)果表明，豫金1號(hào)和豫金2號(hào)千蕾干質(zhì)量、產(chǎn)量分別較其對(duì)照封丘大毛花、亞特紅蕾1號(hào)高。從千蕾質(zhì)量和產(chǎn)量說(shuō)明這2個(gè)新品系在產(chǎn)量方面具有顯著優(yōu)勢(shì)。

3)通過(guò)對(duì)豫金1號(hào)、豫金2號(hào)的抗性鑒定來(lái)看，初步鑒定豫金1號(hào)中抗白粉病，高抗褐斑病;豫金2號(hào)高抗白粉病，中抗褐斑病。

4)金銀花新品系與主栽品種綠原酸和木犀草苷含量測(cè)定比較結(jié)果表明，豫金1號(hào)綠原酸含量為22.56 g·kg－1，較對(duì)照封丘大毛花差異不顯著，豫金2號(hào)綠原酸含量為24.69 g·kg－1，高于對(duì)照亞特紅蕾1號(hào)，二者差異不顯著;豫金1號(hào)木犀草苷含量為1.65 g·kg－1，高于其對(duì)照封丘大毛花，2者差異極顯著;豫金2號(hào)木犀草苷含量為1.86 g·kg－1，較其對(duì)照亞特紅蕾1號(hào)差異不顯著。

圖1 不同金銀花品種綠原酸含量HPLC色譜圖Fig.1 The chlorogenic acid content HPLC chromatograms of different cultivars of Lonicera japonica

圖2 不同金銀花品種木犀草苷含量HPLC色譜圖Fig.2 The luteoloside content HPLC chromatograms of different cultivars of Lonicera japonica

5)綜合試驗(yàn)結(jié)果分析可知，豫金1號(hào)新品系產(chǎn)量和指標(biāo)成分綜合性狀比主栽品種有明顯優(yōu)勢(shì)，豫金2號(hào)新品系產(chǎn)量和指標(biāo)成分綜合性狀比主栽品種有一定優(yōu)勢(shì)。豫金1號(hào)木犀草苷含量具有極顯著優(yōu)勢(shì)，豫金2號(hào)綠原酸含量具有相對(duì)優(yōu)勢(shì)，且指標(biāo)成分遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于2010年版《中國(guó)藥典》的規(guī)定。產(chǎn)量、抗性和指標(biāo)成分結(jié)果說(shuō)明，豫金1號(hào)、豫金2號(hào)新品系已達(dá)到新品種鑒定條件，可以在生產(chǎn)中示范，為金銀花的可持續(xù)發(fā)展奠定了良種物質(zhì)基礎(chǔ)。

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