陳玉娟，王巍，于源華

（長(zhǎng)春理工大學(xué)　生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長(zhǎng)春　130022）

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HPLC法測(cè)定關(guān)節(jié)疏通膠囊中
白蠟樹(shù)精苷的方法的建立

陳玉娟，王巍，于源華

（長(zhǎng)春理工大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長(zhǎng)春130022）

摘要：通過(guò)高效液相色譜法（HPLC），建立一種檢測(cè)關(guān)節(jié)疏通膠囊中的主要香豆素類成分即白蠟樹(shù)精苷含量檢測(cè)的方法。采用線性關(guān)系、精密度試驗(yàn)、8h穩(wěn)定性試驗(yàn)、重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)、加樣回收率試驗(yàn)等方法對(duì)關(guān)節(jié)疏通膠囊中的白蠟樹(shù)精苷的含量檢測(cè)方法進(jìn)行開(kāi)發(fā)，測(cè)定白蠟樹(shù)精苷在0.5196～2.5980μg（r =0.9999）范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，其中精密度試驗(yàn)、8h穩(wěn)定性試驗(yàn)、重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)、加樣回收率試驗(yàn)的RSD值均小于2%，加樣回收率試驗(yàn)中，平均加樣回收率為98.1%。對(duì)關(guān)節(jié)疏通膠囊中的主要成分白蠟樹(shù)精苷進(jìn)行了定量分析，選擇334nm波長(zhǎng)進(jìn)行檢測(cè)，減少了雜質(zhì)的干擾。結(jié)果表明此法線性關(guān)系好、精密度高、準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性好、前處理相對(duì)簡(jiǎn)單，適合關(guān)節(jié)疏通膠囊中白蠟樹(shù)精苷的含量檢測(cè)。

關(guān)鍵詞：關(guān)節(jié)疏通膠囊；高效液相；白蠟樹(shù)精苷

水曲柳是木樨科梣屬植物，民間用其樹(shù)皮治療風(fēng)濕、類風(fēng)濕、骨痛等疾病，作用療效確切［1］。水曲柳葉中含有香豆素苷類成分，前期研究表明，水曲柳總香豆素苷有抗炎鎮(zhèn)痛之功效，對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的動(dòng)物模型有明顯的抑制其類風(fēng)濕病變進(jìn)展的作用［2］。關(guān)節(jié)疏通膠囊是本課題組正在研究的一種治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的中成藥，其主要成分是從水曲柳（Fraxinus mandschurica Rupr.）中提取的總香豆素苷類［2］。根據(jù)《藥品注冊(cè)管理辦法》（局令第28號(hào)）要求，申報(bào)的新藥對(duì)其生產(chǎn)工藝和質(zhì)量控制部分必須制定相應(yīng)的可控的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。水曲柳提取物中含量最多的香豆素苷類成分為白蠟樹(shù)精苷，白蠟樹(shù)精苷化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，紫外吸收強(qiáng)；而《中國(guó)藥典》和其他的藥品標(biāo)準(zhǔn)中沒(méi)有白蠟樹(shù)精苷的檢測(cè)方法的描述。本文擬采用HPLC法建立一種定量測(cè)定關(guān)節(jié)疏通膠囊中的白蠟樹(shù)精苷的方法，為制定關(guān)節(jié)疏通膠囊的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供試驗(yàn)依據(jù)。

1　材料和儀器

1.1試驗(yàn)儀器

高效液相色譜（日本Shimadzu公司），配有SGU-20A3在線脫氣裝置，LC-20AD二元泵，CTO-20A柱溫箱，SIL-20A自動(dòng)進(jìn)樣器，SPD-20A檢測(cè)器，LCsolution工作站，C18色譜柱（250×4.6mm，5μm，美國(guó)Phenomenex公司）。

1.2試劑和試驗(yàn)材料

甲醇為分析純，購(gòu)于Fisher Scientific公司，磷酸為分析純，購(gòu)于北京化工有限公司，水為自制蒸餾水，白蠟樹(shù)精苷（mandshurin）對(duì)照品自制，純度≥99%。關(guān)節(jié)疏通膠囊試材為自制［2］，取水曲柳總香豆素提取物30g，硬脂酸鎂、滑石粉、尼泊金甲酯各1g，淀粉100g，糊精117g等物質(zhì)，總計(jì)250g，經(jīng)過(guò)混勻、制粒、干燥、整粒、灌裝等工序得到關(guān)節(jié)疏通膠囊1000粒。

2　方法和結(jié)果

2.1HPLC測(cè)定條件［3］

流動(dòng)相為甲醇-0.1%磷酸水溶液（37∶63），流速1mL/min，柱溫30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為334nm，進(jìn)樣量10μL。

2.2對(duì)照品和樣品的配制

取白蠟樹(shù)精苷對(duì)照品8.66mg，加甲醇30mL溶劑，定容至10mL，經(jīng)過(guò)0.22μm孔徑的濾膜過(guò)濾，得到濃度為866μg/mL的原液，備用。

取關(guān)節(jié)疏通膠囊內(nèi)容物0.35g，加甲醇50mL超聲2次，每次10min，定容至100mL，取上清液用0.22μm的濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液備用。

2.3方法專屬性試驗(yàn)［4］

取對(duì)照品溶液和供試品溶液，分別進(jìn)樣10μL，結(jié)果見(jiàn)圖1，對(duì)照品溶液，根據(jù)峰面積歸一化法計(jì)算白蠟樹(shù)精苷的含量為99.45%，供試品溶液中其他峰與白蠟樹(shù)精苷的峰達(dá)到了基線分離，對(duì)白蠟樹(shù)精苷的測(cè)定沒(méi)有干擾。

圖1　高效液相色譜圖

2.4線性關(guān)系

分別精密量取白蠟樹(shù)精苷的對(duì)照品原液0.6mL、1.2mL、1.8mL、2.4mL、3.0mL定容至10mL，配成濃度梯度為51.96μg/mL、103.92μg/mL、155.88μg/mL、207.84μg/mL、259.8μg/mL的溶液，進(jìn)樣10μL。進(jìn)樣量與峰面積如表1和圖2所示，線性曲線為y=3E+06x+39348，線性相關(guān)系數(shù)r = 0.9999，說(shuō)明進(jìn)樣量在0.5196μg-2.5980μg之間，進(jìn)樣量與所測(cè)峰面積成良好的線性關(guān)系。

表1　白蠟樹(shù)精苷的進(jìn)樣量和所測(cè)峰面積值

圖2　白蠟樹(shù)精苷進(jìn)樣量和所測(cè)峰面積的線性關(guān)系

2.5精密度試驗(yàn)

精密量取白蠟樹(shù)精苷原液1mL加甲醇定容至10mL，連續(xù)進(jìn)樣六次，結(jié)果見(jiàn)表2所示。

表2　精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.68h穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取供試品溶液，在配制完成后的0h、2h、4h、6h、8h時(shí)分別進(jìn)樣10μL，結(jié)果見(jiàn)表3所示。

表3　8h穩(wěn)定性試驗(yàn)

2.7重復(fù)性試驗(yàn)

稱取關(guān)節(jié)疏通膠囊內(nèi)容物6份，每份約0.35g，精密稱量，按照樣品溶液配制方法，配制供試品溶液6份，進(jìn)樣，結(jié)果見(jiàn)表4所示。

2.8加樣回收率實(shí)驗(yàn)

經(jīng)過(guò)重現(xiàn)性試驗(yàn)測(cè)定關(guān)節(jié)疏通膠囊中白蠟樹(shù)精苷的含量為8.68%，取相同批次的關(guān)節(jié)疏通膠囊6份，每份約0.35g，精密稱量，加入已知量的白蠟樹(shù)精苷對(duì)照品，按照供試品溶液配制方法進(jìn)行配制溶液，進(jìn)樣，結(jié)果見(jiàn)表5。

3　討論

文獻(xiàn)中對(duì)于香豆素的含量測(cè)定方法很多，有采用HPLC法［5，6］，有采用LC-MS法［7］，有的采用紫外檢測(cè)法［8］。由于紫外檢測(cè)法雜質(zhì)干擾嚴(yán)重，LC-MS法所用的儀器昂貴、需要專人維護(hù)，且費(fèi)用高，為以后生產(chǎn)關(guān)節(jié)疏通的企業(yè)考慮，本文采用方法相對(duì)簡(jiǎn)單、穩(wěn)定、性價(jià)比高的HPLC法檢測(cè)關(guān)節(jié)疏通膠囊中的白蠟樹(shù)精苷。白蠟樹(shù)精苷在334nm有強(qiáng)的紫外吸收，而雜質(zhì)的吸收相對(duì)較弱，本試驗(yàn)采用334nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。由于白蠟樹(shù)精苷有較弱的酸性，在甲醇-水作為流動(dòng)相時(shí)有拖尾現(xiàn)象，所以把水換成0.1%磷酸水溶液以修正拖尾現(xiàn)象［9］。

關(guān)節(jié)疏通膠囊中的配方比例是：水曲柳總香豆素提取物30g，硬脂酸鎂、滑石粉、尼泊金甲酯各1g，淀粉100g，糊精117g，總計(jì)250g，制成1000粒。經(jīng)過(guò)上述重現(xiàn)性試驗(yàn)測(cè)定關(guān)節(jié)疏通膠囊中白蠟樹(shù)精苷的含量為8.68%，已知關(guān)節(jié)疏通膠囊中水曲柳總香豆素提取物的比例12%（30/250），所以水曲柳總香豆素提取物中白蠟樹(shù)精苷的含量為72.3%。《藥品注冊(cè)管理辦法》（局令第28號(hào)）中規(guī)定“‘未在國(guó)內(nèi)上市銷售的從植物、動(dòng)物、礦物等物質(zhì)中提取的有效部位及其制劑’是指國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)中未收載的從單一植物、動(dòng)物、礦物等物質(zhì)中提取的一類或數(shù)類成份組成的有效部位及其制劑，其有效部位含量應(yīng)占提取物的50%以上”。關(guān)節(jié)疏通膠囊中白蠟樹(shù)精苷的含量大于50%，符合要求。

4　結(jié)論

采用HPLC法檢測(cè)關(guān)節(jié)疏通膠囊中的白蠟樹(shù)精苷，進(jìn)樣量在0.5196～2.5980μg之間，r =0.999，說(shuō)明進(jìn)樣量與所測(cè)峰面積成良好的線性關(guān)系；其中精密度試驗(yàn)、8h穩(wěn)定性試驗(yàn)、重復(fù)性試驗(yàn)、加樣回收率試驗(yàn)的RSD值分別為0.13%、0.42%、0.61%、0.93%，均小于2%，說(shuō)明精密度高，干擾少，重復(fù)性好，方法簡(jiǎn)單可行。此方法可以用于對(duì)關(guān)節(jié)疏通膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定中。

表4　白蠟樹(shù)精苷的重現(xiàn)性試驗(yàn)結(jié)果

表5　白蠟樹(shù)精苷的加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

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Determination of Mandshurin in Guanjie Shutong Capsule by HPLC

CHEN Yujuan，WANG Wei，YU Yuanhua
（School of Life Science and Technology，Changchun University of Science and Technology，Changchun 130022）

Abstract：To establish a new method for determination of mandshurin（one kind of coumarin）in Guanjie Shutong Capsule，high performance Liquid chromatography（HPLC）was employed. HPCE was used to determine the content of mandshurin by experiments as linearity，precision，stability，reproducibility and recoveries. The linear ranges of mandshurin was 0.5196～2.5980μg（r =0.9999）by HPLC，the RSD of precision，reproducibility，stability and recoveries were all less than 2%. And the average recovery by HPLC was 98.1%. A new method was established to determine mandshurin in Guanjie Shutong Capsule. The detection wavelength is 334nm，reducing the interference of impurities. The method is with good Linear relationship，high precision，and simple，rapid，reproducible，accurate. So HPLC is more suitable for determination of mandshurin in Guanjie Shutong Capsule.

Key words：Guanjie Shutong Capsule；HPLC；Mandshurin

中圖分類號(hào)：R917

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1672-9870（2016）02-0140-04

收稿日期：2015-04-17

基金項(xiàng)目：吉林省科技廳重點(diǎn)科技攻關(guān)項(xiàng)目（20140204052YY）

作者簡(jiǎn)介：陳玉娟（1979-），女，講師，E-mail：jychenzxcv@163.com