王妍平，王冠，崔洪艷，張志坤

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胎兒生長(zhǎng)受限對(duì)其腎臟發(fā)育的影響

王妍平，王冠，崔洪艷，張志坤

【摘要】目的：探究胎兒生長(zhǎng)受限（fetal growth restriction，F(xiàn)GR）的宮內(nèi)環(huán)境對(duì)胎兒腎臟發(fā)育的影響。方法：收集2009年11月—2011年12月于天津市中心婦產(chǎn)科醫(yī)院產(chǎn)科因胎兒原因要求引產(chǎn)的11例FGR和同期12例非FGR死胎或死產(chǎn)胎兒的腎臟組織標(biāo)本（所有標(biāo)本的采集均征得患方的知情同意和院倫理委員會(huì)的認(rèn)可），測(cè)量其質(zhì)量和體積，應(yīng)用TUNEL法分析腎臟組織細(xì)胞凋亡率，并對(duì)Bax和Bcl-2蛋白在凋亡細(xì)胞中的陽(yáng)性表達(dá)率進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果：與非FGR組相比，F(xiàn)GR組胎兒的平均腎臟體積、質(zhì)量和腎單位數(shù)目均明顯下降（P＜0.01），而其細(xì)胞凋亡率明顯增加（P＜0.01）。進(jìn)一步檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GR組細(xì)胞內(nèi)促凋亡蛋白Bax的陽(yáng)性表達(dá)率明顯增加（P＜0.01），伴隨有凋亡抑制基因Bcl-2的陽(yáng)性表達(dá)率顯著降低（P＜0.01）。結(jié)論：生長(zhǎng)受限的宮內(nèi)環(huán)境可能通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞凋亡而影響胎兒腎臟發(fā)育，為將來(lái)進(jìn)一步探討FGR的分子機(jī)制和成人期疾病的發(fā)病機(jī)制提供了新的線索。

【關(guān)鍵詞】胎兒生長(zhǎng)遲緩；腎；細(xì)胞凋亡；原癌基因蛋白質(zhì)c-bcl-2；原癌基因蛋白質(zhì)類

作者單位：300100天津市中心婦產(chǎn)科醫(yī)院

（J Int Obstet Gynecol，2016,43：29-31）

孕期營(yíng)養(yǎng)不良可能導(dǎo)致胎兒生長(zhǎng)受限（FGR），并可對(duì)胎兒的遠(yuǎn)期健康造成一定負(fù)面影響[1]。在FGR環(huán)境中，為保護(hù)重要器官，血液被重新分布到心和腦等器官[2]，導(dǎo)致腎臟、肝臟和肌肉組織等發(fā)育不良，從而導(dǎo)致成人疾病的發(fā)生[3-4]。隨著FGR模型在哺乳動(dòng)物中的成功建立，學(xué)者們發(fā)現(xiàn)FGR與成年疾病的發(fā)生密切相關(guān)。且有研究發(fā)現(xiàn)在所有動(dòng)物模型中腎臟損害普遍存在[5]。Keller等[6]研究表明FGR模型中腎單位數(shù)目減少高達(dá)50%，高血壓患者腎小球體積增加1倍，這可能與腎單位數(shù)目減少后代償性肥大和超濾導(dǎo)致腎小球體積增加有關(guān)。由于腎臟在體液平衡和血壓調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用，腎單位數(shù)目減少可能導(dǎo)致成人高血壓和心血管疾病的發(fā)生[7]。然而，具體機(jī)制尚不完全清楚。本研究旨在通過(guò)分析FGR情況下胎兒腎臟凋亡細(xì)胞的數(shù)目，探究其與腎臟形態(tài)學(xué)改變的關(guān)系，進(jìn)一步通過(guò)檢測(cè)凋亡相關(guān)調(diào)節(jié)基因探討FGR可能的發(fā)生機(jī)制。

1　對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象收集2009年11月—2011年12月于天津市中心婦產(chǎn)科醫(yī)院產(chǎn)科引產(chǎn)的死胎或死產(chǎn)胎兒腎臟標(biāo)本23例，其中包括11例FGR腎臟標(biāo)本（FGR組）和12例非FGR腎臟標(biāo)本（對(duì)照組）。FGR組中，并發(fā)胎盤早剝、胎死宮內(nèi)3例，合并胎兒畸形（胎兒唇腭裂1例，膈疝1例）要求引產(chǎn)2例，因FGR要求引產(chǎn)6例。對(duì)照組中，胎兒唇腭裂4例，胎兒腦部發(fā)育異常1例，膈疝2例，軟骨發(fā)育不全1例，食道閉鎖2例，正常要求引產(chǎn)2例。本研究均征得患方的知情同意和我院倫理委員會(huì)的認(rèn)可后采集娩出胎兒的腎臟標(biāo)本，所有腎臟標(biāo)本均無(wú)明顯畸形。對(duì)收集的所有標(biāo)本稱質(zhì)量后立即用福爾馬林固定后測(cè)定腎臟體積。2組一般情況比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

表12　組一般情況比較

1.2方法

1.2.1HE染色方法腎臟組織經(jīng)乙醇脫水，石蠟包埋后制成4～6 μm厚的切片，再經(jīng)二甲苯脫蠟及梯度乙醇水合后進(jìn)行HE染色。染色后的切片經(jīng)乙醇脫水，二甲苯洗滌后于熒光顯微鏡（Nikon 80i，Nikon公司，日本）下觀察。每一標(biāo)本取20張切片，經(jīng)2位經(jīng)驗(yàn)豐富的病理學(xué)家盲法分析切片細(xì)胞的凋亡程度。

1.2.2TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡HE染色切片脫蠟入水，滴加蛋白酶K（20 μg/mL，Roche Diagnostics公司，瑞士），37℃孵育30 min，修復(fù)抗原。加入TUNEL反應(yīng)液，即末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（TdT）緩沖液（0.3 U/μL）、生物素化的dUTP（0.2 mmol/L，Roche公司）、1×TdT緩沖液（Invitrogen公司，美國(guó)），37℃孵育1 h。然后滴加10%正常馬血清封閉非特異性抗體，并加入抗生物素蛋白-生物素復(fù)合物（稀釋度為1∶100，Vector Laboratories公司，美國(guó)），于室溫下孵育1 h，最后使用辣根過(guò)氧化物酶底物二氨基聯(lián)苯胺（DAB）對(duì)切片進(jìn)行染色，熒光顯微鏡（Nikon 80i，Nikon公司，日本）下觀察結(jié)果。隨機(jī)選取共5個(gè)非重疊視野，計(jì)算凋亡細(xì)胞的比例。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用PASW Statistics 18統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。定量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本均數(shù)比較的t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1FGR組和對(duì)照組出生體質(zhì)量、腎臟質(zhì)量、體積及腎單位數(shù)量的比較FGR組平均出生體質(zhì)量、腎臟質(zhì)量、腎臟體積以及腎單位數(shù)量均低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見表2。

表22　組胎兒出生體質(zhì)量、腎臟質(zhì)量及腎單位數(shù)目的比較（±s）

表22　組胎兒出生體質(zhì)量、腎臟質(zhì)量及腎單位數(shù)目的比較（±s）

組別　n出生體質(zhì)量（g）腎臟質(zhì)量（g）腎臟體積（mm3）腎單位數(shù)目（個(gè)）FGR組111 094±383　3.732±1.19　5.6±0.7　462 749±121 871對(duì)照組121 964±439　7.305±1.98　9.4±1.1　913 889±125 926 t（P）　5.037（0.007）5.173（0.007）3.037（0.006）7.261（0.008）

2.2腎臟組織細(xì)胞凋亡率以及Bax和Bcl-2蛋白在凋亡細(xì)胞中的陽(yáng)性表達(dá)率染色陽(yáng)性細(xì)胞細(xì)胞核呈黃色，視為凋亡細(xì)胞。以200倍高倍鏡下觀察，陽(yáng)性細(xì)胞的細(xì)胞核呈棕黃色，見圖1和圖2（見后插一）。隨機(jī)選擇5個(gè)非重疊高倍視野計(jì)數(shù)1 000個(gè)細(xì)胞，記錄2組的凋亡細(xì)胞數(shù)，結(jié)果顯示FGR組腎臟組織凋亡細(xì)胞增加，高于對(duì)照組（t=3.013，P=0.002）。對(duì)凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和Bax的表達(dá)結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GR組促進(jìn)凋亡蛋白Bax的表達(dá)高于對(duì)照組（25.98±5.18 vs.10.55±0.78，t=2.981，P=0.005），而抑制凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)低于對(duì)照組（5.05±0.73 vs.23.63±2.17，t=3.002，P=0.003），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3　討論

流行病學(xué)研究證實(shí)FGR與胎兒成人后的心血管疾病、高血壓、胰島素抵抗、2型糖尿病等密切相關(guān)[8]，并在腹主動(dòng)脈僵硬、動(dòng)脈順應(yīng)性降低、視網(wǎng)膜動(dòng)脈痙攣和內(nèi)皮功能障礙等血管畸形的發(fā)生中發(fā)揮重要作用[9]。在FGR環(huán)境中，器官的發(fā)育亦可受到影響，Barker等[10]發(fā)現(xiàn)處于缺乏營(yíng)養(yǎng)的宮內(nèi)環(huán)境，可使胎兒重要器官形態(tài)和功能發(fā)生改變，進(jìn)而增加高血壓和心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)。

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明孕期限制蛋白質(zhì)攝入可造成子代FGR以及腎單位數(shù)目降低[11]。本研究從人類FGR胎兒著手，對(duì)其腎臟發(fā)育進(jìn)行了研究，結(jié)果表明FGR組中，出生體質(zhì)量、腎臟體積、質(zhì)量及腎單位數(shù)目均顯著降低。這與之前的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果相一致。這種形態(tài)學(xué)改變可能對(duì)其發(fā)育和功能產(chǎn)生影響。

不良宮內(nèi)環(huán)境導(dǎo)致子代發(fā)生FGR，低出生體質(zhì)量致使腎臟體積減少，腎單位數(shù)目降低，但相關(guān)的發(fā)生機(jī)制仍未闡明。有動(dòng)物模型研究表明FGR子代的腎單位數(shù)目減少與腎臟細(xì)胞的凋亡改變有關(guān)。本研究探討了人類FGR胎兒腎單位數(shù)目減少的相關(guān)機(jī)制。在器官和組織發(fā)育過(guò)程中，細(xì)胞凋亡是一個(gè)重要過(guò)程，異常的細(xì)胞凋亡可導(dǎo)致器官形態(tài)和功能的改變[12]。同樣，在腎臟發(fā)育過(guò)程中，細(xì)胞過(guò)度死亡可引起腎單位受損，導(dǎo)致腎萎縮。本研究中FGR組凋亡細(xì)胞數(shù)目明顯增加，可能導(dǎo)致腎臟體積和質(zhì)量降低以及腎單位數(shù)目減少。Welham等[13]研究發(fā)現(xiàn)孕期低蛋白飲食大鼠的子代會(huì)發(fā)生高血壓及腎單位數(shù)目的減少，這可能與FGR環(huán)境細(xì)胞凋亡增加密切相關(guān)。

Thornburg等[11]也使用子宮胎盤灌注不良模型，證實(shí)了腎單位數(shù)目減少和腎臟凋亡的相關(guān)性。作者首先進(jìn)行了腎單位數(shù)目的對(duì)比來(lái)證實(shí)其減少與雙側(cè)子宮動(dòng)脈結(jié)扎誘導(dǎo)的FGR有關(guān)。然后，驗(yàn)證了凋亡是子宮胎盤灌注不良所致的腎單位數(shù)目減少的分子機(jī)制。他們發(fā)現(xiàn)在FGR腎臟中重要的存活因子Bcl-2 mRNA表達(dá)明顯減少，而死亡增強(qiáng)因子Bax表達(dá)增加，本研究與該研究有一致性，也發(fā)現(xiàn)促凋亡蛋白Bax表達(dá)明顯增加，抑制凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)顯著降低，從而發(fā)生胎兒腎臟凋亡的增加，導(dǎo)致腎單位數(shù)量的永久性降低，證實(shí)了腎臟凋亡和FGR間的內(nèi)在聯(lián)系。

然而，F(xiàn)GR環(huán)境導(dǎo)致細(xì)胞凋亡增加的分子機(jī)制尚不明確。Bcl-2蛋白通過(guò)抵抗多種形式的細(xì)胞死亡，延長(zhǎng)細(xì)胞壽命，使細(xì)胞數(shù)目不斷增加，是細(xì)胞凋亡過(guò)程中一個(gè)關(guān)鍵的抑制調(diào)節(jié)因子[14]，而Bax雖亦屬Bcl-2家族，但其功能與Bcl-2截然相反，其可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡并與Bcl-2發(fā)生寡聚化而抑制其活性[15-16]。細(xì)胞中的Bax蛋白不僅可自身形成同源二聚體，并易與Bcl-2蛋白形成異源二聚體，從而使Bcl-2失活。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)Bax蛋白表達(dá)相對(duì)增多時(shí)，Bax同源二聚體增多，促凋亡作用增強(qiáng)。

本研究表明FGR胎兒通過(guò)改變凋亡相關(guān)基因的表達(dá)來(lái)增加凋亡，研究發(fā)現(xiàn)FGR組Bcl-2的表達(dá)明顯下降，而Bax的表達(dá)明顯上升，這樣的基因表達(dá)可導(dǎo)致異常的細(xì)胞凋亡增加，從而使腎臟的形態(tài)學(xué)改變，影響其功能，進(jìn)而導(dǎo)致成年期疾病的發(fā)生。這與Plank等[17]研究結(jié)果相一致。FGR胎兒的腎臟凋亡明顯增加，導(dǎo)致腎單位數(shù)目降低，胎兒的腎臟體積減小，改變了腎臟的形態(tài)學(xué)發(fā)育。

綜上，本研究結(jié)果提示細(xì)胞凋亡在FGR胎兒腎臟發(fā)育過(guò)程中可能有重要作用，有助于為進(jìn)一步探討FGR的分子機(jī)制和成人期疾病的發(fā)病機(jī)制提供新的線索。

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[本文編輯王昕]

Effects of Fetal Growth Restriction on the Development of Kidney

WANG Yan-ping，WANG Guan，CUI Hong-yan，ZHANG Zhi-kun.Tianjin Central Hospital of Gynecology Obstetrics，Tianjin 300100，China Corresponding author：ZHANG Zhi-kun，E-mail：zyliu03@163.com

【Abstract】Objective：To investigate the effect of intrauterine environment of fetal growth restriction（FGR）on the development of fetal kidney.Methods：Renal specimens of 11 fetal growth restriction（FGR）cases and 12 non-FGR cases were collected from November 2009 to December 2011 in the department of obstetrics of Tianjin Central Hospital of Gynecology Obstetrics.The mass and volume were calculated first，and the apoptosis rate of cells was analyzed by TUNEL.In addition，the positive expression rate of Bcl-2 and Bax proteins in apoptotic cells were also detected.Results：Compared with the non-FGR group，the average volume，quality and number of renal units were significantly decreased in the FGR group（P＜0.01）,while the apoptosis rate of cells was significantly increased（P＜0.01）.The positive expression rate of pro-apoptotic protein Bax in the FGR group cells was significantly increased（P＜0.01），with the expression rate of anti-apoptotic gene Bcl-2 decreased（P＜0.01）after future detection.Conclusions：Our study indicates that increased apoptosis may effect human kidney development in FGR environment，which is helpful to provide new clues for further exploring the molecular mechanism of FGR and the pathogenesis of adult diseases.

【Keywords】Fetal growth retardation；Kidney；Apoptosis；Proto-oncogene proteins c-bcl-2；Proto-oncogene proteins

基金項(xiàng)目：天津市衛(wèi)生行業(yè)重點(diǎn)攻關(guān)項(xiàng)目（12KG128）

通信作者：張志坤，E-mail：zyliu03@163.com

收稿日期：（2015-09-06）