翟緒昭王廣彬趙亮濤曾海娟李建武丁承超宋春美劉箐

（1. 上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海 200093；2. 徐州綠健乳業(yè)有限責(zé)任公司，徐州 221006；3. 甘肅省蘭州大學(xué)第二醫(yī)院遺傳學(xué)研究室，蘭州 730030）

高通量生物分析技術(shù)及應(yīng)用研究進(jìn)展

翟緒昭1王廣彬2趙亮濤3曾海娟1李建武1丁承超1宋春美1劉箐1

（1. 上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海 200093；2. 徐州綠健乳業(yè)有限責(zé)任公司，徐州 221006；3. 甘肅省蘭州大學(xué)第二醫(yī)院遺傳學(xué)研究室，蘭州 730030）

基因組學(xué)、蛋白組學(xué)、代謝組學(xué)等研究的興起使得大量生物數(shù)據(jù)的快速獲取和分析變得更加重要。傳統(tǒng)的生物分析方法大多耗時(shí)、費(fèi)力，已無(wú)法滿足現(xiàn)代生命科學(xué)研究對(duì)海量生物信息的需要。高通量分析技術(shù)是快速獲取大量生物信息的重要手段。對(duì)微陣列芯片、微流控芯片、焦磷酸測(cè)序、熒光偏振免疫分析、量子點(diǎn)熒光免疫分析等高通量生物分析技術(shù)進(jìn)行了綜述，簡(jiǎn)述了近幾年高通量生物分析技術(shù)的研究重點(diǎn)和研究成果，并對(duì)其在食品安全、醫(yī)學(xué)等方面的應(yīng)用進(jìn)行了簡(jiǎn)要介紹。

高通量；芯片；免疫分析技術(shù)；食品安全

隨著基因組學(xué)、蛋白組學(xué)、代謝組學(xué)及生物大數(shù)據(jù)等研究的興起和深入，生物海量數(shù)據(jù)獲取對(duì)常規(guī)分析技術(shù)提出了挑戰(zhàn)，高通量分析（high throughput screening，HTS）是指同時(shí)對(duì)一個(gè)樣品中的多個(gè)指標(biāo)，或者對(duì)多個(gè)樣品中的一個(gè)指標(biāo)同步進(jìn)行并行分析，以在最短的時(shí)間內(nèi)獲得最多的生物信息的新型分析技術(shù)。與傳統(tǒng)分析方法相比，HTS具有高通量、并行性、微量化、自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn)。按照檢測(cè)原理分析靶標(biāo)的不同，HTS主要包括生物芯片、焦磷酸測(cè)序技術(shù)、熒光偏振免疫分析技術(shù)等，可用于食品安全檢測(cè)、醫(yī)學(xué)診斷、藥物篩選、植物育種、環(huán)境監(jiān)測(cè)、司法鑒定等領(lǐng)域。本文綜合國(guó)內(nèi)外HTS最新研究進(jìn)展，對(duì)HTS技術(shù)及應(yīng)用予以分析和評(píng)述。

1 HTS技術(shù)及研究進(jìn)展

1.1 微陣列芯片

微陣列芯片主要包括基因芯片、蛋白芯片、細(xì)胞芯片和組織芯片。主要由基片、基片固著物、結(jié)果報(bào)告系統(tǒng)、芯片掃描及分析軟件4部分組成?；牧现饕胁Ａ?、硅片、金屬片、塑料、凝膠、尼龍膜和微孔板等；基片固著物包括核酸探針或捕捉抗體；結(jié)果報(bào)告系統(tǒng)包括經(jīng)過(guò)熒光或酶標(biāo)記的核酸或抗體；芯片掃描儀及分析軟件是針對(duì)不同的生物芯片設(shè)計(jì)的對(duì)結(jié)果進(jìn)行讀取和分析的專用設(shè)備和軟件。

1.1.1 生物芯片基片 不同的基片材料會(huì)影響核酸或蛋白質(zhì)的結(jié)合能力、芯片的背景值、樣點(diǎn)均一性、信號(hào)強(qiáng)度等，近年來(lái)基片表面改性和新型基片材料的研發(fā)成為芯片研究的一大熱點(diǎn)。玻璃片和硅片是使用最普遍的固相載體，但成本高、制作過(guò)程復(fù)雜、易碎。為了克服這些問(wèn)題，Zhao等［1］研發(fā)出了用紙質(zhì)材料作為基片的生物芯片，然而紙質(zhì)生物芯片表面容易改性，通量低。尼龍膜、硝酸纖維素膜等主要利用吸附作用來(lái)連接蛋白質(zhì)，對(duì)保持相對(duì)自由的蛋白質(zhì)的活性有一定的優(yōu)勢(shì)，但容易造成非特異性吸附和蛋白質(zhì)的變性［2］。凝膠是一種具有三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的聚合物，具有良好的吸水性和生物相容性，能夠很好地保持蛋白質(zhì)的活性，水凝膠蛋白芯片已成功運(yùn)用于腫瘤標(biāo)記物的檢測(cè)和體外過(guò)敏診斷［3，4］。透明塑料由于其成本低、透明度高、柔韌性好、易于加工等優(yōu)點(diǎn)適合用于制作芯片，Jing等［5］研發(fā)了一種新型的用PC作為基片的芯片，具有低成本、制作簡(jiǎn)單、靈敏度高及可視化的特點(diǎn)。開(kāi)發(fā)出低成本、制作簡(jiǎn)單、背景值低、結(jié)合性能穩(wěn)定及能保持結(jié)合物活性的材料是未來(lái)芯片材料研究的重點(diǎn)。

1.1.2 芯片質(zhì)控系統(tǒng) 微陣列芯片是將大量探針?lè)肿诱R排列于固相載體上，然后與標(biāo)記的樣品分子進(jìn)行雜交反應(yīng)獲取檢測(cè)信息，探針在固相載體上的固定是芯片制作的關(guān)鍵步驟。目前，在芯片點(diǎn)樣過(guò)程中所用的緩沖液多為無(wú)色的碳酸鹽或磷酸鹽緩沖液，使得芯片在點(diǎn)樣后仍成無(wú)色狀態(tài)，無(wú)法在芯片使用前對(duì)樣點(diǎn)大小、樣點(diǎn)均一性、甚至是否有樣點(diǎn)進(jìn)行預(yù)判。為了解決這一問(wèn)題，有人在基因芯片的制作過(guò)程中對(duì)固定在芯片上的核酸進(jìn)行熒光標(biāo)記，不僅可對(duì)樣點(diǎn)進(jìn)行預(yù)判，而且可以對(duì)固定的核酸進(jìn)行準(zhǔn)確的定量［6，7］。Delehanty等［8］將此方法用于蛋白芯片，但是由于蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)比核酸復(fù)雜，此方法不僅加大了芯片的制作成本（需要用到芯片熒光掃描儀），而且熒光染料容易破壞蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)。生物染色劑通常不會(huì)破壞蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)且對(duì)核酸、蛋白質(zhì)等染色效果好，Desmet等［9］用1 mg/mL溴酚藍(lán)進(jìn)行樣點(diǎn)質(zhì)量控制，Qiu等［10］將麗春紅直接加入到蛋白芯片的點(diǎn)樣緩沖液中并對(duì)麗春紅的點(diǎn)樣濃度進(jìn)行了優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)了在芯片使用前對(duì)樣點(diǎn)的圓潤(rùn)均勻程度進(jìn)行預(yù)判。用直觀簡(jiǎn)單的方法實(shí)現(xiàn)對(duì)芯片的質(zhì)量控制對(duì)提高芯片檢測(cè)結(jié)果的可靠性和穩(wěn)定性意義重大。

1.1.3 芯片結(jié)果報(bào)告系統(tǒng) 芯片的檢測(cè)方法可分為兩種類型：依賴于各種標(biāo)記的間接法和直接非標(biāo)記法。對(duì)于間接法，標(biāo)記物的選擇對(duì)檢測(cè)結(jié)果的靈敏度有很大影響，常用的標(biāo)記物有酶、熒光染料、功能性磁珠、納米顆粒、生物素和膠體金等。Mavrogiannopoulou等［11］用鏈霉親和素/生物素標(biāo)記寡核苷酸來(lái)提高基因芯片的檢測(cè)靈敏度，結(jié)果顯示雜交信號(hào)增強(qiáng)了至少5倍，不僅靈敏度提高而且可以縮短PCR所需時(shí)間，加快了檢測(cè)效率。Kim等［12］用金納米顆粒標(biāo)記目標(biāo)DNA，用場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡成像和計(jì)算納米顆粒，納米粒子標(biāo)記的檢測(cè)靈敏度可達(dá)到1 pM，是熒光標(biāo)記的1 000倍。制作成本高、操作復(fù)雜是制約芯片發(fā)展的一個(gè)重要原因，李浩林等［13］采用可視化抗體宏陣列、酶標(biāo)抗體化學(xué)顯色等技術(shù)制作蛋白芯片，使檢測(cè)結(jié)果肉眼可見(jiàn)，不需要借助昂貴的儀器，大大降低了芯片制作成本，但是此方法檢測(cè)致病菌檢測(cè)限僅為105，檢測(cè)靈敏度還需要進(jìn)一步提高。對(duì)于直接法，即用物理傳感器記錄傳感器表面由分析物所引起的臨近介質(zhì)的某些物理特性（如電壓、折射率和質(zhì)量等）的變化，主要有表面等離子共振法、電化學(xué)分析方法和質(zhì)譜分析方法等。

1.2 微流控芯片

微流控芯片［14，15］是在微流路系統(tǒng)中處理微量液體（10-9-10-18L）的技術(shù)，用極少量的樣品和試劑就可完成檢測(cè)，已廣泛用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中，尤其適合在遭受自然災(zāi)害和資源缺乏的國(guó)家或地區(qū)進(jìn)行快速檢測(cè)，主要包括PCR芯片、流式芯片、毛細(xì)管電泳芯片、微電子芯片、色譜芯片及各類樣品制備芯片等。微流控芯片在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用主要包括3個(gè)部分：細(xì)胞、核酸和蛋白質(zhì)。相比于傳統(tǒng)的檢測(cè)方法，微流控芯片的優(yōu)點(diǎn)有［16］：（1）只需要微量的樣品和試劑，極大降低了檢測(cè)成本；（2）在微流控系統(tǒng)中流體始終保持層流，能夠準(zhǔn)確控制微流控系統(tǒng)中的流速、壓力和溫度等流動(dòng)變量；（3）微流控系統(tǒng)比表面積大，能夠在低濃度樣品中快速檢測(cè)出細(xì)胞、核酸或蛋白，這對(duì)于疾病的早期診斷非常重要。

用于制作微流控芯片的傳統(tǒng)材料有硅、玻璃和石英等，主要采用刻蝕加工。高分子聚合物由于成本低、易于加工、具有良好的生物相容性等優(yōu)點(diǎn)正日益成為微流控芯片的主要材料。目前，已有多種高分子聚合物材料被用于芯片制作，如聚酰胺（PA）、聚碳酸酯（PC）、聚對(duì)苯二甲酸丁二醇酯（PBT）、聚二甲基硅氧烷（PDMS）、聚甲基苯烯酸甲酯（PMMA）等。COC（環(huán)烯烴類共聚物）具有與PMMA相匹敵的光學(xué)性能以及具有高于PC的耐熱性，低吸濕性和良好的化學(xué)穩(wěn)定性，因而COC在微流控芯片領(lǐng)域有很好的應(yīng)用前景，Roy等［17］證明用 N-乙烯吡咯烷酮單體進(jìn)行改性的COC表面具有很高的粘結(jié)強(qiáng)度、表面濕潤(rùn)度和透明度以及很好的生物相容性。用聚合物材料制作微流控芯片常用的方法主要有熱壓成型法和注塑成型法，與熱壓成型相比，注塑成型能夠降低生產(chǎn)成本，提高芯片生產(chǎn)效率，適合大批量生產(chǎn)［18］。宋滿倉(cāng)等［19］采用UVLIGA技術(shù)制作成型微通道的型芯，設(shè)計(jì)制造了微流控芯片注塑模具并研究了各工藝參數(shù)對(duì)微通道復(fù)制度的影響，研究表明模具溫度是主要影響因素，注射速度和熔體溫度次之，由此形成的注塑工藝，對(duì)于寬80 μm、深50 μm 截面的微通道而言，可使微通道復(fù)制度由70%提高到90%。Matteucci等［20］用硅干法刻蝕、電鍍法和注塑成型相結(jié)合制作微流控芯片并對(duì)制作工藝進(jìn)行了優(yōu)化，此方法制作的芯片能夠很好地用于細(xì)胞捕獲和DNA延伸。微流控芯片已突破其在加工制作技術(shù)上的難關(guān)，以微流控芯片為核心的微全分析系統(tǒng)將有望取代很多生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)設(shè)備，走進(jìn)實(shí)驗(yàn)室和生活中。

1.3 焦磷酸測(cè)序技術(shù)

焦磷酸測(cè)序技術(shù)是基于合成測(cè)序的一種新的DNA測(cè)序方法，這種實(shí)時(shí)熒光DNA測(cè)序技術(shù)是采用四種酶（DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、熒光素酶和三磷酸腺苷雙磷酸酶）的酶聯(lián)級(jí)聯(lián)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，該技術(shù)已被證明適合用來(lái)進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性分析和DNA短序列的測(cè)序［21］。焦磷酸測(cè)序技術(shù)不需要凝膠電泳，也不需要對(duì)DNA樣品進(jìn)行任何形式的標(biāo)記或染色，具有高通量、低成本、直觀、高效的特點(diǎn)?？梢詰?yīng)用于單核苷酸多態(tài)性（SNP）分析、突變檢測(cè)、病原微生物快速檢測(cè)、法醫(yī)鑒定等。

雖然焦磷酸測(cè)序技術(shù)有上述很多優(yōu)點(diǎn)，但要提高信號(hào)的強(qiáng)度，確保測(cè)序的準(zhǔn)確性，還需要進(jìn)行進(jìn)一步的研究。如PCR參數(shù)的變化、測(cè)序引物的設(shè)計(jì)、樣品的制備、核苷酸的配比等。測(cè)序中引物設(shè)計(jì)的不合理會(huì)導(dǎo)致測(cè)序信號(hào)值過(guò)低或者非特異性背景值過(guò)高，最終導(dǎo)致測(cè)序失敗。葉卉等［22］系統(tǒng)研究了焦磷酸測(cè)序中引物的設(shè)計(jì)方法，得出提高PCR引物的多聚酶親和指數(shù)有利于增強(qiáng)擴(kuò)增效率與測(cè)序結(jié)果的信號(hào)峰強(qiáng)度，測(cè)序方向和dNTP 推注順序的不合理選擇會(huì)嚴(yán)重干擾部分SNP測(cè)序結(jié)果的判斷。Groth等［23］用載體連接和生物素標(biāo)記的方法制備焦磷酸測(cè)序單鏈DNA模板，單鏈DNA模板比雙鏈DNA模板用于焦磷酸測(cè)序效果更好。隨著對(duì)PCR參數(shù)的優(yōu)化，對(duì)測(cè)序引物的改進(jìn)以及對(duì)其他條件的改善，焦磷酸測(cè)序?qū)⒂懈叩撵`敏度和特異性。

1.4 熒光偏振免疫分析技術(shù)

熒光偏振免疫分析技術(shù)（FPIA）是一種競(jìng)爭(zhēng)性免疫分析方法，利用熒光素經(jīng)單一波長(zhǎng)的偏振光照射后能吸收光能并發(fā)出相應(yīng)的偏振熒光，偏振熒光的強(qiáng)弱程度與熒光分子的大小呈正相關(guān)。待測(cè)物中抗原濃度高時(shí)，熒光標(biāo)記抗原與抗體結(jié)合少，多呈游離狀態(tài)，分子小，熒光偏振程度低；反之，當(dāng)待測(cè)物中抗原濃度低時(shí)，熒光標(biāo)記抗原多與抗體結(jié)合，分子大，熒光偏振程度高［24］。

熒光偏振免疫分析技術(shù)具有操作簡(jiǎn)便，快速，自動(dòng)化，準(zhǔn)確性好，靈敏度高，高通量的優(yōu)點(diǎn)，只需將樣品、抗體和示蹤劑3種試劑混合后孵育幾分鐘甚至幾秒鐘就可以得到檢測(cè)結(jié)果。Sheng等［25］用FPIA進(jìn)行黃曲霉毒素的檢測(cè)，研究顯示完成微孔板上96種樣品的檢測(cè)總時(shí)間不超過(guò)5 min。無(wú)需將熒光標(biāo)記物與非標(biāo)記樣品進(jìn)行分離是FPIA的優(yōu)點(diǎn)之一，但是為了避免靈敏度的降低，需要一種快速、簡(jiǎn)單的純化方法有效去除試劑中影響檢測(cè)靈敏度的雜質(zhì)，Beloglazova等［26］研究了一種用FPIA檢測(cè)啤酒中黃曲霉毒素B1的方法并采用氨基修飾硅膠吸附劑固相萃取法對(duì)檢測(cè)樣品進(jìn)行純化，該純化方法簡(jiǎn)便、快速，有效去除了樣品中的雜質(zhì)，保證了檢測(cè)靈敏度。

1.5 量子點(diǎn)熒光免疫分析技術(shù)

作為一種發(fā)光半導(dǎo)體納米晶體，與傳統(tǒng)的有機(jī)熒光染料相比，量子點(diǎn)具有優(yōu)越的光學(xué)性能，寬且連續(xù)的吸收光譜，較大的斯托克位移和狹窄對(duì)稱的熒光發(fā)射光譜，因而被廣泛用作熒光免疫分析的標(biāo)記物用于致病菌，蛋白質(zhì)和小分子物質(zhì)的檢測(cè)，可以顯著提高檢測(cè)靈敏度和分辨率，在高通量免疫分析中具有重要作用。Zhu等［27］用一種基于雙色量子點(diǎn)和酶的免疫分析技術(shù)同時(shí)檢測(cè)牛奶中的多種化學(xué)物質(zhì)，但是只實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)，Song等［28］用量子點(diǎn)熒光免疫分析方法進(jìn)行牛奶中鏈霉素、四環(huán)素、青霉素的同時(shí)定性和定量檢測(cè)，檢測(cè)限達(dá)到5 pg/mL。

提高量子點(diǎn)的發(fā)光強(qiáng)度和抗體的穩(wěn)定性是量子點(diǎn)熒光免疫分析方法的研究重點(diǎn)之一，王洪江等［29］以巰基乙酸為穩(wěn)定劑，采用水相合成方法制備了CdS量子點(diǎn)，成功將單增李斯特菌抗體與CdS偶聯(lián)，偶聯(lián)后的IgG-CdS熒光強(qiáng)度為偶聯(lián)前的4倍。楊淑平等［30］研究發(fā)現(xiàn)谷胱甘肽穩(wěn)定劑優(yōu)于巰基乙酸，由于其碳鏈較長(zhǎng)，減少了量子點(diǎn)對(duì)抗體尤其是活性位點(diǎn)處空間構(gòu)型的影響，大大提高了抗體的穩(wěn)定性，與CdTe量子點(diǎn)相比，谷胱甘肽修飾的CdTe/Cds量子點(diǎn)熒光強(qiáng)度和穩(wěn)定性分別提高6倍和2倍以上。

1.6 多重PCR

多重PCR就是在同一PCR反應(yīng)體系中加入兩對(duì)或兩對(duì)以上的引物，同時(shí)對(duì)多個(gè)模板或同一個(gè)模板的不同區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增的PCR技術(shù)。其反應(yīng)原理、反應(yīng)試劑和操作過(guò)程與普通PCR相同。近年來(lái)，多重PCR廣泛應(yīng)用于動(dòng)植物病原檢測(cè)、食品安全性檢測(cè)、疾病診斷等領(lǐng)域中。多重PCR雖然具有簡(jiǎn)便、快速、經(jīng)濟(jì)、高效的特點(diǎn)，但目前也還存在一些問(wèn)題，如反應(yīng)靈敏度低、某一特定片段的優(yōu)先擴(kuò)增、容易形成引物二聚體等［31］。這些問(wèn)題需要通過(guò)不斷優(yōu)化反應(yīng)體系和反應(yīng)條件來(lái)解決。

在建立多重PCR體系時(shí)，多重PCR引物的設(shè)計(jì)是非常關(guān)鍵的，決定了多重PCR的成敗。主要需要考慮以下幾方面：（1）引物對(duì)之間是否有相近的Tm值，相近的Tm值能夠保證在同一退火溫度下實(shí)現(xiàn)對(duì)所有目的片段的同時(shí)擴(kuò)增；（2）是否會(huì)形成引物二聚體，引物二聚體的形成原因主要有體系中引物過(guò)多、體系中模板的量太少、引物設(shè)計(jì)過(guò)程中的誤差等；（3）引物之間的配比和濃度，一般多重PCR中每對(duì)引物的濃度都應(yīng)該低于單一引物PCR中的濃度；（4）各個(gè)擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度，擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度應(yīng)該有適當(dāng)?shù)貐^(qū)別，以便在電泳圖譜上能夠清楚地區(qū)分出各個(gè)目的條帶；（5）各個(gè)引物對(duì)的特異性。Liu等［32］在設(shè)計(jì)多重PCR引物時(shí)，設(shè)計(jì)的所有引物有相似的退火溫度（59-61℃），并對(duì)各個(gè)引物進(jìn)行仔細(xì)分析，避免形成引物二聚體，實(shí)現(xiàn)了對(duì)造成煙草叢頂病的4種常見(jiàn)病毒的同時(shí)檢測(cè)。

在優(yōu)化PCR反應(yīng)條件時(shí)，建議重點(diǎn)優(yōu)化退火溫度和延伸時(shí)間。退火溫度通常是根據(jù)解鏈溫度設(shè)定的，單一引物PCR中退火溫度為56-60℃時(shí)適合特異性擴(kuò)增，但多重PCR中溫度降低4-6℃更適于所有目的片段的擴(kuò)增［33］。Zong等［34］用多重逆轉(zhuǎn)錄PCR同時(shí)檢測(cè)甜櫻桃中常見(jiàn)的4種病毒（PNRSV、PDV、LChV-2和CGRMV），在對(duì)反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化時(shí)，用梯度PCR的方法摸索最佳退火溫度，結(jié)果顯示退火溫度為47-50℃時(shí)4個(gè)目的片段的基因擴(kuò)增效果最好。延伸時(shí)間需要根據(jù)模板核酸的長(zhǎng)度決定，多重PCR的延伸時(shí)間比普通PCR延伸時(shí)間稍長(zhǎng)，擴(kuò)增效果會(huì)更好［35］。

2 HTS的應(yīng)用

2.1 在食品安全檢測(cè)方面的應(yīng)用

食品安全問(wèn)題與每個(gè)人的生活息息相關(guān)，但近年來(lái)食品安全問(wèn)題日益凸出，為了保證食品的健康與安全，食品檢測(cè)技術(shù)急需向著快速、簡(jiǎn)便、高通量的方向發(fā)展。食品檢測(cè)主要包括食源性致病菌的檢測(cè)、轉(zhuǎn)基因食品的檢測(cè)、食物中農(nóng)獸藥殘留物的檢測(cè)等。高通量檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展為食品檢測(cè)提供了很多高效的檢測(cè)方法。

在食源性致病菌的檢測(cè)方面，許多研究者用各種HTS對(duì)食源性致病菌的檢測(cè)進(jìn)行了研究，在提高其檢測(cè)通量、降低其檢測(cè)成本的同時(shí)，提高了檢測(cè)的靈敏度和準(zhǔn)確性。現(xiàn)將部分檢測(cè)結(jié)果歸納，如表1所示。

表1 各種高通量分析技術(shù)對(duì)食源性致病菌的檢測(cè)

在轉(zhuǎn)基因食品的檢測(cè)方面，Zhou等［42］用多重PCR與基因芯片相結(jié)合的方法檢測(cè)草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆，當(dāng)轉(zhuǎn)基因作物含量為0.5%時(shí)仍可以檢驗(yàn)出來(lái)，具有很高的靈敏度和準(zhǔn)確性。趙胤澤和汪琳等［43］設(shè)計(jì)了能同時(shí)檢測(cè)3種轉(zhuǎn)基因成分的蛋白芯片，并具有較高的靈敏性、特異性和可靠性。Obeid等［44］建立了一個(gè)微流控芯片系統(tǒng)用來(lái)檢測(cè)轉(zhuǎn)基因大豆，僅需60 s 即可完成分析，產(chǎn)物檢出限低至0.1%，相當(dāng)于20個(gè)拷貝數(shù)。

在農(nóng)獸藥殘留的檢測(cè)方面，劉楠等［45］設(shè)計(jì)了一種可同時(shí)檢測(cè)4種獸藥、3種農(nóng)藥的液相芯片，整個(gè)檢測(cè)過(guò)程僅耗時(shí)1-2 h。博奧生物技術(shù)有限公司構(gòu)建了一種能夠同時(shí)檢測(cè)9種獸藥殘留的蛋白芯片平臺(tái)，在3-5 h內(nèi)能檢測(cè)出豬肉等組織中的磺胺類、恩諾沙星、氯霉素、鏈霉素類等9種獸藥殘留量，已應(yīng)用于多個(gè)地區(qū)的出入境檢驗(yàn)檢疫部門(mén)［46］。郭紅斌等［47］成功制作出一種用于檢測(cè)有機(jī)磷農(nóng)藥的聚二甲基硅氧烷（PDMS）微流控傳感器，簡(jiǎn)單的制備工藝和便攜式的器件為集成化的有機(jī)磷農(nóng)藥檢測(cè)裝置提供了低成本和大批量生產(chǎn)的選擇途徑。 Xu等［48］用熒光偏振免疫分析技術(shù)進(jìn)行蔬菜和水樣品中的有機(jī)磷農(nóng)藥類的檢測(cè)，能夠同時(shí)檢測(cè)5種有機(jī)磷農(nóng)藥，檢測(cè)限為10 ng/mL，檢測(cè)時(shí)間不超過(guò)10 min。

高通量檢測(cè)技術(shù)在食品檢測(cè)中的應(yīng)用大大加快了食品檢測(cè)的速度，與傳統(tǒng)檢測(cè)方法相比具有高通量、快速、靈敏度高的特點(diǎn)，但是還存在檢測(cè)結(jié)果不夠穩(wěn)定，檢測(cè)通量有待進(jìn)一步提高等問(wèn)題，若要進(jìn)一步取代傳統(tǒng)檢測(cè)方法的地位還需要往更簡(jiǎn)便、更高效、更穩(wěn)定的方向發(fā)展。

2.2 在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用

生物醫(yī)學(xué)的發(fā)展使人們逐漸認(rèn)識(shí)到疾病的發(fā)生與發(fā)展與基因的變化和基因的表達(dá)水平密切相關(guān)，從基因和蛋白質(zhì)水平去研究疾病更能揭示疾病的本質(zhì)。高通量檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展為人們從分子生物學(xué)水平研究醫(yī)學(xué)提供了快速、高效、可靠的檢測(cè)手段，尤其是在于疾病的診斷和預(yù)警、藥物的研究與開(kāi)發(fā)等方面具有廣闊的應(yīng)用前景。

在疾病診斷和預(yù)警方面，高通量檢測(cè)技術(shù)主要可用于傳染病、自身免疫性疾病、腫瘤的檢測(cè)。高通量分析技術(shù)因其快速、高效的特點(diǎn)對(duì)疾病的早期預(yù)防、快速診斷有重要意義。近年來(lái)，高通量分析技術(shù)應(yīng)用于疾病的研究有很多，現(xiàn)將部分歸納，如表2所示。

藥物篩選是指用適當(dāng)?shù)姆椒▽?duì)天然物質(zhì)或人工合成的化合物進(jìn)行藥物活性檢測(cè)，篩選出藥靶用于新藥的開(kāi)發(fā)。傳統(tǒng)的藥物篩選多采用動(dòng)物模型法，具有實(shí)驗(yàn)存在種屬差異，周期長(zhǎng)，成本高等缺點(diǎn)。高通量分析技術(shù)用于藥物的篩選具有分析速度快、高通量、所用試劑量少等諸多優(yōu)勢(shì)，克服了傳統(tǒng)藥物篩選方法的不足。Li等［56］用基因芯片來(lái)探究中藥的機(jī)制，尋找中藥的藥靶以及預(yù)測(cè)其治療潛力，分析所開(kāi)發(fā)藥物的安全性。鄭永煥等［57］設(shè)計(jì)了一種能夠?qū)崿F(xiàn)細(xì)胞區(qū)域分布培養(yǎng)以及能夠?qū)ξ⒘黧w進(jìn)行操控的微流控芯片，通過(guò)對(duì)芯片3種共培養(yǎng)細(xì)胞活性的檢測(cè)和藥物伊立替康（CTP-11）對(duì)肝癌細(xì)胞的濃度梯度刺激等實(shí)驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證該芯片在細(xì)胞研究和藥物篩選等方面的可行性。

高通量分析技術(shù)為疾病的快速、有效診斷以及藥物的高效、低成本篩選提供了很多有效的方法，促進(jìn)了生物醫(yī)學(xué)在分子水平的研究，加深了人們對(duì)疾病的發(fā)生過(guò)程以及藥物的作用機(jī)制的認(rèn)識(shí)，有利于研究者更好地治療疾病、開(kāi)發(fā)藥物。

2.3 在其他方面的應(yīng)用

除了上述兩方面，高通量還廣泛用于其他領(lǐng)域。在植物學(xué)方面，Li等［58］用基因芯片分析了青梅和杏的差異表達(dá)基因，找出兩個(gè)基因在表達(dá)水平上有顯著差異，為說(shuō)明這兩種果實(shí)在發(fā)育和成熟過(guò)程中的品質(zhì)差異提供了詳細(xì)的資料。譚小勇等［59］在建立各種病毒單項(xiàng)PCR 技術(shù)的基礎(chǔ)上，通過(guò)優(yōu)化多重PCR 反應(yīng)條件，建立了能同時(shí)檢測(cè)香蕉中3 種病毒的多重PCR 檢測(cè)體系，對(duì)其靈敏度測(cè)試結(jié)果顯示從相當(dāng)于或大于10-2mg 感病植物組織中均能檢測(cè)到這3 種病毒。在土壤學(xué)方面，井趙斌等［60］用焦磷酸測(cè)序技術(shù)對(duì)黃土區(qū)不同封育時(shí)期典型草地土壤真核生物多樣性進(jìn)行了研究。結(jié)果表明不同封育時(shí)期草地真菌群落組成具有各自的優(yōu)勢(shì)菌群，動(dòng)物群落組成僅在種水平存在差異，可以結(jié)合土壤微生物和土壤養(yǎng)分恢復(fù)時(shí)間的閾值對(duì)封育草地進(jìn)行合理利用。在司法鑒定方面，Divne等［61］用焦磷酸測(cè)序技術(shù)進(jìn)行STR（short tandem repeats）標(biāo)記物的分析，這在法醫(yī)DNA分析中非常有用。上海市公安局物證鑒定中心利用蛋白芯片技術(shù)建立了一種快速、高通量的毒品定量檢測(cè)方法，檢測(cè)結(jié)果與GM-MS儀器比較后總的相關(guān)性在88%以上，靈敏度高達(dá)99%?？梢?jiàn)，蛋白芯片是一種大量、快速檢測(cè)毒品的有效手段［62］。

表2 各種高通量分析技術(shù)應(yīng)用于疾病診斷

3 結(jié)語(yǔ)

高通量生物分析技術(shù)對(duì)于現(xiàn)代食品生物醫(yī)藥領(lǐng)域的發(fā)展意義重大，加快了檢測(cè)效率、降低了檢測(cè)成本、簡(jiǎn)化了檢測(cè)過(guò)程，為致病菌的快速檢測(cè)、疾病的提早預(yù)防、食品安全的有效保障等提供了多種全新、高效的檢測(cè)方法。近年來(lái)，高通量分析技術(shù)主要朝著微量化、自動(dòng)化、高靈敏度、高通量、低成本的方向發(fā)展。雖然目前還存在結(jié)果穩(wěn)定性不好、檢測(cè)靈敏度不夠、背景值過(guò)高、檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)不統(tǒng)一等問(wèn)題，但隨著眾多研究者們不斷對(duì)各種HTS技術(shù)進(jìn)行優(yōu)化和改進(jìn)，高通量生物分析技術(shù)將為未來(lái)食品和生物醫(yī)藥領(lǐng)域的發(fā)展作出巨大的貢獻(xiàn)。

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（責(zé)任編輯 狄艷紅）

An Overview of High Throughput Biological Screening Methods and Its Application

ZHAI Xu-zhao1WANG Guang-bin2ZHAO Liang-tao3ZENG Hai-juan1LI Jian-wu1DING Cheng-chao1SONG Chun-mei1LIU Qing1
（1. School of Medical Instrument and Food Engineering，University of Shanghai for Science and Technology，Shanghai 200093；2. Xuzhou Lüjian Dairy Co.，Ltd，Xuzhou 221006；3. Laboratory of Medical Genetics，the Second Hospital of Lanzhou University，Lanzhou 730030）

The emergence of genomics，proteomics，metabolomics and other molecular biology studies makes the rapid attainment and assessment of large amounts of biological data become extremely important. The traditional detection methods are time-consuming and laborious，and cannot satisfy the needs of contemporary biological science research for massive biological information. High Throughput Screening（HTS）methods are significant means of quick attainment of massive biological information. This paper will make an overview of microarray chip，microfluidic chip，pyrosequencing，fluorescence polarization immunoassay，quantum dot fluorescence immunoassay and multiple PCR，outline research focus and research results of HTS methods in recent years，and briefly introduce its application in food safety，medicine and other fields.

high throughput；chip；immunoassay；food safety

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.06.007

2015-08-31

上海市科委高校能力建設(shè)項(xiàng)目（13430502400），“科技創(chuàng)新行動(dòng)計(jì)劃” 長(zhǎng)三角科技聯(lián)合攻關(guān)領(lǐng)域項(xiàng)目（15395810900），乳制品生產(chǎn)體系致病菌快速檢測(cè)（3A15308006）

翟緒昭，女，碩士研究生，研究方向：食源性致病菌快速檢測(cè)；E-mail：huzhxzh@126.com

劉箐，男，博士，教授，研究方向：食源性致病菌致病機(jī)理及快速檢測(cè)技術(shù)；E-mail：liuq@usst.edu.cn