程慶靈 王敬強(qiáng)

（復(fù)旦大學(xué) 遺傳工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200438）

同源異型框蛋白Msx1的兩個(gè)新的磷酸化位點(diǎn)的鑒定

程慶靈 王敬強(qiáng)

（復(fù)旦大學(xué) 遺傳工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200438）

同源異型框蛋白Msx1的同系物Msx2中已鑒定出磷酸化修飾位點(diǎn)，并且發(fā)揮著重要的生物學(xué)功能。但是對(duì)Msx1的磷酸化修飾情況還不清楚，為了對(duì)Msx1的磷酸化修飾情況進(jìn)行研究。利用生物信息學(xué)的方法對(duì)Msx1的磷酸化修飾位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)，進(jìn)一步利用免疫沉淀和質(zhì)譜技術(shù)對(duì)其進(jìn)行具體實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。C2C12細(xì)胞中的Msx1蛋白復(fù)合物經(jīng)胰蛋白酶消化后，通過(guò)高效液相色譜和質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行分離和分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩個(gè)新的磷酸化修飾位點(diǎn)，分別是152位的絲氨酸和160位的絲氨酸，而且兩個(gè)磷酸化位點(diǎn)在人和小鼠中是高度保守的。進(jìn)一步，制備針對(duì)這兩個(gè)磷酸化位點(diǎn)的特異性磷酸化抗體。磷酸化位點(diǎn)的鑒定以及特異性抗體的獲得為進(jìn)一步研究Msx1的生物學(xué)功能提供了良好的條件。

同源異型框蛋白；Msx1；磷酸化修飾；質(zhì)譜鑒定

蛋白質(zhì)翻譯后修飾（post translation modification，PTM）是目前蛋白研究中比較受歡迎的一個(gè)重要研究方向，其中磷酸化修飾在生物體中是一種最普遍最重要的調(diào)控方式，幾乎調(diào)節(jié)著生命活動(dòng)的整個(gè)過(guò)程，包括細(xì)胞的增殖、凋亡和分化、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、基因表達(dá)、細(xì)胞周期以及其他生命活動(dòng)過(guò)程［1-3］。據(jù)統(tǒng)計(jì)，哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)有1/3以上的蛋白質(zhì)被磷酸化修飾［4］。真核生物中磷酸化主要發(fā)生在絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸等殘基，其比例大概為1 800∶200∶1［5］。大多數(shù)磷酸化的蛋白質(zhì)有一個(gè)以上的磷酸化位點(diǎn)，并且生物體內(nèi)磷酸化修飾是一個(gè)動(dòng)態(tài)過(guò)程，同一種蛋白在不同的時(shí)間和空間時(shí)刻發(fā)生著磷酸化與去磷酸化的交替活動(dòng)。因此，生物體內(nèi)磷酸化修飾的蛋白質(zhì)的鑒定和定量分析對(duì)更好的了解許多生命活動(dòng)的發(fā)生發(fā)展有重要的意義［6］。

同源異型框基因廣泛存在于真核生物中，其結(jié)構(gòu)中含有一個(gè)高度保守的同源異型盒，編碼一段含有60個(gè)氨基酸殘基的蛋白結(jié)構(gòu)域，稱為同源異型結(jié)構(gòu)域。作為一類重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，在胚胎發(fā)育中對(duì)組織和器官的形成具有重要的調(diào)控作用。核磁共振及晶體學(xué)的研究表明，同源異型結(jié)構(gòu)域可形成螺旋—轉(zhuǎn)折—螺旋結(jié)構(gòu)，它可與DNA特異性結(jié)合。同源異型結(jié)構(gòu)蛋白（homeodomain protein）作為轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)與靶基因調(diào)控序列相結(jié)合來(lái)調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄。有些同源異型結(jié)構(gòu)域蛋白之間具有協(xié)同作用，其不同組合方式可影響其活性［7］。

Msx1作為哺乳動(dòng)物中典型的同源異型框基因在胚胎發(fā)育過(guò)程的多種組織和器官中表達(dá)，包括四肢、顱面的衍生物、神經(jīng)管和乳腺等［8-11］，對(duì)早期胚胎發(fā)育起到重要的調(diào)控作用。Msx1基因敲除小鼠顯示顱面發(fā)育缺陷，包括腭裂、牙齒畸形、顱骨和鼻骨發(fā)育缺陷［12］，以及間腦發(fā)育缺陷［13］。Msx1基因的過(guò)量表達(dá)同樣會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞分化的缺陷，Msx1轉(zhuǎn)基因小鼠出現(xiàn)乳腺增生［14］。Msx1基因突變則造成人類牙齒和骨骼等發(fā)育異常以及人類遺傳相關(guān)疾?。ǔ錾毕荩┤绱剑窳选itkop綜合癥以及缺牙癥［15］。發(fā)育過(guò)程中Msx1作為轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)調(diào)控其靶標(biāo)基因來(lái)介導(dǎo)上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞之間的信號(hào)傳導(dǎo)，負(fù)向調(diào)控細(xì)胞分化［16-19］。Msx1只在未分化的前體細(xì)胞中表達(dá)，抑制前體細(xì)胞的終端分化［19，20］。前期研究表明，在肢體發(fā)育中Msx1的抑制性靶標(biāo)基因主要分布在細(xì)胞核核周，而活化性靶標(biāo)基因則均勻分布在細(xì)胞核內(nèi)。在胚胎發(fā)育中Msx1和PRC2復(fù)合物（Ezh2復(fù)合物）在肢體（limb bud）和神經(jīng)管（neural tube）高表達(dá)，但是Msx1只富集在肢體細(xì)胞核核周并招募PRC2復(fù)合物到細(xì)胞核核周［21］，重新分布組蛋白標(biāo)記物H3K27me3到細(xì)胞核核周，最終發(fā)揮轉(zhuǎn)錄抑制作用［21］。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，Msx1招募甲基化轉(zhuǎn)移酶G9a到其靶標(biāo)基因并產(chǎn)生抑制性標(biāo)記H3K9me2，抑制肌肉細(xì)胞分化［22］。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，Msx1和一系列轉(zhuǎn)錄因子如Ezh2、G9a、PIAS1等形成蛋白復(fù)合物，發(fā)揮生物學(xué)作用［19，21，22］。

Msx1的翻譯后修飾可能對(duì)Msx1在發(fā)育中的生物功能起著重要的調(diào)控作用。本研究以同源異性框蛋白Msx1的翻譯后修飾為切入點(diǎn)，利用生物信息學(xué)和生物質(zhì)譜學(xué)對(duì)其進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)兩個(gè)新的磷酸化修飾位點(diǎn)，為進(jìn)一步研究Msx1的生物學(xué)功能以及磷酸化修飾的動(dòng)態(tài)調(diào)控在細(xì)胞分化過(guò)程中的作用奠定了良好的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 高保真聚合酶，T4連接酶，Xho I、BamH I限制性內(nèi)切酶，dNTP等（TaKaRa），甲醇、無(wú)水乙醇、氯化鈉等生化試劑（國(guó)藥），10 cm培養(yǎng)皿、6孔細(xì)胞培養(yǎng)板購(gòu)自上海WHB公司，DMEM培養(yǎng)基，胎牛血清（FBS）、胰酶/EDTA、Opti-MEM、Lipofectamine2000購(gòu)自Life公司。序列級(jí)胰蛋白酶（trypsin）購(gòu)于德國(guó)Boehringer Mannheim GmbH公司，乙腈為美國(guó)Fisher Scientific公司產(chǎn)品，三氟乙酸（TAF）為Merk公司產(chǎn)品。所用水為Mili-Q水。1.1.2 質(zhì)粒和細(xì)胞系 pcDNA3-Flag-Msx1，pLERSIRES-GFP-Flag-Msx1［17，18］，pcDNA3表達(dá)質(zhì)粒用來(lái)做瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，pLERS-IRES-GFP用來(lái)生產(chǎn)逆轉(zhuǎn)錄病毒。C2C12細(xì)胞和PhE細(xì)胞來(lái)源于ATCC。

1.1.3 引物 Msx1（S152A）-F：5'-TGG ATG CAG AGT CCC CGC TTC GCC CCG CCC CCA GCC AGA CGG CTG-3'；Msx1（S152A）-R：5'-CAG CCG TCT GGC TGG GGG CGG GGC GAA GCG GGG ACT CTG CAT CCA-3'；Msx1（S160A）-F：5'-CCG CCC CCA GCC AGA CGG CTG GCT CCC CCA GCA TGC ACC CTA CGC-3'；Msx1（S160A）-R：5'-GCG TAG GGT GCA TGC TGG GGG AGC CAG CCG TCT GGC TGG GGG CGG-3'。

1.2 方法

1.2.1 突變體質(zhì)粒的構(gòu)建 以pcDNA3-Flag-Msx1質(zhì)粒為模板，用Primer Premier 5軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，PCR擴(kuò)增F-Flag-Msx1（S152A）和R-Flag-Msx1（S152A） 片 段；F-Flag-Msx1（S160A） 和R-Flag-Msx1（S152A）片段。引物由蘇州金唯智公司合成，序列如上。PCR的參數(shù)設(shè)置為：98℃，預(yù)變性30 s；98℃變性10 s，58℃退火15 s，72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min。膠回收F端PCR產(chǎn)物；同樣程序進(jìn)行PCR，膠回收R端PCR產(chǎn)物；以F端和R端PCR產(chǎn)物為模板，SP6和T7為引物進(jìn)行PCR，最后膠回收PCR產(chǎn)物，用BamH I和Xho I分別酶切PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和pcDNA3載體?；厥誅NA片段，并用T4連接酶16℃連接過(guò)夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，在氨芐青霉素（終濃度50 μg/mL）的LB平板中培養(yǎng)過(guò)夜后，挑選菌落抽提質(zhì)粒進(jìn)行酶切和測(cè)序鑒定。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) C2C12細(xì)胞在DMEM培養(yǎng)基（含10% FBS）中，37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞生長(zhǎng)接近75%時(shí)，0.05%胰酶消化，吹散并加新鮮培養(yǎng)基傳代。

1.2.3 構(gòu)建Msx1過(guò)表達(dá)的C2C12細(xì)胞 （1）按照15%-25%密度接種PhE 細(xì)胞于10 cm細(xì)胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)過(guò)夜。（2）將12 μg質(zhì)粒DNA稀釋于0.8 mL Opti-MEM中，混勻，室溫放置5 min；另將30 μL Lipofectamine2000稀釋于0.8 mL Opti-MEM中，混勻，室溫放置5 min。（3）將Lipofectamine2000稀釋液滴入DNA 稀釋液中，混勻，室溫放置20-30 min。（4）吸去PhE 細(xì)胞的培養(yǎng)液，補(bǔ)入6.4 mL Opti-MEM。（5）將Lipofectamine2000與DNA 混合液輕柔混勻，緩慢逐滴加入PhE 細(xì)胞上，輕柔晃勻。（6）37℃，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)4-6 h，將轉(zhuǎn)染后細(xì)胞上清吸棄，1×PBS洗一遍，補(bǔ)入10 mL 新鮮DMEM（含10%胎牛血清）。（7）37℃，5% CO2培養(yǎng)24 h，檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。換成含有puromycin的DMEM進(jìn)行篩選2 d。（8）第3天，吸去PhE 細(xì)胞的培養(yǎng)液，并用1×PBS洗一遍，補(bǔ)入10 mL 新鮮DMEM（含10%胎牛血清）。同時(shí)按照5%-10%細(xì)胞密度接種C2C12細(xì)胞于10 cm 細(xì)胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)過(guò)夜。（9）第4天，用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞，熒光效率幾乎達(dá)到100%，將PhE中的病毒用0.45 μm的濾頭過(guò)濾到50 mL離心管中，加入2 mL新鮮DMEM，并加入 12 μL Polybrane（8 mg/mL），終濃度為8 μg/mL，混合均勻。吸掉C2C12細(xì)胞的培養(yǎng)基，將上述混合好的病毒液緩緩加入C2C12細(xì)胞中。（10）37℃，5% CO2培養(yǎng)24 h，觀察感染效率，并重復(fù)前一天操作過(guò)程。（11）37℃，5% CO2培養(yǎng)，等細(xì)胞長(zhǎng)到90%左右收集細(xì)胞用于后期實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 免疫沉淀 用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞兩次，最后一次吸干PBS，加入適量含蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解緩沖液（1×RIPA buffer，Protease inhibitor cocktail），冰上裂解30 min，細(xì)胞裂解液于4℃，最大轉(zhuǎn)速離心10 min后取上清；取少量裂解液以備Western blot分析。分別取2 mL protein A 瓊脂糖珠和2 mL Flag Bead（Sigma A-2220），用適量裂解緩沖液洗3 次，每次800×g離心3 min；將預(yù)處理過(guò)的40 μL protein A瓊脂糖珠（Sigma）加入到剩余裂解液中，4℃緩慢搖晃1 h，在4℃ 以800×g 速度離心3 min，將上清轉(zhuǎn)移到新的EP管中，加入60 μL預(yù)處理過(guò)的Flag Bead（Sigma A-2220），4℃緩慢搖晃孵育4 h。免疫沉淀反應(yīng)后，在4℃ 以800×g 速度離心3 min，將瓊脂糖珠離心至管底，將上清小心吸去，瓊脂糖珠用1 mL裂解緩沖液洗3-4次；最后根據(jù)蛋白濃度加入相應(yīng)體積的2×SDS 上樣緩沖液，沸水煮5 min；SDS-PAGE，Western blotting。

1.2.5 質(zhì)譜 將位于33 kD處的蛋白染色條帶切下，在脫色緩沖液（25 mmol/L NH4HCO3，50%（V/V）乙腈）中脫色直至藍(lán)色消失將脫色后的凝膠條帶在2%（W/V）二硫蘇糖醇溶液中還原30 min，再加到2.5%（W/V）碘乙酰胺溶液中反應(yīng)60 min，使游離的巰基全部烷基化將膠條用乙腈脫水后，加入新配制的測(cè)序級(jí)的胰蛋白酶的50 mmol/L NH4HCO3溶液，在37℃反應(yīng)過(guò)夜次日加入適量10%甲酸終止反應(yīng)，離心取上清液再用含有10%乙腈的25 mmol/L NH4HCO3溶液從膠條中反復(fù)抽提3次合并3次抽提液，并與初始的上清液混合，即得到蛋白的酶解多肽混合物，凍干后20℃保存。所有干燥的多肽樣品均溶解在緩沖液A（0.1%甲酸99%水+1%乙腈+0.1%甲酸）中，再經(jīng)C18反相毛細(xì)管色譜柱（100 mm×0．17 mm）分離以0.1%甲酸和乙腈為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，洗脫梯度為5%-40%緩沖液B（B：99%乙腈+1%水+0.1%甲酸），洗脫時(shí)間為180 min，流速為0.25 μL/min，經(jīng)毛細(xì)管反相色譜洗脫出的多肽應(yīng)用LTQ Orbitrap質(zhì)譜分析，質(zhì)核比檢測(cè)范圍為400-2 000 amu應(yīng)用數(shù)據(jù)依賴方式進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描，每個(gè)全掃描后進(jìn)行5個(gè)二級(jí)掃描，碰撞能量為35%，動(dòng)態(tài)排除時(shí)間為2 min。

1.2.6 磷酸化抗體的制備 將合成的單磷酸化多 肽1（C-QSPRFpSPPPAR-NH2）、 非 磷 酸 化多 肽1（C-QSPRFSPPPAR-NH2）、 單 磷 酸 化 多肽2（C-PARRLpSPPAC-NH2）、非磷酸化多肽2（C-PARRLSPPAC-NH2）分別注射兔子，并且分別使用單磷酸化多肽及非磷酸化多肽制備親和純化柱，對(duì)磷酸化特異性抗體進(jìn)行純化，制備針對(duì)兩個(gè)位點(diǎn)的特異性抗體。

2 結(jié)果

2.1 Msx1磷酸化位點(diǎn)的生物信息學(xué)預(yù)測(cè)

鑒于同源異型框蛋白Msx1在生物體發(fā)生和發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用，因此Msx1的翻譯后修飾尤其是磷酸化修飾必然能夠影響其功能的發(fā)揮。首先利用磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)軟件對(duì)Msx1的蛋白序列（圖1-A）進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，發(fā)現(xiàn)其有21個(gè)潛在的磷酸化位點(diǎn)，其中有15個(gè)絲氨酸，5個(gè)蘇氨酸和1個(gè)酪氨酸分別被磷酸化，如圖1-C所示。圖1-B 中顯示的兩個(gè)磷酸化位點(diǎn)處于Msx1的同源結(jié)構(gòu)域中。對(duì)上述潛在的磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行序列分析，發(fā)現(xiàn)絲氨酸和蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)前后6個(gè)氨基酸殘基是有區(qū)別的，但是都具有一定的保守性，該結(jié)果說(shuō)明這兩種磷酸化位點(diǎn)的激酶識(shí)別位點(diǎn)是不同的。蛋白質(zhì)翻譯后修飾大多數(shù)都是由酶介導(dǎo)催化，預(yù)測(cè)結(jié)果表明是由不同的激酶對(duì)這兩個(gè)位點(diǎn)磷酸化的發(fā)生進(jìn)行了催化，分別是cdc2和ATM、PKA和IKK。

圖1 Msx1中磷酸化位點(diǎn)的預(yù)測(cè)

2.2 磷酸化位點(diǎn)的質(zhì)譜鑒定

為了證實(shí)Msx1蛋白在小鼠C2C12細(xì)胞中的磷酸化狀態(tài)和預(yù)測(cè)結(jié)果是吻合的，首先在C2C12細(xì)胞中過(guò)表達(dá)含有Flag標(biāo)簽的Msx1質(zhì)粒，裂解C2C12細(xì)胞，用SDS-PAGE進(jìn)行檢測(cè)，取其中一塊凝膠33 kD處IP膠塊用來(lái)做質(zhì)譜鑒定，另一塊利用Western blot的方法和Flag抗體進(jìn)行檢測(cè)，如圖2所示。

圖2 免疫共沉淀Msx1蛋白的SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果

質(zhì)譜鑒定結(jié)果如圖3所示，圖3-A中紅色肽段為質(zhì)譜鑒定出來(lái)的Msx1肽段，藍(lán)色圈里的是含有絲氨酸152位和絲氨酸160位的磷酸化肽段位置。質(zhì)譜數(shù)據(jù)中有兩處荷質(zhì)比變化明顯的峰，分別包含在肽段FpSPPPARR和RLpSPPACTLR中，如圖3-B和3-C的二級(jí)波譜圖所示，這兩處變化正是由于絲氨酸152和絲氨酸160位的磷酸基團(tuán)引起的。

2.3 磷酸抗體的制備及其驗(yàn)證

為了進(jìn)一步證實(shí)這兩個(gè)磷酸化位點(diǎn)的存在，合成單磷酸化多肽1（C-QSPRFpSPPPAR-NH2）、非磷酸化多肽1（C-QSPRFSPPPAR-NH2）、單磷酸化多肽2（C-PARRLpSPPAC-NH2）、非磷酸化多肽2（C-PARRLSPPAC-NH2）分別注射兔子，制備針對(duì)兩個(gè)位點(diǎn)的特異性抗體，采用Western blot方法，利用特異性抗體檢測(cè)了第152位和第160位絲氨酸的磷酸化狀態(tài)，結(jié)果（圖4）同樣證實(shí)Msx1在這兩個(gè)位點(diǎn)是磷酸化的，并且這兩個(gè)位點(diǎn)突變成丙氨酸后則不能被磷酸化。

2.4 Msx1磷酸化位點(diǎn)的高度保守性

人和小鼠高覆蓋率的基因組已被測(cè)序，而且同源異型框基因還是一類高度保守的基因家族，為了證實(shí)這兩個(gè)磷酸化位點(diǎn)在二者之間是否有高度的保守性，利用NCBI將蛋白序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果（圖5）表明兩個(gè)磷酸化位點(diǎn)具有高度保守性。此外，利用生物信息學(xué)分析了人的蛋白序列，結(jié)果顯示這兩個(gè)位點(diǎn)也是磷酸化的。

3 討論

蛋白質(zhì)磷酸化修飾是生物體內(nèi)一類十分重要的翻譯后修飾，快速鑒定出蛋白磷酸化修飾位點(diǎn)成為研究磷酸化修飾的關(guān)鍵之處，本研究首先利用預(yù)測(cè)軟件對(duì)Msx1磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)，只需要直接輸入蛋白的氨基酸序列便可以進(jìn)行磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)，方便快捷，避免繁瑣的實(shí)驗(yàn)操作，為磷酸化位點(diǎn)的確定提供了一定的參考依據(jù)。但是預(yù)測(cè)軟件只是根據(jù)蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，而生物體內(nèi)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)復(fù)雜多樣，因此Msx1磷酸化的確定，還必須通過(guò)充分的實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證。本實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，除了Msx1，細(xì)胞裂解液中還含有其他蛋白成分，質(zhì)譜分析對(duì)磷酸化肽段純度要求較高，然而免疫共沉淀能夠使蛋白富集，從而可以得到相對(duì)純化的Msx1，這有利于對(duì)Msx1的質(zhì)譜鑒定。通過(guò)質(zhì)譜對(duì)Msx1進(jìn)行分析鑒定，發(fā)現(xiàn)蛋白中有潛在的磷酸化修飾肽段，蛋白質(zhì)譜學(xué)的快速發(fā)展，能夠在短時(shí)間內(nèi)對(duì)潛在肽段進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析，結(jié)果和軟件預(yù)測(cè)是吻合的。

生物體內(nèi)蛋白磷酸化修飾是一個(gè)動(dòng)態(tài)調(diào)控過(guò)程，不同生存環(huán)境都可能會(huì)影響蛋白的修飾狀態(tài)。磷酸化肽段非常不穩(wěn)定，容易發(fā)生脫磷酸化，因此在實(shí)驗(yàn)處理過(guò)程中除了加入磷酸酶抑制劑外還要注意操作環(huán)境的溫度。從免疫共沉淀技術(shù)到質(zhì)譜鑒定，從專一的生物化學(xué)反應(yīng)再到特異性驗(yàn)證等一系列實(shí)驗(yàn)，證實(shí)了Msx1的磷酸化修飾狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)了絲氨酸152位和絲氨酸160位兩個(gè)新的磷酸化位點(diǎn)。文中的特異性抗體，利用152位和160位單磷酸化和非磷酸化的肽段注射兔子，并且分別使用單磷酸化多肽及非磷酸化多肽制備親和純化柱，對(duì)磷酸化特異性抗體進(jìn)行純化，最后得到了特異性更高的抗體。特異性抗體的制備和驗(yàn)證更是為后期實(shí)驗(yàn)的研究提供重要依據(jù)，可以直接利用特異性抗體檢測(cè)蛋白中磷酸化位點(diǎn)，進(jìn)一步研究生物體內(nèi)磷酸化修飾的動(dòng)態(tài)調(diào)控模式。Msx1磷酸化位點(diǎn)的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，提供了現(xiàn)代生物學(xué)研究中又一個(gè)富有啟示性的案例。

本研究以同源異型框蛋白Msx1為代表研究蛋白磷酸化修飾，優(yōu)勢(shì)在于Msx1基因片段較小，操作方便。運(yùn)用生物信息學(xué)與質(zhì)譜技術(shù)聯(lián)合的方法對(duì)蛋白翻譯后修飾進(jìn)行預(yù)測(cè)和鑒定分析，方便快捷，可以通過(guò)預(yù)測(cè)軟件對(duì)其他同源異型框蛋白進(jìn)行預(yù)測(cè)，進(jìn)一步利用特異性抗體加以驗(yàn)證，為下一步研究Msx1磷酸化修飾對(duì)其生物學(xué)功能的影響以及其他同源框蛋白的生物功能奠定了扎實(shí)的生物基礎(chǔ)。

本研究對(duì)人和小鼠的Msx1蛋白進(jìn)行比對(duì)，二者的蛋白序列具有高度保守性，特異性抗體所用的肽段在人和小鼠中是相同的，因此可以直接用來(lái)檢測(cè)人的MSX1磷酸化狀態(tài)。但是不同物種中Msx1的磷酸化修飾是否完全相同，需要進(jìn)一步驗(yàn)證。蛋白的翻譯后修飾大部分是由激酶介導(dǎo)，不同的酶可催化同一個(gè)底物，同一個(gè)酶也可催化不同的底物。預(yù)測(cè)結(jié)果同時(shí)提供了不同的潛在磷酸激酶，后期實(shí)驗(yàn)可以通過(guò)體外磷酸激酶分析驗(yàn)證，通過(guò)對(duì)細(xì)胞內(nèi)的激酶敲除，利用特異性的磷酸化抗體進(jìn)行檢測(cè)。酶對(duì)底物的催化反應(yīng)可以是間接也可以是直接結(jié)合進(jìn)行催化，Msx1是否直接被酶催化，需要對(duì)Msx1的空間結(jié)構(gòu)做進(jìn)一步分析。

圖3 Msx1中磷酸化位點(diǎn)的質(zhì)譜鑒定

圖4 利用 Western blot 驗(yàn)證特異性抗體的活性

4 結(jié)論

本研究首先運(yùn)用生物信息學(xué)對(duì)同源異型框蛋白Msx1進(jìn)行了預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)了21個(gè)潛在的磷酸化位點(diǎn)，進(jìn)而在C2C12細(xì)胞中過(guò)量表達(dá)Msx1蛋白，并利用免疫共沉淀技術(shù)以及質(zhì)譜分析技術(shù)對(duì)磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)新的磷酸化位點(diǎn)，分別為絲氨酸152位和絲氨酸160位，預(yù)測(cè)結(jié)果和實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有一致性。這兩個(gè)位點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)為研究Msx1磷酸化修飾以及其他翻譯后修飾提供了重要的參考。同源異型框基因又是一類高度保守的基因，實(shí)驗(yàn)結(jié)果同時(shí)驗(yàn)證了這兩個(gè)磷酸化位點(diǎn)在人和小鼠中都是高度保守的，從而利用生物信息學(xué)軟件對(duì)人的MSX1的磷酸化修飾位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)，可以為研究MSX1在調(diào)控人類健康以及人類重大疾病相關(guān)的復(fù)雜生命過(guò)程中精確的分子作用提供參考依據(jù)。

圖5 人和小鼠的Msx1蛋白序列比對(duì)結(jié)果圖

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（責(zé)任編輯 李楠）

Identification of Two Novel Phosphorylated Sites of Homeoprotein Msx1

CHENG Qing-ling WANG Jing-qiang
（State Key Laboratory of Genetic Engineering，F(xiàn)udan University，Shanghai 200438）

Some phosphorylated sites in the homolog Msx2 of the homeoprotein Msx1 has been identified，which plays a crucial biological role. However，the phosphorylated sites in Msx1 are not known yet，thus in order to examine the Msx1 phosphorylated status，we applied bioinformatics analysis to predict phosphorylation sites in Msx1，further used immunoprecipitation and mass spectrometry to experimentally verify the phosphorylation sites in Msx1. Tryptic digests of Msx1 protein complexes purified from C2C12 cells were separated and analyzed by nLC-MS-MS. Two novel phosphorylation sites（Ser152 and Ser160）were identified，moreover，these two sites were highly conserved in mouse and human. Furthermore，the specifically-phosphorylated antibody was prepared targeting these two phosphorylation sites.

homeoprotein；Msx1；phosphorylation；mass spectrometric identification

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.06.031

2015-10-27

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（31471230），上海市浦江人才計(jì)劃資助（14PJ1401300）

程慶靈，女，碩士，研究方向：Msx1翻譯后修飾在發(fā)育中的分子作用；E-mail：13210700132@fudan.edu.cn

王敬強(qiáng)，男，博士，研究方向：Msx1在發(fā)育，出生缺陷，組織再生和癌癥中的分子作用；E-mail：Jingqiangwang@fudan.edu.cn