梁果義甘一迪劉曉航蔡祥勝

（1. 北京雙鷺?biāo)帢I(yè)股份有限公司，北京 100043；2. 南方醫(yī)科大學(xué)生物治療研究所，廣州 510515）

重組胰島素原在畢赤酵母中高效分泌表達(dá)的研究

梁果義1甘一迪1劉曉航1蔡祥勝2

（1. 北京雙鷺?biāo)帢I(yè)股份有限公司，北京 100043；2. 南方醫(yī)科大學(xué)生物治療研究所，廣州 510515）

為了提高胰島素在酵母的分泌表達(dá)效率，首先合成了胰島素原基因，并在其序列的N端引入了一段引導(dǎo)肽，構(gòu)建成pPICZα-A-Pro-INS重組分泌型表達(dá)載體。將表達(dá)載體線性化處理后電擊轉(zhuǎn)化畢赤酵母GSll5感受態(tài)細(xì)胞，篩選獲得分泌型高表達(dá)工程菌株，重組蛋白的表達(dá)水平為300 mg/L，占分泌總蛋白的40%左右。該結(jié)果表達(dá)明引導(dǎo)肽的存在對(duì)于在畢赤酵母中高效表達(dá)胰島素的基因至關(guān)重要。

胰島素；畢赤酵母；高效表達(dá)；引導(dǎo)肽

糖尿病是一種全身性慢性疾病，病因復(fù)雜，并發(fā)癥多，治愈率低，成為國(guó)際醫(yī)學(xué)的一大難題，被世界衛(wèi)生組織稱為不死的癌癥。胰島素是治療糖尿病最基礎(chǔ)、最有效的藥物，也是FDA批準(zhǔn)的第一個(gè)用于人類的基因重組藥物。目前，胰島素作為重組蛋白產(chǎn)品，主要有兩條途徑獲得。一條途徑是在大腸桿菌中表達(dá)胰島素前體的包涵體，通過(guò)溶解和復(fù)性等過(guò)程獲得胰島素；另外一條途徑是通過(guò)酵母表達(dá)系統(tǒng)，分泌表達(dá)可溶性的胰島素前體進(jìn)入培養(yǎng)液［1］。

畢赤酵母（Pichia pastoris）表達(dá)系統(tǒng)許多優(yōu)點(diǎn)，例如，可對(duì)表達(dá)的蛋白進(jìn)行翻譯后加工與修飾、具有強(qiáng)的可控的醇氧化酶基因強(qiáng)啟動(dòng)子、表達(dá)載體是整合在染色體上、糖基化程度低使其所分泌的糖蛋白的免疫原性較低利于臨床應(yīng)用等。目前，在畢赤酵母中已有許多基因成功的實(shí)現(xiàn)了高效表達(dá)，如破傷風(fēng)毒素基因在畢赤酵母中表達(dá)后，其產(chǎn)量達(dá)12 g/L［2］；而來(lái)源于人的人血清蛋白基因經(jīng)表達(dá)后，其產(chǎn)量達(dá)10 g/L［3］。然而仍有些蛋白的表達(dá)水平較低，甚至表達(dá)出來(lái)沒(méi)有活性。因此，我們還需進(jìn)一步研究提高外源蛋白在其體內(nèi)的表達(dá)。

近年來(lái)，也有很多學(xué)者研究利用畢赤酵母來(lái)分泌表達(dá)胰島素的基因，然而由于該基因自身的一些特點(diǎn)，多數(shù)研究表達(dá)胰島素的量均較低。現(xiàn)在已有一些研究通過(guò)優(yōu)化表達(dá)核的啟動(dòng)子、拷貝數(shù)、對(duì)宿主菌進(jìn)行改良、優(yōu)化培養(yǎng)條件等方法來(lái)提高胰島素的表達(dá)量［4］。盡管這些方法可以在一定程度上提高其表達(dá)量，但是現(xiàn)有的文獻(xiàn)報(bào)到，其表達(dá)量較低。早在1996年，Kjeldsen等［5，6］在釀酒酵母中表達(dá)完整的人胰島素原cDNA基因時(shí)，發(fā)現(xiàn)胰島素原蛋白大部分累積在胞內(nèi)而不能分泌到胞外，而將編碼胰島素原cDNA分子中的β鏈中的第30位氨基酸去除，并接上短的C肽鏈，且與釀酒酵母的α交配因子前導(dǎo)肽相融合，則可以有效的提高單鏈胰島素原的分泌表達(dá)量。在此基礎(chǔ)上，Kjeldsen等［7，8］也在畢赤酵母中成功的表達(dá)胰島素原基因，且在前導(dǎo)肽與外源蛋白之間引入一段間隔肽——EEAEAEAEPK，這樣在前導(dǎo)肽的引導(dǎo)下，表達(dá)的胰島素原可以正確的折疊，形成正確的二硫鍵以及提高其分泌表達(dá)量。劉海峰等［9］利用畢赤酵母表達(dá)人胰島素原基因時(shí)，在胰島素原基因的N末端引入同樣的一段間隔肽——EEAEAEAEPK，發(fā)現(xiàn)雖然其可以提高目的蛋白的表達(dá)量，但間隔肽中多個(gè)酶切位點(diǎn)造成胰島素原蛋白N末端的不均一性。利用間隔肽還可促進(jìn)其它的基因如S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因［10］和植酸酶基因［11］等在畢赤酵母中的分泌表達(dá)。

胰島素工程菌的表達(dá)量一直是困擾胰島素制備的一個(gè)難題，本研究結(jié)合前人研究的基礎(chǔ)，重新設(shè)計(jì)胰島素酵母表達(dá)的方式。采用pPICZαA載體，在分泌信號(hào)肽和胰島素原之間引入一段間隔肽，構(gòu)建載體轉(zhuǎn)化酵母受體菌GS115，利用zeocin抗性篩選高拷貝重組子，表達(dá)驗(yàn)證來(lái)獲得高表達(dá)胰島素的酵母工程菌種。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與載體 大腸桿菌（Escherichia coli）TOP10 感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司，畢赤酵母菌株GS115由本實(shí)驗(yàn)室保存；大腸桿菌-畢赤酵母穿梭質(zhì)粒載體pPICZα-A由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 試劑 T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶（Xho I和NotI）、PfuDNA聚合酶、dNTP及DNA Maker（DL2000）均購(gòu)自大連TaKaRa公司；博來(lái)霉素（Zeocin）購(gòu)自Invitrogen公司，胰蛋白胨（Trypsin）和酵母提取物（Yeast extract），英國(guó)Oxoid公司；質(zhì)粒抽提試劑盒和膠回收試劑盒購(gòu)自美國(guó)Omega公司其他化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純，購(gòu)自北京化學(xué)試劑公司。

1.1.3 培養(yǎng)基 （1）LB培養(yǎng)基：1.0%胰蛋白胨，0.5%酵母提取物，1.0% NaCl，調(diào)節(jié)pH值至7.0（固體培養(yǎng)基含1.5%瓊脂）。（2）YPG培養(yǎng)基：2.0%胰蛋白胨，1%酵母提取物，2%甘油（固體培養(yǎng)基含1.5%瓊脂）。（3）完全培養(yǎng)基YPD：2.0%胰蛋白胨，1%酵母提取物，2%葡萄糖。（4）誘導(dǎo)表達(dá)培養(yǎng)基BMGY：2.0%胰蛋白胨，1%酵母提取物，1.34%YNB，2%甘油，10 mmol/L磷酸鉀（pH6.0）、生物素4×10-5%（無(wú)菌過(guò)濾加入）。（5）誘導(dǎo)表達(dá)培養(yǎng)基BMMY：2.0%胰蛋白胨，1%酵母提取物，1.34%YNB，0.5%甲醇，10 mmol/L磷酸鉀（pH6.0）、生物素4×10-5%（無(wú)菌過(guò)濾加入）。

1.2 方法

1.2.1 胰島素原的cDNA序列的合成及酵母表達(dá)重組載體的構(gòu)建 在參閱文獻(xiàn)以及前期相關(guān)研究的基礎(chǔ)之上，充分考慮到目的蛋白的分泌表達(dá)、酶切、純化回收等各個(gè)環(huán)節(jié)，確定其引導(dǎo)肽的序列為EEAEAEAKR，根據(jù)Codon Usage database（http://www. kazusa.or.jp/codon/）P. Pastoris密碼子使用偏好性數(shù)據(jù)，設(shè)計(jì)甘精胰島素原類似物核苷酸序列，在序列后面設(shè)計(jì)兩個(gè)TAA終止密碼子序列，并在序列5'端和3'端分別設(shè)計(jì)Xho I（CTCGAG）和Not I（GCGGCCGC）限制性酶切位點(diǎn)。具體序列為“CTCG AGAAGAGAGAAGAAGCTGAAGCTGAAGCTAAGAGA TTCGTCAACCAGCACTTGTGCGGTTCTCACTTGGTTG AGGCCTTGTACTTGGTCTGTGGTGAGCGTGGTTTCTT CTACACCCCAAAGACCAGACGTGGTATCGTTGAGC AGTGTTGCACCTCCATCTGCTCCTTGTACCAGTTGG AGAACTACTGTGGTTAATAAGCGGCCGC”。

委托生金維智生物科技有限公司對(duì)本公司設(shè)計(jì)完整的cDNA序列進(jìn)行全基因合成，并將上述全基因合成的cDNA插入PUC57質(zhì)粒，構(gòu)建重組質(zhì)粒PUC- Pro-INS。用限制性內(nèi)切酶Xho I和Not I酶切，利用質(zhì)粒膠回收試劑盒回收目的基因片段并保存。然后將目的基因連入表達(dá)載體pPICZα-A。

1.2.2 重組酵母菌株的轉(zhuǎn)化和誘導(dǎo)表達(dá)

1.2.2.1 畢赤酵母感受態(tài)細(xì)胞的制備 挑取畢赤酵母GS115單菌落接種到裝有5 mL YPD培養(yǎng)基的50 mL三角瓶中，30℃，200 r/min培養(yǎng)過(guò)夜。取5 mL過(guò)夜菌液到100 mLYPD中30℃，200 r/min培養(yǎng)，OD600=1.2-2.0收菌。 將50 mL菌液移入離心管，4℃，1 600×g離心5 min，無(wú)菌徹底去掉上清。 用10 mL 1mol/L D-Sorbitol懸浮菌體，4℃，1 600×g離心5 min，無(wú)菌去掉上清。用10 mL1mol/L D-Sorbitol懸浮菌體，4℃，1 600×g離心5 min，反復(fù)5次。用1 000 μL 1 mol/L D-Sorbitol懸浮菌體，冰水浴備用。

1.2.2.2 畢赤酵母的電轉(zhuǎn)化 取80 μL酵母感受態(tài)細(xì)胞菌液至預(yù)冷的0.2 cm電轉(zhuǎn)杯中，加入線性化的質(zhì)粒20 μL濃縮質(zhì)?；靹?，置冰上5 min（或-20℃放置1 min）。將電轉(zhuǎn)杯放入電轉(zhuǎn)儀中電轉(zhuǎn)（電壓2.0 kV，電擊時(shí)間5 ms）。立即加入1 mL預(yù)冷無(wú)菌1 mol/L的D-Sorbitol，靜止60 min。取200 μL菌液涂布MD板，平放30℃烘箱20-60 min，再倒放培養(yǎng)3-5 d。

1.2.2.3 篩選畢赤酵母多拷貝重組子 用無(wú)菌牙簽隨機(jī)挑取在YPG-Zeocin平板上生長(zhǎng)較快的微量畢赤酵母重組子到含不同Zeocin濃度（300 μg/mL、600 μg/mL）的固體平板上，同一重組子在不同Zeocin濃度的固體平板上編相同的號(hào)碼。根據(jù)整合的外源基因的拷貝數(shù)與Zeocin抗性大小之間的計(jì)量依賴關(guān)系，可推斷僅在低濃度Zeocin平板上長(zhǎng)出來(lái)的細(xì)胞為低拷貝重組子，在高濃度Zeocin平板上長(zhǎng)出來(lái)的細(xì)胞為高拷貝重組子。恒溫箱設(shè)置為30℃，靜置培養(yǎng)3-5 d。每日檢查不同Zeocin濃度平板出現(xiàn)的菌落。

1.2.2.4 畢赤酵母重組子的誘導(dǎo)表達(dá)搖瓶篩選 分別在含100 μg/mL、300 μg/mL、600 μg/mL Zeocin的YPD平板上挑取不同拷貝數(shù)的重組子菌落，接種于100 mL BMGY培養(yǎng)液的1 000 mL搖瓶中，30℃搖床培養(yǎng)約16-24 h至OD600為2-6時(shí)，無(wú)菌條件下更換等體積的BMMY培養(yǎng)液進(jìn)行誘導(dǎo)，28℃繼續(xù)培養(yǎng)120 h，每隔24 h補(bǔ)加終濃度為0.5%的甲醇。誘導(dǎo)結(jié)束離心后，上清液用三氯乙酸（Trichloroacetic acid，TCA）沉淀。配制試劑液50%的TCA加入0.2%的去氧膽酸鈉，取25%的試劑液與75%的培養(yǎng)基離心上清液（體積比）混合均勻，在冰塊上放置30 min。離心（4℃，20 000×g，20 min），倒去上清液，用10%的TCA懸浮，離心（條件同上）。倒去上清液，用冷丙酮（-20℃）再懸浮，離心（條件同上）。用吹風(fēng)機(jī)吹干沉淀，用SDS buffer溶解濃縮進(jìn)行電泳或HPLC檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 酵母陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的篩選

將轉(zhuǎn)化有胰島素表達(dá)核的重組畢赤酵母，分別點(diǎn)在含100 μg/mL、300 μg/mL、600 μg/mL Zeocin的YPD平板上進(jìn)行培養(yǎng)，來(lái)篩選整合有高拷貝表達(dá)核的重組子，平板結(jié)果見(jiàn)圖1。從圖1可以明顯發(fā)現(xiàn)，有些酵母的基因組中可能整合了多個(gè)拷貝的基因表達(dá)核，可能會(huì)高效表達(dá)胰島素的基因。

圖1 轉(zhuǎn)化子抗性平板篩選的結(jié)果

挑選整合有高拷貝的8株轉(zhuǎn)化子，進(jìn)行搖瓶誘導(dǎo)表達(dá)培養(yǎng)，并檢測(cè)其表達(dá)胰島素的量，蛋白質(zhì)電泳結(jié)果見(jiàn)圖2。從圖2中可以發(fā)現(xiàn)胰島素可以被高效誘導(dǎo)分泌表達(dá)到胞外，重組蛋白的表達(dá)水平最高可以達(dá)到到300 mg/L，占分泌總蛋白的40%左右。文獻(xiàn)報(bào)道［12］沒(méi)有加前導(dǎo)肽的畢赤酵母轉(zhuǎn)化子中，胰島素獲得的最高分泌表達(dá)量?jī)H為32 mg/L。在胰導(dǎo)素前體的N端加上前導(dǎo)肽后，可以提高其表達(dá)量約為10倍。

2.2 工程菌誘導(dǎo)表達(dá)蛋白的質(zhì)譜測(cè)定

將表達(dá)的胰島素前體從SDS-PAGE電泳中切下后進(jìn)行色譜純化，從色譜圖（圖3）中可以發(fā)現(xiàn)該蛋白出峰的保留時(shí)間約為14.9 min，純度為100%。將獲得的重組胰島素前體進(jìn)行質(zhì)譜測(cè)定其分子量為7.08 kD，與其理論分子量7.08 kD基本一致，該結(jié)果初步表明表達(dá)的重組蛋白質(zhì)為胰島素前體。在此基礎(chǔ)上，對(duì)目標(biāo)條帶進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜檢測(cè)（圖4），選取信號(hào)強(qiáng)度較好的兩個(gè)肽段進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜，并搜索Mascot 數(shù)據(jù)庫(kù)，分析表明檢測(cè)的蛋白質(zhì)為胰島素前體中的蛋白質(zhì)片段，從而證明胰島素原在畢赤酵母中成功實(shí)現(xiàn)表達(dá)。

圖2 蛋白質(zhì)電泳結(jié)果

圖3 回收樣品HPLC色譜圖

圖4 質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果

3 討論

利用基因重組技術(shù)在體外大量制備活性多肽是目前生物制品研究的熱點(diǎn)之一。對(duì)于許多分子較小的多肽，如果用常規(guī)方法構(gòu)建單拷貝基因的重組質(zhì)粒，則目的基因在細(xì)胞中的表達(dá)量很低，無(wú)法體現(xiàn)基因工程產(chǎn)量高的優(yōu)勢(shì)，其原因是表達(dá)產(chǎn)物的分子太小，在細(xì)胞中不穩(wěn)定，容易被宿主蛋白酶降解。因此，建立一套適合小分子肽表達(dá)的體系，以實(shí)現(xiàn)小分子多肽在體外的高效表達(dá)極為重要。

畢赤酵母作為目前應(yīng)用最成功的一種外源基因真核表達(dá)系統(tǒng)，可以高效分泌表達(dá)外源基因，然而許多基因由于基因自身的性質(zhì)，很難在該表達(dá)系統(tǒng)中得到高效表達(dá)，其中胰島素就是其中的一個(gè)例子。有研究通過(guò)提高胰島素基因表達(dá)核的拷貝數(shù)，優(yōu)化發(fā)酵條件、啟動(dòng)子等方法可以提高其分泌表達(dá)量，但是其表達(dá)量依然很低。本研究發(fā)現(xiàn)在其N端融合一種前導(dǎo)肽，可以提高其分泌表達(dá)量，也再次表明，蛋白質(zhì)N端的序列和其在畢赤酵母中的分泌表達(dá)密切相關(guān)。但到目前為止，仍還不清楚為什么這段前導(dǎo)肽能大幅度提高胰島素前體表達(dá)量的原因。另外關(guān)于其應(yīng)用的普遍性也需要進(jìn)一步的研究。

優(yōu)化發(fā)酵條件，提高酵母的產(chǎn)量，實(shí)現(xiàn)目的多肽的高表達(dá)。用發(fā)酵罐高密度培養(yǎng)能大量提高表達(dá)量。這是因?yàn)樵诎l(fā)酵罐中，溶解氧水平、通氣量、PH攪拌速度、營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)給等方面更容易得到優(yōu)化，有機(jī)體能高密度生長(zhǎng)，也可獲得目標(biāo)產(chǎn)物更高效的表達(dá)。分泌表達(dá)可穩(wěn)定表達(dá)產(chǎn)物，減少蛋白水解酶作用。對(duì)已經(jīng)篩選出來(lái)的菌株，通過(guò)優(yōu)化發(fā)酵條件可進(jìn)一步提高分泌表達(dá)量。

4 結(jié)論

本研究構(gòu)建了pPICZα-A-Pro-INS重組載體；將表達(dá)載體轉(zhuǎn)化畢赤酵母GSll5，利用Zeocin抗生素篩選高抗重組菌株；重組子甲醇誘導(dǎo)表達(dá)篩選獲得高表達(dá)菌種，基本上與其Zeocin濃度呈正相關(guān)，蛋白的表達(dá)水平最高可達(dá)300 mg/L，占分泌總蛋白的40%左右；獲得的重組胰島素前體分子量為7.08 kD，與其理論分子量一致。

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（責(zé)任編輯 李楠）

Study on the Highly Secreted Expression of the Recombinant Insulin in Pichia pastoris

LIANG Guo-yi1GAN Yi-di1LIU Xiao-hang1CAI Xiang-sheng2
（1. Beijing SL Pharmaceutical Co.，Ltd.，，Beijing 100043；2. Institute of Biotherapy of Southern Medical University，Guangzhou 510515）

In order to improve the efficiency of insulin secretion expression in yeast，firstly the pro-insulin gene was synthesized，and a recombinant secreted expression vector（pPICZα-A-Pro-INS）was constructed by inserting a leader peptide to N-end of the gene’s sequence. Linearized expression vector was transformed into the competent cells of Pichia pastoris GSll5. A strain with highly secreted expression of the insulin was screened，by which the secreted recombinant protein expression level was 300 mg/L，accounting for about 40% of the total secreted protein. This result revealed that the leader peptide is crucial to the gene of highly expressing insulin in P. pastoris.

insulin；Pichia pastoris；highly expression；leader peptide

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.06.033

2015-09-30

梁果義，男，研究生，研究方向：生物醫(yī)藥；E-mail：guoyi_liang@163.com