孟紅恩 杜榮俸 徐鑫 劉忠淵

（新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 新疆生物資源基因工程重點實驗室，烏魯木齊 830046）

鹽穗木金屬硫蛋白HcMT在大腸桿菌中高效表達(dá)及金屬離子結(jié)合能力的檢測

孟紅恩 杜榮俸 徐鑫 劉忠淵

（新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 新疆生物資源基因工程重點實驗室，烏魯木齊 830046）

旨在研究鹽穗木金屬硫蛋白HcMT基因原核表達(dá)情況及結(jié)合金屬離子的能力。從鹽穗木中克隆獲得的金屬硫蛋白（HcMT）基因亞克隆至pGEX-6p-2原核表達(dá)載體上，在大腸桿菌BL21中表達(dá)，分離純化融白蛋白GST-HcMT，通過原子吸收分光光度法測定融合蛋白GST-HcMT結(jié)合金屬離子的量以判斷其與金屬離子的結(jié)合能力。結(jié)果顯示，誘導(dǎo)表達(dá)的融合蛋白GST-HcMT分子量在34 kD左右，與預(yù)期一致，且通過Western blot進(jìn)一步得到驗證；原子吸收結(jié)果表明其具有結(jié)合Cu2+、Zn2+、Pb2+、Cd2+的能力，融合蛋白結(jié)合Cu2+、Zn2+、Pb2+、Cd2+的量分別是對照的25倍、10倍、4倍和2倍，其結(jié)合能力大小為Cu2+>Cd2+>Zn2+>Pb2+。

鹽穗木金屬硫蛋白；原子吸收分光光度法；金屬離子結(jié)合能力

金屬 硫蛋白（Metallothioneins，MTs）是一類相對分子質(zhì)量較低（約6-7 kD）、富含半胱氨酸殘基、能與金屬離子結(jié)合的胞質(zhì)蛋白，在幾乎所有真核生物以及一些原核生物中都有表達(dá)［1-2］。從NCBI中可以檢索到1 013個植物MTs序列和類MTs序列，它們在所有主要類群的維管植物中都存在，包括種子植物、裸子植物、蕨類植物和擬蕨類植物［3］。盡管它們的進(jìn)化起源還未完全清楚［4］，但它們的序列具有相同的特征。植物MTs根據(jù)半胱氨酸殘基位置和排列順序的不同可以分為3類，即I類、II類和III類（Class I，II，III）。I類MTs含有兩個小的富含半胱氨酸殘基的結(jié)構(gòu)域，中間被一個不含有半胱氨酸殘基的間隔序列（大約30-40個氨基酸）隔開，其中的Cys按C-X-C、C-X-X-C和C-C（X為除半胱氨酸的其他氨基酸）的方式排列，根據(jù)蛋白序列中半胱氨酸殘基位置與排列順序的不同又可以分為4個亞型（Type 1-4）［5］。大部分植物MTs都是I類MT。Type 2型植物金屬硫蛋白通常含有14個半胱氨酸殘基，主要在葉中表達(dá)［6］。

金屬硫蛋白在清除自由基、金屬離子的代謝與解毒等生命進(jìn)程中發(fā)揮著重要作用［2，7］。一些植物金屬硫蛋白的表達(dá)可以被過氧化物、鹽、干旱、冷、重金屬等非生物脅迫所誘導(dǎo)表達(dá)［1，8-10］。螯合金屬離子是金屬硫蛋白中巰基簇的主要功能［6］，金屬硫蛋白可以結(jié)合Zn2+、Cd2+、Hg2+、Cu2+、Pb2+等離子，并可參與維持金屬離子的穩(wěn)態(tài)［11］。有研究發(fā)現(xiàn)每種金屬硫蛋白對某一種離子有較高的親和性而對其他離子只有較低的親和性［12］。在大腸桿菌、酵母以及其他植物中過表達(dá)Type 2型金屬硫蛋白可以增強其對金屬離子的耐受性以及富集更多相應(yīng)的金屬離子。例如，在大腸桿菌中表達(dá)海茄苳（Avicennia marina）金屬硫蛋白AmMT2可以增強其對Zn2+、Cu2+、Pb2+和 Cd2+的耐受性，且對Cd2+有較高的親和力［13］。木欖（Bruguiera gymnorrhiza）金屬硫蛋白BgMT2 同樣可以結(jié)合Zn2+、Cu2+、Pb2+和 Cd2+［14］。過表達(dá)芥菜（Brassica juncea）金屬硫蛋白BjMT2的大腸桿菌中顯示出較強的拮抗Cu2+和 Cd2+脅迫的能力，而轉(zhuǎn)BjMT2的擬南芥若不外源添加Cu2+其根的生長將受到抑制［15］。同樣，過表達(dá)天藍(lán)遏藍(lán)菜（Thlaspi caerulescens）金屬硫蛋白TcMT2a和TcMT3的擬南芥根的生長受到影響［16］，這可能與金屬硫蛋白參與必需金屬元素的代謝相關(guān)。而轉(zhuǎn)鹽穗木（Arabidopsk thaliana）金屬硫蛋白AtMT2b煙草可以提高其對亞砷酸鹽的敏感性以及根至芽中的遷移［17］。這些結(jié)果表明金屬硫蛋白可能是以結(jié)合金屬離子的形式參與植物體內(nèi)金屬離子的穩(wěn)態(tài)以及運輸。而且，不同植物中不同的金屬硫蛋白對各種金屬離子有不同的親和力［18，19］。每一種金屬硫蛋白都能與多種金屬離子結(jié)合，而每一亞型的金屬硫蛋白的作用機理還不明確，因此研究每一個植物金屬硫蛋白的功能對于更好地理解它們在植物中的作用有重要的意義。

本研究從鹽穗木（Halostachys caspica）中分離鑒定一個Type 2型金屬硫蛋白基因（HcMT）并亞克隆至pGEX-6p-2表達(dá)載體，原核表達(dá)并純化融合蛋白GST-HcMT，以期檢測其與金屬離子的結(jié)合能力。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒、菌株 原核表達(dá)載體pGEX-6p-2為新疆生物資源基因工程重點實驗室保存，pMD18-T 載體購自TaKaRa公司，菌株DH5α和BL21（DE3）購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 主要試劑 各種限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）以及DNA標(biāo)準(zhǔn)品購于TaKaRa公司。Taq DNA聚合酶、膠回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒均購自天根生化科技有限公司。GST Bind Resin和填料柱購自Novagen公司。PVDF膜購自Millipore公司，顯色試劑購自碧云天生物技術(shù)公司。引物合成及序列測定由上海生工生物工程股份有限公司完成。其他常用試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 原核表達(dá)載體的構(gòu)建 根據(jù)鹽穗木金屬硫蛋白（HcMT）cDNA基因（GenBank登錄號：HS586-469.1）序列設(shè)計了2條引物：上游引物Pl：5'-CCGG AATTCCCATGTCTTGCTGTGGTGG-3'，下游引物P2：5'-CCGCTCGAGTCATTTGCAGGTGCAAGGG-3'，并分別在上、下游引物中插入EcoR I和Xho I酶切位點（下劃線部分）。通過PCR擴增、膠回收后連接到pMD18-T載體上構(gòu)成重組質(zhì)粒pMD18-T-HcMT。質(zhì)粒pMD18-T-HcMT與pGEX-6p-2分別用EcoR I和Xho I雙酶切，將雙酶切后的pGEX-6p-2和HcMT片段經(jīng)T4 DNA連接酶4℃連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，抗生素篩選，挑取陽性克隆進(jìn)行菌液PCR鑒定、測序鑒定。

1.2.2 SDS-PAGE檢測HcMT的表達(dá) 將測序正確的pGEX-6p-2-HcMT質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞。陽性單克隆接種于5 mL含50 mg/L Amp的LB培養(yǎng)基，37℃、220 r/min過夜培養(yǎng)，按體積比1∶100轉(zhuǎn)接入50 mL LB（含Amp）新鮮培養(yǎng)基，相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)，當(dāng)OD600達(dá)到0.4-0.6時，加IPTG至終濃度為1 mmol/L，誘導(dǎo)表達(dá)4 h，收集2 mL菌液離心，沉淀用100 μL 1×SDS上樣緩沖液徹底懸浮，煮沸15 min，15% SDS-PAGE電泳分析表達(dá)結(jié)果。

1.2.3 融合蛋白的純化及濃度測定 12 000 r/min，10 min離心收集大量誘導(dǎo)表達(dá)后的菌體，用4%（體積分?jǐn)?shù)）的冰冷1×GST洗滌緩沖液（4.3 mmol/L Na2HPO4，1.47 mmol/L KH2PO4，0.137 mmol/L NaCl，2.7 mmol/L KCl，pH7.3）重懸，超聲破碎，離心收集上清液。取GST Bind Resin填料裝柱，使其自然沉降，用5倍柱床體積的冰冷1×GST洗滌緩沖液平衡，將收集的上清液逐滴加到柱子上，控制流速每小時10倍柱床體積左右，然后用10倍柱床體積的1×GST洗滌緩沖液洗滌柱子，5倍柱體積的GST洗脫緩沖 液（50 mmol/L Tris-HCI，10 mmol/L Glutathione，pH8.0）洗脫目的蛋白，分別收集各階段的流出液。15% SDS-PAGE電泳分析，Brandford法測定洗脫蛋白溶液的濃度。同時純化原核表達(dá)的谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（GST）標(biāo)簽蛋白作為對照。

1.2.4 Western blot鑒定 將純化的GST-HcMT融合蛋白、GST標(biāo)簽蛋白以及誘導(dǎo)表達(dá)后的重組菌裂解上清液和轉(zhuǎn)空載體的BL21裂解上清液進(jìn)行SDSPAGE電泳，轉(zhuǎn)膜（轉(zhuǎn)移槽0.65 mA/cm穩(wěn)流2 h），用5%脫脂奶粉4℃封閉過夜，加入用TBST（Tris緩沖鹽-吐溫溶液，含10 mmol/L pH7.6 Tris-HCl，150 mmol/L NaCl，0.05% Tween-20）1∶5 000稀釋的鼠ANTI-GST一抗，室溫輕搖2 h，TBST洗膜3次，每次5 min；加入用TBST 1∶10 000稀釋的羊抗鼠IgG，室溫輕搖2 h，TBST洗膜3次，每次5 min； BeyoECL顯色液顯色，觀察PVDF膜上的顯色條帶。

1.2.5 GST-HcMT與金屬離子的結(jié)合能力檢測［13，14］為了研究HcMT結(jié)合金屬離子的能力，分別將含有pGEX-6p-2和pGEX-6p-2-HcMT質(zhì)粒的大腸桿菌E. coli（BL21）過夜培養(yǎng)物以1∶100轉(zhuǎn)接入50 mL LB（含Amp）新鮮培養(yǎng)基。當(dāng)OD600達(dá)到0.4-0.6時，加入終濃度0.4 mmol/L 的IPTG，與此同時向其中添加終濃度分別為200 μmol/L Al3+、200 μmol/L Cu2+、200 μmol/L Mg2+、200 μmol/L Zn2+、100 μmol/L Cd2+、100 μmol/L Mn2+、20 μmol/L Pb2+和2 μmol/L Hg2+金屬離子混合物，37℃過夜誘導(dǎo)。按1.2.4所述方法分離純化得到GST-HcMT，以GST標(biāo)簽蛋白作為對照。將蛋白樣品硝化溶解于15%稀硝酸中，采用原子分光光度法（Atomic Absorption Spectrometry，AAS）測定各金屬離子含量。為了測定其結(jié)合Pb2+、Zn2+、Cd2+的能力，在加入IPTG的同時單獨分別向培養(yǎng)基中加入終濃度為300 μmol/L Pb2+、400 μmol/L Zn2+或200 μmol/L Cd2+，離心洗滌菌體后，按如上方法分離純化蛋白，然后測定各金屬離子含量。每個樣品重復(fù)3次，數(shù)據(jù)用Graph Pad Prism 5進(jìn)行分析。

圖1 HcMT與其他Type 2型金屬硫蛋白的序列比對

2 結(jié)果

2.1 HcMT序列分析

將HcMT序列與其他一些Type 2型金屬硫蛋白序列比對（圖1）顯示，它們都具有相似的典型的結(jié)構(gòu)特征。通過MEGA 4.0系統(tǒng)進(jìn)化樹分析（圖2）顯示，其與海蓬子（Salicornia brachiata）進(jìn)化起源更近。

2.2 GST-HcMT表達(dá)與條件優(yōu)化

將鑒定正確的pGEX-6p-2-HcMT、pGEX-6p-2轉(zhuǎn)入菌液并分別誘導(dǎo)表達(dá)，結(jié)果（圖3）顯示，前者誘導(dǎo)后能夠表達(dá)出大小33 kD左右的蛋白條帶，而后者只在26 kD處有一蛋白條帶，與預(yù)期大小一致。

圖2 HcMT與其他Type 2型金屬硫蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

圖3 SDS-PAGE檢測GST-HcMT表達(dá)情況

圖4 SDS-PAGE鑒定純化的GST-HcMT

圖5 Western blot鑒定純化后的GST-HcMT

2.3 GST-HcMT純化及Western blot鑒定

用GST親和層析柱純化后的蛋白洗脫液，經(jīng)SDS-PAGE（圖4）分析后發(fā)現(xiàn)皆可得到純度相對較高的目的蛋白。然后將純化后的蛋白進(jìn)行Western blot鑒定，結(jié)果（圖5）表明在34 kD位置出現(xiàn)了一條明顯的條帶，與SDS-PAGE中GST-HcMT融合蛋白的位置相符。

2.4 GST-HcMT與金屬離子的結(jié)合能力檢測

在誘導(dǎo)過程中，向培養(yǎng)基中外源添加各種金屬離子之后分離純化融合蛋白，運用AAS測得各離子的量如表1所示。與對照組GST相比，融合蛋白GST-HcMT能夠結(jié)合更多的Cd2+、Cu2+、Zn2+，對Mg2+、Mn2+、Al3+和Hg2+沒有顯著性差異，而對Pb2+的結(jié)合量顯著性比對照小。Pb2+的結(jié)合量顯著性下降引起了我們的興趣，因此選擇在混合添加過程中差異極顯著的代表Cd2+、差異顯著的代表Zn2+以及Pb2+進(jìn)行分別單獨在誘導(dǎo)過程中向培養(yǎng)基中添加實驗。采用相同的方法測結(jié)合金屬離子的含量，結(jié)果（表2）顯示，每摩爾GST對照能夠結(jié)合Cd2+、Zn2+、Pb2+這3種離子的摩爾數(shù)分別為0.549、0.958和2.171，而每摩爾融合蛋白GST-HcMT能夠結(jié)合Cd2+、Zn2+和Pb2+這3種離子的摩爾數(shù)分別為5.438、4.068、 4.604，基本上分別是對照的10倍、4倍和2倍。

表1 AAS測得的GST和GST-HcMT的摩爾比（金屬離子/蛋白）

表2 單一金屬離子實驗下AAS測得的GST和GST-HcMT的摩爾比（金屬離子/蛋白）

3 討論

植物金屬硫蛋白是一類在大多數(shù)的器官中表達(dá)的低分子量多肽，通常認(rèn)為其主要的作用是重金屬的解毒與維持必需金屬離子的穩(wěn)態(tài)。而作為金屬離子螯合劑，它們同樣在不同的生理進(jìn)程中發(fā)揮作用，包括清除ROS、響應(yīng)各種逆境脅迫、調(diào)節(jié)植物的生長等［15，20，21］。但植物金屬硫蛋白的功能機制，尤其是在金屬與自由基脅迫下的生物學(xué)功能，仍有待于進(jìn)一步的闡明。

由于金屬硫蛋白中豐富的半胱氨酸極不穩(wěn)定且常不以單體的形式存在，很難檢測其在體內(nèi)的表達(dá)活性［22］。用于純化的GST標(biāo)簽蛋白為研究小分子蛋白質(zhì)提供了解決方法，同時由于GST標(biāo)簽蛋白可以抑制MTs特別是其鉸鏈區(qū)在大腸桿菌中被蛋白水解酶降解［6，23］，因而本研究選用含GST標(biāo)簽的融合蛋白來研究HcMT結(jié)合金屬離子的能力。結(jié)果顯示與GST相比，GST-HcMT融合蛋白具有較強的結(jié) 合金屬離子的能力，如Zn2+、Cu2+和Cd2+，提示一些金屬離子優(yōu)先與GST-HcMT融合蛋白中的HcMT結(jié)合。銅離子與鋅離子是兩種必需的參與氧化還原的金屬離子，當(dāng)過量時有潛在的毒性。植物需要從環(huán)境中獲得Zn2+和Cu2+，所以它們需要調(diào)節(jié)這兩種金屬離子在細(xì)胞與組織間的上調(diào)、存儲、分布與排出。鋅與銅的缺失或過量都會影響植物的生長［24，25］。鋅與銅是必須金屬元素中與金屬硫蛋白結(jié)合量最大的兩種，而且它們與植物金屬硫蛋 白的結(jié)合也被廣泛研究［10］。HcMT既能與Zn2+也能與Cu2+結(jié)合，而且與Zn2+的結(jié)合量更高，但GST-HcMT與GST的摩爾比之比顯示HcMT對Cu2+的選擇性結(jié)合可能更好一些。一些研究表明盡管植物金屬硫蛋白對金屬離子的親和力不同，但其表達(dá)以及與金屬離子的結(jié)合能力在維持植物體金屬耐受性和金屬離子穩(wěn)態(tài)發(fā)揮著重要作用。其他重金屬離子更多的是對植物體造成氧化脅迫，如Cd2+等［14］，而植物金屬硫蛋白是其ROS清除系統(tǒng)中重要的一部分，本實驗顯示出的金屬硫蛋白與重金屬離子的結(jié)合能力使重金屬在體內(nèi)累積以解除其毒害，可以看出這也是植物應(yīng)對重金屬脅迫的一種方式。而在表1中融合蛋白GSTHcMT相比于對照GST結(jié)合量較少的Pb2+通過單獨添加測得數(shù)據(jù)的表2中可以看出，融合蛋白GSTHcMT還是可以選擇性結(jié)合Pb2+的，產(chǎn)生表1相反的結(jié)果一方面可能是由于混合添加時Pb2+加入量較少，另一方面可能是由于混合添加時其他金屬離子的干擾造成的。AAS法在進(jìn)行多元素測定時確實存在準(zhǔn)確度與精密度較差的缺陷［26，27］。而在單獨添加Cd2+、Zn2+時，融合蛋白GST-HcMT和對照蛋白GST與混合添加相比結(jié)合金屬離子的含量都顯著性提高，但融合蛋白GST-HcMT與對照蛋白GST相比每摩爾結(jié)合的金屬離子的量都極顯著的提高，這一結(jié)果與混合添加時相一致。綜合表1與表2結(jié)果可以看出，HcMT結(jié)合金屬離子的能力Cu2+>Cd2+>Zn2+>Pb2+。這些結(jié)果與其他一些2型金屬硫蛋白［28-31］的結(jié)果相似，植物金屬硫蛋白可以與多種金屬離子結(jié)合，無論是一價離子［32］、二價離子還是更高價離子，而且其親和力也存在一定區(qū)別，推測可能與其生長環(huán)境等有一定的關(guān)系。

4 結(jié)論

本研究成功表達(dá)融合蛋白GST-HcMT，并得到Western blot驗證，又通過原子吸收分光光度法得出其可以結(jié)合Cu2+、Cd2+、Zn2+和Pb2+，且表現(xiàn)出不同的結(jié)合能力，這與以前報道這一類金屬硫蛋白的結(jié)果相吻合。

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［32］Zhang M, Takano T, Liu S, et al. Abiotic stress response in yeast and metal-binding ability of a type 2 metallothionein-like protein（PutMT2）from Puccinellia tenuiflora［J］. Molecular Biology Reports, 2014, 41（9）：5839-5849.

（責(zé)任編輯 馬鑫）

High-level Expression of a Type 2 Metallothionein Protein（HcMT）from Halostachys caspica in Escherichia coli and Its Metal-binding Ability

MENG Hong-en DU Rong-feng XU Xin LIU Zhong-yuan
（Xinjiang Key Laboratory of Biological Resources and Genetic Engineering，College of Life Science and Technology，Xinjiang University，Urumqi 830046）

This study aims to evaluate the prokaryotic expression and metal-binding ability of metallothionein protein in Halostachys caspica（HcMT）. HcMT cloned from H. caspica was transferred to prokaryotic expression vector pGEX-6p-2 and expressed in Escherichia coli BL21. Then the glutathione S-transferase（GST）fusion protein（GST-HcMT）was isolated and purified. Using atomic absorption spectrometry，the metal-binding ability of the GST-HcMT was determined by measuring the amount of metal ions it bound with. The results showed that the molecular weight of expressed fusion protein GST-HcMT was about 34 kD，which was as expected and confirmed by Western blot. Furthermore，GST-HcMT bound 25，10，4，2 folds of Cu2+，Zn2+，Pb2+，and Cd2+separately as GST alone，and the binding ability of GST-HcMT was as follows：Cu2+> Cd2+> Zn2+> Pb2+.

metallothionein protein from Halostachys caspica（HcMT）；atomic absorption spectrometry（AAS）；metal-binding ability

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.04.016

2015-07-28

新疆維吾爾自治區(qū)高技術(shù)研究發(fā)展項目（201416102）

孟紅恩，男，碩士研究生，研究方向：生物化學(xué)與分子生物學(xué)；E-mail：menghongenxju@163.com

劉忠淵，男，博士，研究方向：生物化學(xué)與分子生物學(xué)；E-mail：lzy1168@163.com