周海蘭李紹鵬李衛(wèi)亮賀軍虎包冬紅李茂富

（1. 海南大學(xué)園藝園林學(xué)院 熱帶作物種質(zhì)資源保護(hù)與開(kāi)發(fā)利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（海南大學(xué)），?？?570228；2. 中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所，儋州 571737）

油梨基因組DNA提取、SSR-PCR反應(yīng)體系優(yōu)化及引物篩選

周海蘭1李紹鵬1李衛(wèi)亮1賀軍虎2包冬紅1李茂富1

（1. 海南大學(xué)園藝園林學(xué)院 熱帶作物種質(zhì)資源保護(hù)與開(kāi)發(fā)利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（海南大學(xué)），海口 570228；2. 中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所，儋州 571737）

旨在建立穩(wěn)定可靠的油梨（Persea americana Mill）葉片DNA的提取方法和SSR-PCR反應(yīng)體系及篩選出穩(wěn)定的油梨SSR多態(tài)性引物，為開(kāi)展油梨種質(zhì)SSR分子標(biāo)記提供遺傳研究的基礎(chǔ)。以油梨葉片為試材，比較3種油梨葉片DNA提取方法；利用L16（45）正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)油梨SSR-PCR反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化；利用優(yōu)化的反應(yīng)體系篩選引物；同時(shí)，選取5對(duì)多態(tài)性引物對(duì)45份油梨種質(zhì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，進(jìn)一步檢測(cè)該優(yōu)化體系的穩(wěn)定性。結(jié)果表明，常規(guī)2×CTAB法、改良2×CTAB法和植物DNA提取試劑盒法等3種DNA提取方法中，改良2×CTAB法對(duì)油梨基因組DNA的提取效果最佳；獲得最優(yōu)反應(yīng)體系為：20 μL總反應(yīng)體系中，含約40 ng DNA模板、1.5 mmol/L Mg2+、0.15 mmol/L dNTPs、0.5 U Taq DNA聚合酶、0.5 μmol/L引物；以此體系為基礎(chǔ)進(jìn)行引物篩選，從73對(duì)油梨SSR引物中篩選出了30對(duì)擴(kuò)增條帶清晰的多態(tài)性引物，說(shuō)明該反應(yīng)體系可用于油梨SSR標(biāo)記的進(jìn)一步研究；穩(wěn)定性檢測(cè)獲得的譜帶清晰，表明該優(yōu)化反應(yīng)體系是穩(wěn)定可靠的。由此可見(jiàn)，改良的2×CTAB法可用于油梨葉片DNA的大量樣本提取，優(yōu)化后的SSR-PCR反應(yīng)體系及篩選出的30對(duì)多態(tài)性引物可用于油梨SSR標(biāo)記的進(jìn)一步研究。

油梨；DNA提??；SSR標(biāo)記；體系優(yōu)化；引物篩選

油梨（Persea americana Mill），又名鱷梨、酪梨、牛油果等，原產(chǎn)于熱帶美洲，為樟科（Lauraceae）油梨屬（Persea）喬木果樹(shù)，是一種著名的熱帶水果，也是木本油料樹(shù)種之一［1］，同時(shí)，因其四季常綠、樹(shù)姿優(yōu)美，還可作為一種優(yōu)良的綠化樹(shù)種［2］。近年來(lái)，隨著世界油梨生產(chǎn)發(fā)展迅速，產(chǎn)量與消費(fèi)量與日俱增，已成為引人矚目的熱帶亞熱帶新興水果，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于食用、醫(yī)藥和化妝工業(yè)［3］，具有較高的經(jīng)濟(jì)效益，經(jīng)濟(jì)潛力巨大。我國(guó)于1918年就已引進(jìn)油梨品種［2，4］，在廣東、廣西、云南、福建、四川、臺(tái)灣、海南等?。▍^(qū)）試種成功［5］，但由于我國(guó)油梨資源研究匱乏、適栽品種較少及消費(fèi)市場(chǎng)的有限性導(dǎo)致油梨生產(chǎn)發(fā)展十分緩慢，尚未形成大規(guī)模商品性生產(chǎn)。故研究油梨樹(shù)種的多樣性，深入開(kāi)發(fā)利用油梨資源成為目前研究的熱點(diǎn)［4］。

簡(jiǎn)單序列重復(fù)（Simple sequence repeats，SSR），又名微衛(wèi)星DNA，是以1-6個(gè)堿基為基本單元的串聯(lián)重復(fù)序列，廣泛分布于植物基因組中［6，7］。SSR標(biāo)記具有通用性、高可變性、共顯性遺傳、重復(fù)性好［6-9］等優(yōu)點(diǎn)，且數(shù)量豐富，分布廣，覆蓋整個(gè)基因組［10-14］，并能檢測(cè)出豐富多樣性。目前，該技術(shù)已廣泛用于遺傳多樣性檢測(cè)［15-19］、遺傳圖譜構(gòu)建［20］、目標(biāo)基因的標(biāo)定［21］、指紋圖的繪制［19，22］、種質(zhì)鑒定［17，23］、分子標(biāo)記輔助選育［24］、品種純度鑒定［25］及雜種優(yōu)勢(shì)利用［26］等研究中。在國(guó)外，分子標(biāo)記已被證明在闡明油梨種質(zhì)個(gè)體間的遺傳關(guān)系方面非常有用，其中小衛(wèi)星技術(shù)［27-31］和微衛(wèi)星技術(shù)［32-34］已經(jīng)被應(yīng)用于油梨品種的指紋分析、鑒定和分類；此外，種質(zhì)資源鑒定、遺傳圖譜已經(jīng)利用分子標(biāo)記構(gòu)建［35-37］，但與其他作物相比，分子標(biāo)記技術(shù)在油梨方面的應(yīng)用仍然不足，仍需要學(xué)者繼續(xù)利用分子標(biāo)記對(duì)油梨種質(zhì)進(jìn)行研究。目前，在中國(guó)RAPD、SSR已分別用于油梨的品種分類及授粉研究［38，39］，但油梨的發(fā)展仍然處于不成熟階段，尤其是油梨分子標(biāo)記的研究相對(duì)滯后，在一定程度上限制了油梨遺傳改良和育種工作的進(jìn)行。

SSR標(biāo)記雖然有許多優(yōu)點(diǎn)，但其反應(yīng)條件易受各種因素干擾，從而影響整個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。因此，建立適合的SSR檢測(cè)體系至關(guān)重要，而油梨SSR-PCR體系優(yōu)化尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究對(duì)油梨基因組DNA提取方法、SSR反應(yīng)體系形成及引物篩選進(jìn)行摸索，以期建立一套適合油梨的SSR反應(yīng)體系，為油梨種質(zhì)資源遺傳多樣性及親緣關(guān)系的分析提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)所用的油梨葉片取自于海南大學(xué)園藝園林學(xué)院油梨種質(zhì)資源圃。DNA提取的實(shí)驗(yàn)材料選取10個(gè)品種；引物篩選的實(shí)驗(yàn)材料選取差異明顯的哈斯、大嶺7號(hào)、福爾特及巴康品種為DNA模板；體系優(yōu)化選用哈斯品種。

引物由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成，PCR所用dNTPs、Taq酶、DNA Marker和植物基因組DNA提取試劑盒均購(gòu)自TaKaRa公司。PCR儀為Eppendorf Mastercycler Pro S，瓊脂糖凝膠電泳儀為Biometro Standard Power Pack P25，變性聚丙烯酰胺凝膠電泳儀為北京六一儀器廠DYY-10C型。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取與檢測(cè) 以油梨葉片為材料，比較2×CTAB法、改良2×CTAB法、植物DNA提取試劑盒法等3種方法的優(yōu)劣；采用0.8%瓊脂糖凝膠電泳，以DL2000 Marker為標(biāo)準(zhǔn)，在瓊脂糖凝膠電泳儀120 V恒壓下檢查DNA的完整性檢測(cè)DNA的純度和濃度；提取原液 -20℃保存。1.2.1.1 2×CTAB法 取0.1 g新鮮葉片放入研缽中，在液氮中研磨成粉末，轉(zhuǎn)入預(yù)冷的2 mL離心管，加入850 μL 65℃預(yù)熱的2×CTAB提取緩沖液（2% CTAB，100 mmol/L Tris-HCl，50 mmol/L EDTA，2 mol/L NaCl，2% β-巰基乙醇，pH8.0），搖勻，65℃水浴1 h，期間翻動(dòng)幾次；取出，加入等體積的氯仿∶異戊醇（24∶1，V/V），混勻并上下顛倒數(shù)次，12 000 r/min，4℃離心10 min，將上清液轉(zhuǎn)入另一干凈的2 mL離心管中，重復(fù)此操作1或2次；再將上清液轉(zhuǎn)到另一個(gè)1.5 mL的離心管中，加入80 μL的NaAc（5 mol/L）和2/3體積的異丙醇，緩慢翻轉(zhuǎn)，混勻放置-20℃冰箱 20 min或以上；12 000 r/min，4℃離心10 min，棄上清，用500 μL的70%乙醇洗滌沉淀兩次，放于超凈工作臺(tái)吹干，然后加100 μL的TE緩沖液（10 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA）充分溶解；再加RNaseA酶37℃水浴30 min，取出，-20℃保存待用。

1.2.1.2 改良2×CTAB法 取0.1 g新鮮葉片放入研缽中，加少許PVP在液氮中研磨成粉末，轉(zhuǎn)入預(yù)冷的2 mL離心管，加入850 μL STE緩沖液（200 mmol/L Tris-HCl，100 mmol/L EDTA，1.5 mol/L NaCl，2% PVP，1% β-巰基乙醇，pH8.0），搖勻，置于冰上5 min；4℃條件下5 000 r/min離心8 min，棄上清后繼續(xù)加入850 μL STE緩沖液清洗，再次4℃條件下5 000 r/min離心8 min，棄上清；加入850 μL 65℃預(yù)熱的2×CTAB提取緩沖液，用振蕩器振蕩1 min，充分混勻，放入水浴鍋中水浴約1 h，期間來(lái)回輕緩顛倒幾次；取出至于冰上，加入150 μL NH4AC混勻，靜置5 min，4℃下12 000 r/min離心10 min；取上清，加入等體積的氯仿∶異戊醇（24∶1，V/V），放入脫色搖床上來(lái)回?fù)u蕩10 min，放入離心機(jī)，4℃條件下12 000 r/min離心10 min；將上清液轉(zhuǎn)入另一干凈的2 mL離心管中，加入等體積的氯仿∶異戊醇（24∶1，V/V），放入脫色搖床上來(lái)回?fù)u蕩5 min，放入離心機(jī)，4℃下12 000 r/min離心10 min，根據(jù)上清液情況，選擇是否繼續(xù)重復(fù)抽提一次；將上清液轉(zhuǎn)到另一個(gè)1.5 mL的離心管中，加入80 μL的NaAc（5 mol/L）和2/3體積的異丙醇沉淀，緩慢翻轉(zhuǎn)，混勻放置-20℃冰箱 20 min或以上；12 000 r/min，4℃離心10 min，棄上清，用500 μL的70%乙醇洗滌沉淀兩次，放于超凈工作臺(tái)吹干，然后加100 μL的TE緩沖液充分溶解；再加1 μL RNaseA酶37℃水浴30 min，取出，-20℃保存待用。

1.2.1.3 植物基因組DNA提取試劑盒法 TaKaRa MiniBEST Plant Genomic DNA Extraction Kit步驟參照說(shuō)明書(shū)去多糖多酚的Protocol-Ⅱ步驟進(jìn)行。

1.2.2PCR擴(kuò)增及體系優(yōu)化 PCR擴(kuò)增結(jié)果會(huì)因Mg2+、dNTP、Taq酶、引物濃度及模板DNA量等因素而受到影響，為了得到清晰、客觀、準(zhǔn)確的結(jié)果，需對(duì)反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化后再進(jìn)行大量樣本擴(kuò)增。針對(duì)影響PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系的5個(gè)因素（Mg2+、dNTP、Taq DNA聚合酶、引物及模板DNA量），結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，選用L16（45）正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，共16個(gè)處理組合，每個(gè)組合3次重復(fù)，探討正交實(shí)驗(yàn)因素水平和正交設(shè)計(jì)見(jiàn)表1和表2。

體系優(yōu)化所用引物AVAG21，反應(yīng)體積為20 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。檢測(cè)用2% 瓊脂糖凝膠，120 V恒電壓，電泳約40 min，凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照。

1.2.3 引物篩選 實(shí)驗(yàn)選用的SSR引物共73對(duì)，其中48對(duì)參考Sharon等［35］的油梨SSR引物序列，25對(duì)參考Ashworth等［40］的油梨SSR引物序列。根據(jù)公式 =1-（1-1/2）n（n為樣品數(shù)， 為有多態(tài)性引物的選中概率）計(jì)算選中的有多態(tài)性引物的概率，本研究利用4個(gè)DNA樣品進(jìn)行測(cè)試，則有多態(tài)性引物的選中概率為93.75%。選取穩(wěn)定性高、重復(fù)性好、有多態(tài)性產(chǎn)物的引物對(duì)模板DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

由于引物的最佳退火溫度不同，利用TD-PCR進(jìn)行大量引物多態(tài)性篩選，反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸1 min，其后每個(gè)循環(huán)退火溫度下降1℃，13個(gè)循環(huán)；94℃變性30 s，45℃退火30 s，72℃延伸1 min，27個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物檢測(cè)用2% 瓊脂糖凝膠，120 V恒電壓電泳約40 min；PCR產(chǎn)物分離利用6%變性聚丙烯酰胺凝膠，60 W恒定功率電泳1.5-2 h，參考楊珺的銀染法［41］進(jìn)行銀染檢測(cè)。1.2.4 油梨SSR-PCR的多態(tài)性驗(yàn)證 選取較好的方法大量提取的油梨基因組DNA，選用篩選出的5對(duì)多態(tài)性引物、優(yōu)化的20 μL SSR-PCR反應(yīng)體系及TD-PCR程序?qū)μ崛〉腄NA進(jìn)行PCR擴(kuò)增驗(yàn)證，檢測(cè)DNA、優(yōu)化體系及程序是否滿足分子研究要求。

2 結(jié)果

2.1 基因組DNA的提取與檢測(cè)

3種方法提取的DNA比較：A260/A280的比值常用來(lái)表示DNA的純度，核酸蛋白檢測(cè)儀結(jié)果顯示，改良2×CTAB法產(chǎn)率最高；常規(guī)的2×CTAB法次之，試劑盒法最低；常規(guī)的2×CTAB法A260/A280值在1.5-1.7之間，部分DNA純度符合SSR的要求，改良2×CTAB法和DNA試劑盒法的該值在1.7-2.0之間，說(shuō)明DNA的純度都符合SSR的要求。DNA電泳檢測(cè)結(jié)果顯示，常規(guī)2×CTAB法大部分泳道點(diǎn)樣孔有雜質(zhì)，DNA條帶較暗，部分拖尾，有蛋白質(zhì)或者糖類雜質(zhì)以及RNA污染（圖1-A）；改良2× CTAB法提取的油梨葉片DNA條帶亮度最大且各條帶較均勻清晰，穩(wěn)定性高，雜質(zhì)較少（圖1-B）；DNA試劑盒法提取的DNA條帶最暗，亮度均勻幾乎無(wú)雜質(zhì)，DNA較純，但成本高，不利于大批量樣品DNA的提取（圖1-C）。由此選用改良2×CTAB法提取大批量油梨植物基因組DNA。

表1 油梨SSR反應(yīng)體系正交設(shè)計(jì)因素水平表

表2 SSR-PCR正交設(shè)計(jì)表L16（45）

2.2 SSR-PCR體系優(yōu)化

由圖2可見(jiàn)，正交設(shè)計(jì)SSR-PCR反應(yīng)體系的擴(kuò)增結(jié)果存在明顯差異。在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的16個(gè)組合、3次重復(fù)中：組合1、2、3、4、7、12、14擴(kuò)增條帶較弱或未擴(kuò)增出條帶，穩(wěn)定性和重復(fù)性低；組合5、9、10、11、13、15、16主帶明顯，但存在非特異性帶；組合6、8主帶明顯，無(wú)非特異性帶，但兩者相對(duì)而言第6組合擴(kuò)增條帶亮度大、清晰，且穩(wěn)定性好、重復(fù)性高。綜合比較分析，第6組合為油梨的最優(yōu)SSR-PCR反應(yīng)體系，即20 μL 總反應(yīng)體系中，含約40 ng DNA模板、1.5 mmol/L Mg2+、0.15 mmol/L dNTP、0.5 U Taq DNA聚合酶、0.5 μmol/L引物。

2.3 引物篩選結(jié)果

采用優(yōu)化的SSR-PCR反應(yīng)體系和TD-PCR程序進(jìn)行引物多態(tài)性篩選，擴(kuò)增得到清晰且特異性強(qiáng)的譜帶（圖3）；結(jié)果表明該體系擴(kuò)增不同引物時(shí)，條帶依然清晰穩(wěn)定，重復(fù)性好，因此該體系適用于油梨品種進(jìn)行SSR-PCR擴(kuò)增；對(duì)于大量引物的多態(tài)性篩選，TD-PCR省去了眾多引物退火溫度的摸索，可以減少非特異性帶的產(chǎn)生，有效提高篩選的特異性和效率。73對(duì)引物中，初步篩選出30條擴(kuò)增較好的多態(tài)性引物，多態(tài)性的引物達(dá)到41%。

圖1 三種方法提取的DNA凝膠電泳圖

圖2 SSR-PCR正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖3 油梨多態(tài)性引物篩選

2.4 油梨的SSR多態(tài)性檢測(cè)

選用已篩選出的5對(duì)多態(tài)性引物，利用優(yōu)化的SSR-PCR反應(yīng)體系和TD-PCR程序?qū)?5份油梨種質(zhì)的DNA進(jìn)行擴(kuò)增，所選用的5對(duì)多態(tài)性引物均得到很好的擴(kuò)增效果，獲得了清晰穩(wěn)定的譜帶（圖4）。電泳結(jié)果顯示該反應(yīng)體系進(jìn)行大量PCR擴(kuò)增時(shí)，條帶依然清晰穩(wěn)定，重復(fù)性好，表明建立的SSR反應(yīng)體系穩(wěn)定可靠，且篩選的引物多態(tài)性明顯，適用于油梨種質(zhì)進(jìn)行SSR-PCR擴(kuò)增。

3 討論

20世紀(jì)80年代，CTAB法開(kāi)始在國(guó)內(nèi)外廣泛應(yīng)用，CTAB是一種去污劑，既能裂解細(xì)胞又能有效沉淀多糖，因此有其獨(dú)到優(yōu)點(diǎn)［42］。在30多年的發(fā)展中，許多學(xué)者對(duì)CTAB法不斷改進(jìn)，除在技術(shù)上的改進(jìn)，大多是在DNA提取液成分配比上發(fā)生變化，并針對(duì)不同物種形成獨(dú)特的優(yōu)化提取方法。許多報(bào)道利用高鹽緩沖條件下去除植物DNA中多糖［43-46］，廣泛采取β-巰基乙醇、抗壞血酸或PVP（聚乙烯毗咯烷酮）等抗氧化劑來(lái)去除植物組織中的 多酚類物質(zhì)［47，48］。樟科植物含有大量的多糖、鞣質(zhì)、多酚、單寧等次生代謝物，在DNA提取過(guò)程中經(jīng)裂解液處理后，細(xì)胞破碎，釋放出次生代謝物，使提取液變得異常黏稠，操作困難，導(dǎo)致提取的DNA質(zhì)量差，溶解困難［49］，對(duì)PCR產(chǎn)生影響，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果不穩(wěn)定和不可靠。本研究改良2×CTAB法所提DNA濃度及純度均符合SSR-PCR擴(kuò)增的要求，且該法在DNA獲得量上優(yōu)于常規(guī)2×CTAB法和DNA試劑盒法，原因主要在于其解決了黏稠、易氧化褐變及DNA純度低等問(wèn)題。常規(guī)方法提取會(huì)使這些物質(zhì)與DNA 發(fā)生不可逆的結(jié)合使 DNA 呈褐色、黏稠，影響DNA質(zhì)量，不能用于PCR擴(kuò)增和酶切等分子生物學(xué)研究；經(jīng)多次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)與常規(guī)2×CTAB法相比，改良2×CTAB法中樣品中加入少許PVP研磨，反復(fù)用STE緩沖液進(jìn)行洗脫，同時(shí)在65℃水浴核裂解后加入150 μL 7.5 mol/L醋酸銨溶液可在很大程度上解決黏稠問(wèn)題，同時(shí)發(fā)現(xiàn)裂解后加入醋酸銨溶液冰上靜置10 min可以大量去除蛋白質(zhì)雜質(zhì)。抽提時(shí)，與上下顛倒數(shù)次相比，放入脫色搖床上反復(fù)搖蕩幾分鐘，可獲得較透明的上清液。在木本植物DNA提取中，提取液加入β-琉基乙醇、PVP（聚乙烯毗咯烷酮）等這幾種抗氧化劑去除酚類物質(zhì)是必須的，這與閆桂琴等［50］的研究結(jié)果一致。故選用改良2×CTAB法作為后期分子研究實(shí)驗(yàn)的油梨基因組DNA提取方法對(duì)油梨大量樣本進(jìn)行提取。

SSR-PCR反應(yīng)涉及諸多因素，每個(gè)因素的反應(yīng)參數(shù)對(duì)反應(yīng)體系有很大影響，確定合適的反應(yīng)參數(shù)是SSR分析的前提。SSR-PCR反應(yīng)體系中各組分均可能影響擴(kuò)增的特異性、敏感性和產(chǎn)量，采用多因素聯(lián)合優(yōu)化的正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，借助合適的正交表，利用正交表的均衡分散性和整齊可比性，可有效解決理論與實(shí)際可行的實(shí)驗(yàn)次數(shù)的矛盾，以及實(shí)際所做的有限量實(shí)驗(yàn)與要求全面掌握事物內(nèi)在規(guī)律之間的矛盾［51］。影響PCR擴(kuò)增效率的因子主要有5個(gè)，Mg2+、dNTP、Taq DNA聚合酶、DNA和引物的濃度對(duì)PCR擴(kuò)增效率都起著抑制或促進(jìn)的作用。利用正交設(shè)計(jì)優(yōu)化油梨SSR反應(yīng)體系是一種有效、適用而且簡(jiǎn)便的方法，能較好地識(shí)別SSR-PCR反應(yīng)體系中的關(guān)鍵影響因素，并優(yōu)化反應(yīng)條件。本研究利用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法建立了適合油梨SSR-PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化組合，即20 μL總反應(yīng)體系中，含約40 ng DNA模板、1.5 mmol/L Mg2+、0.15 mmol/L dNTPs、0.5 U Taq酶、0.5 μmol/L引物，這與油松［52］、鴨茅［53］、大豆［54］、東興金花茶［55］、油葵［56］、冬瓜［57］、菊花［58］等植物已報(bào)道的SSR-PCR優(yōu)化體系都有所不同，說(shuō)明不同物種的SSR-PCR優(yōu)化反應(yīng)體系存在一定差異。

SSR-PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化、建立及引物的篩選是SSR多態(tài)性標(biāo)記應(yīng)用的基礎(chǔ)。影響SSR反應(yīng)的主要因子除了Mg2+、dNTPs、Taq酶、模板等外，SSRPCR擴(kuò)增時(shí)的退火溫度也是一個(gè)關(guān)鍵要素，對(duì)擴(kuò)增條帶有明顯影響。本研究選用TD-PCR擴(kuò)增程序進(jìn)行大量SSR引物多態(tài)性篩選，發(fā)現(xiàn)TD-PCR可以有效避免退火溫度過(guò)高或過(guò)低對(duì)SSR-PCR擴(kuò)增反應(yīng)造成的影響，省去了眾多引物退火溫度的摸索，加快了實(shí)驗(yàn)進(jìn)程；可以減少非特異性帶的產(chǎn)生，有效提高篩選的特異性和效率；選用的TD-PCR引物篩選程序?yàn)榻窈笥屠鍿SR引物篩選提供一定的參考。

圖4 引物AUCR418（A）和AVD017（B）對(duì)45份油梨種質(zhì)的擴(kuò)增驗(yàn)證結(jié)果

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明改良2×CTAB法對(duì)油梨基因組DNA的提取效果最佳；20 μL SSR-PCR最優(yōu)反應(yīng)體系含約40 ng DNA模板、1.5 mmol/L Mg2+、0.15 mmol/L dNTPs、0.5 U Taq DNA聚合酶、0.5 μmol/L引物；以此體系為基礎(chǔ)進(jìn)行引物篩選，從73對(duì)油梨SSR引物中篩選出了30對(duì)擴(kuò)增條帶清晰的多態(tài)性引物。

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（責(zé)任編輯 李楠）

DNA Extraction，Optimization of SSR-PCR Reaction System and Primer Screening of Persea americana

ZHOU Hai-lan1LI Shao-peng1LI Wei-liang1HE Jun-hu2BAO Dong-hong1LI Mao-fu1
（1. Key Laboratory of Protection and Development Utilization of Tropical Crop Germplasm Resources（Hainan University），Ministry of Education / College of Horticulture and Landscape Architecture，Hainan University，Haikou 570228；2. Tropic Crops Genetic Resources Institute，Chinese Academy of Tropic Agricultural Sciences，Danzhou 571737）

This study is to establish a stable and reliable DNA extraction method，optimize the SSR-PCR reaction system，and screen the stable polymorphism primers for avocado（Persea americana Mill）SSR for providing the genetic foundation to conduct the SSR molecular marker of germplasm in avocados. Taking avocado’ leaves as the study material，3 avocado DNA extraction methods were compared，based on the L16（45）orthogonal experiment design，the SSR-PCR reaction system in avocados was optimized，and then by optimized reaction system the SSR primers were screened. To further test the stability of the optimized SSR-PCR system，the germplasms in 45 pieces of avocados were amplified by PCR using 5 pairs of polymorphism primers. The results showed that：among 3 DNA extraction methods of conventional 2×CTAB method，improved 2×CTAB method，and plant DNA kit method，the improved 2×CTAB method was the best regarding the extraction effect of avocado genomic DNA. The optimal SSR-PCR reaction system in avocados was：a total volume of 20 μL containing 40 ng of genomic DNA，1.5 mmol/L Mg2+，0.15 mmol/L dNTPs，0.5 U Taq DNA polymerase，0.5 μmol/L primer. Based on the above optimized reaction system，30 pairs of polymorphism primers with clear bands were screened from 73 SSR primers of avocados，indicating that the reaction system can be used forthe further study of SSR markers in avocados. The bands of stability test were clear，showing that the optimized system was stable and reliable. Thus，improved 2×CTAB method can be used in DNA extraction of plentiful samples，and the optimized SSR-PCR reaction system and the 30 polymorphism primers can be utilized for the further study of SSR markers in avocados.

Persea americana Mill；DNA extraction；SSR marker；system optimization；primer screening

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.04.019

2015-09-16

海南省星火產(chǎn)業(yè)帶專項(xiàng)資金項(xiàng)目（HNXH201532），農(nóng)業(yè)部熱帶作物種質(zhì)資源保護(hù)項(xiàng)目（15RZZY-23）

周海蘭，女，碩士研究生，研究方向：種質(zhì)資源，E-mail：398803451@qq.com；李紹鵬為本文并列第一作者

李茂富，男，碩士，副教授，研究方向：果樹(shù)栽培生理；E-mail：hafu98022@126.com