肖松+周棱波+張國(guó)兵+邵明波+乙引+張立異

摘要：醬香型白酒又稱(chēng)茅香型白酒，其中最有名的代表就是國(guó)酒茅臺(tái)，主要原料為優(yōu)質(zhì)糯高粱。由于其獨(dú)特的釀造工藝，對(duì)高粱品質(zhì)有特殊的要求。目前，對(duì)醬香型酒用糯高粱種質(zhì)資源遺傳多樣性缺乏全面的調(diào)查，已經(jīng)妨礙了酒用高粱品種的選育。因此，采用28對(duì)SSR分子引物對(duì)145個(gè)貴州酒用糯高粱種質(zhì)進(jìn)行全基因組掃描，共得到61個(gè)多態(tài)位點(diǎn)，引物位點(diǎn)的多態(tài)信息含量指數(shù)（polymorphism information content，PIC）值范圍為0.02～0.66，平均值為0.42，Jacard遺傳相似系數(shù)（genetics similarity，GS）變異范圍為 0.60～0.98，平均值為0.71。根據(jù)高粱資源親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近，非加權(quán)組平均法 （unweighted pair-group method with arithmetic mean，UPGMA）聚類(lèi)分析結(jié)果顯示，在GS值為0.63 水平上主要聚集形成2個(gè)主要的類(lèi)群（GⅠ、GⅡ）。進(jìn)一步進(jìn)行主坐標(biāo)分析（principal coordinates analysis，PCOA）顯示，這批育種資源由大、小2個(gè)亞群組成。試驗(yàn)結(jié)果表明，貴州白酒用糯高粱育種資源具有較高的遺傳相似性，遺傳多樣性水平較低，遺傳背景較為狹窄，研究結(jié)果對(duì)貴州省今后的醬香型白酒用糯高粱的選育具有一定的指導(dǎo)意義。

關(guān)鍵詞：糯高粱；SSR分子標(biāo)記；遺傳多樣性；聚類(lèi)分析；主坐標(biāo)分析

中圖分類(lèi)號(hào)： S514.03

文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2016）04-0045-05

高粱（Sorghum bicolor L.）是全世界種植的第五大禾谷類(lèi)作物，作為C4植物的模式作物，因其光合效率高、耐高溫干旱、耐貧瘠等優(yōu)點(diǎn)而備受關(guān)注。高粱栽培品種根據(jù)用途不同一般可以分為3種類(lèi)型：甜高粱、飼料高粱以及作為糧食的籽粒高粱，在籽粒高粱中又將直鏈淀粉含量在0～5%之間的稱(chēng)為糯高粱[1]。釀造茅臺(tái)酒等醬香型高檔白酒的主要原料是優(yōu)質(zhì)籽粒用糯高粱[2]。面對(duì)紅纓子等貴州省主栽糯高粱品種的產(chǎn)量無(wú)法滿足生產(chǎn)需求的現(xiàn)狀[3]，貴州省的酒用糯高粱育種工作開(kāi)展已經(jīng)迫在眉睫。全面了解種質(zhì)資源的遺傳多樣性信息是選擇雜交親本、建立雜種優(yōu)勢(shì)群的基礎(chǔ)，對(duì)于選育優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)和抗病的糯高粱新品種具有指導(dǎo)意義，對(duì)于糯高粱遺傳多樣性的研究、遺傳資源的保存與利用有重要意義。

分子標(biāo)記技術(shù)在遺傳多樣性分析的研究中有著重要地位，主要包括限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性（rapid amplify polymorphism，RAPD）、簡(jiǎn)單序列重復(fù)長(zhǎng)度多態(tài)性（simple sequence repeats，SSR）和擴(kuò)增酶切片段長(zhǎng)度多態(tài)性（amplification fragment length polymorphism，AFLP）等分子標(biāo)記技術(shù)。在高粱遺傳作圖、遺傳多樣性等研究中，分子標(biāo)記技術(shù)有著豐富的理論基礎(chǔ)。Chittenden等于1994年利用276個(gè)RFLP位點(diǎn)完成第1個(gè)高粱連鎖圖[4]。Ayana等利用RAPD標(biāo)記對(duì)埃塞俄比亞、厄立特里亞高粱的遺傳多樣性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)來(lái)自不同地區(qū)的高粱遺傳多樣性并不豐富，在聚類(lèi)中不能按照地域來(lái)進(jìn)行類(lèi)群劃分[5]。Boivin等用AFLP、RFLP分子標(biāo)記，并結(jié)合形態(tài)學(xué)標(biāo)記對(duì)飽和高粱完成了完整遺傳繪圖，并且得出了AFLPs以及基因組分布不均勻的結(jié)論[6]。在眾多分子標(biāo)記中，由于SSR分子標(biāo)記具有較高的多態(tài)性水平、遍布于整個(gè)基因組、檢測(cè)手段簡(jiǎn)單快速等特點(diǎn)，自Brown等于1996年開(kāi)發(fā)了49對(duì)擴(kuò)增多態(tài)性良好的高粱SSR標(biāo)記引物[7]以來(lái)，SSR標(biāo)記在高粱的遺傳多樣性研究中得到更多的關(guān)注。余傳漲等利用52個(gè)SSR標(biāo)記調(diào)查了我國(guó)41個(gè)高粱品種的遺傳多樣性，并通過(guò)聚類(lèi)分析將這些高粱分為籽粒高粱、甜高粱2個(gè)類(lèi)群[1]。張晗等利用SSR標(biāo)記對(duì)國(guó)內(nèi)外253份高粱品種進(jìn)行遺傳多樣性分析，得出中國(guó)高粱與國(guó)外高粱之間遺傳分化明顯的結(jié)論[8]。趙香娜等利用24對(duì)SSR引物研究了206份國(guó)內(nèi)外甜高粱種質(zhì)資源的遺傳變異，利用遺傳相似系數(shù)矩陣，按UPGMA方法對(duì)206份甜高粱品種進(jìn)行聚類(lèi)分析，將其分為2個(gè)大的類(lèi)群[9]。倪先林等利用25對(duì)SSR標(biāo)記評(píng)價(jià)了29份糯高粱種質(zhì)資源，共得到了59個(gè)等位基因，通過(guò)聚類(lèi)得出糯高粱品種的親緣關(guān)系與地理來(lái)源關(guān)系不大的結(jié)論[10]。

近年來(lái)，由于貴州省種植的酒用糯高粱品種單一，紅纓子等主栽品種農(nóng)藝性狀較差，產(chǎn)量水平受到限制，不利于機(jī)械化生產(chǎn)，因此選育優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)、適合機(jī)械化生產(chǎn)的糯高粱新品種迫在眉睫。高粱種質(zhì)資源作為其遺傳改良的重要來(lái)源，是培養(yǎng)高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)高粱新品種的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。針對(duì)貴州省醬香型白酒用高粱的種質(zhì)資源遺傳多樣性的研究較少。所以本研究對(duì)來(lái)自貴州、四川地區(qū)的145份醬香酒用高粱種質(zhì)資源進(jìn)行基因分型，以期了解酒用糯高粱的遺傳多樣性和群體結(jié)構(gòu)，為拓寬群體遺傳基礎(chǔ)，組配選育優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的抗病、抗蟲(chóng)新品種提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

145份貴州省酒用糯高粱育種資源，均由貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院旱糧研究所高粱研究課題組提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 DNA提取 DNA的提取參照陳宏的CTAB法[11]，用核酸蛋白測(cè)定儀檢測(cè)DNA濃度，并用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)純度，存于-20 ℃冰箱中備用。

根據(jù)每個(gè)標(biāo)記的等位基因出現(xiàn)與否，將標(biāo)記轉(zhuǎn)換為0和1的二進(jìn)制矩陣。將該矩陣作為輸入文件，利用NTSYSPC V2.0軟件[12]，計(jì)算Jacard遺傳相似性系數(shù)，進(jìn)行PCoA分析、UPGMA聚類(lèi)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 分子標(biāo)記掃描

利用28對(duì)SSR引物對(duì)145份糯高粱育種資源進(jìn)行掃描，一共獲得了61個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，最少擴(kuò)增多態(tài)性片段為1條，最多擴(kuò)增5條，平均擴(kuò)增2.18條。引物txp75的多態(tài)性最高，擴(kuò)增了5條多態(tài)性片段。PIC值計(jì)算結(jié)果（表2）顯示，PIC值范圍為0.02～0.66，平均值為0.42；較多引物的PIC值出現(xiàn)在0.21～0.30范圍，所占比例為20%；而較少的引物PIC值出現(xiàn)在0～0.10、0.41～0.50這2個(gè)范圍，其比例均為10%；PIC值在0.61～0.70之間引物對(duì)應(yīng)有txp38、txp120、txp75、txp50、txp61。其中PIC值在0.21～0.30范圍內(nèi)的引物最多，有6對(duì)，分別是txp69、txp217、txp38、txp12、txp47、txp17。

2.2 遺傳多樣性和群體結(jié)構(gòu)分析

根據(jù)61個(gè)SSR標(biāo)記的基因分型數(shù)據(jù)，計(jì)算了品種（系）間的Jacard遺傳相似系數(shù)（genetic similarity，GS），其變異范圍為 0.60～0.98，平均值0.71。利用非加權(quán)組平均法進(jìn)行聚類(lèi)分析，UPGMA結(jié)果顯示，這1批糯高粱育種根據(jù)親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近聚集在一起（圖2）。145份糯高粱資源在GS值0.63水平上主要聚集形成2個(gè)主要的類(lèi)群：第1個(gè)群（GⅠ）由2個(gè)亞群組成，其中的1個(gè)亞群主要由貴州高粱主栽品種紅高粱的衍生品系所組成，而且穗型多呈側(cè)披散狀；第2個(gè)群（GⅡ）沒(méi)有清晰地劃分為幾個(gè)亞群，主要包含其他不同血緣關(guān)系的育種資源。

為了調(diào)查試驗(yàn)材料的群體結(jié)構(gòu)，利用61個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)標(biāo)記進(jìn)行PCoA分析。如圖3所示，第1主坐標(biāo)（PCo-1）、第2主坐標(biāo)（PCo-2）分別解釋5.6%、3.7%的群體遺傳變異。145份高粱材料聚集形成了2個(gè)群：右上側(cè)的第1類(lèi)群（group Ⅰ）包含大多數(shù)材料，在PCo-1、PCo-2軸的2個(gè)方向上都較為擴(kuò)散。左下側(cè)的第2類(lèi)群（group Ⅱ）只包括了16個(gè)高粱材料，聚集較為緊密，主要由血緣關(guān)系與紅纓子等貴州糯高粱品種較遠(yuǎn)的外省高粱資源組成。

3 討論

以國(guó)酒茅臺(tái)為龍頭的釀酒業(yè)是貴州省的傳統(tǒng)支柱產(chǎn)業(yè)和特色優(yōu)勢(shì)產(chǎn)業(yè)，也是貴州省財(cái)政收入的重要來(lái)源之一。雖然貴州省高粱主栽品種紅纓子等在產(chǎn)量方面與以往推廣品種相比有所提高，但仍不能滿足貴州省釀酒發(fā)展的迫切需求，且雜交高粱引種表現(xiàn)病蟲(chóng)害嚴(yán)重、轉(zhuǎn)基因安全等問(wèn)題[3，13-14]。因此，應(yīng)全面了解貴州醬香型酒用高粱種質(zhì)資源的遺傳多樣性信息，以期為培育優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)和抗病的育種工作選出雜交親本，并為建立雜種優(yōu)勢(shì)群提供理論指導(dǎo)。

在本項(xiàng)研究中，利用SSR分子標(biāo)記掃描了145份貴州省酒用糯高粱材料，初步了解貴州省糯高粱現(xiàn)有育種資源的遺傳多樣性水平。試驗(yàn)結(jié)果表明，貴州省白酒用糯高粱具有較高的遺傳相似性，說(shuō)明這批育種資源具有較低的遺傳多樣性。而UPGMA聚類(lèi)不能將這些高粱育種資源清晰地劃分成不同的類(lèi)群，只是在GS=0.68的位置大概將其劃分為2個(gè)類(lèi)群。在其他的研究中也得到相似的結(jié)果。Ayana等對(duì)埃塞俄比亞和厄立特里亞高粱的遺傳多樣性研究中，發(fā)現(xiàn)不同地區(qū)的高粱遺傳多樣性并不豐富，在聚類(lèi)中不能按照地域來(lái)進(jìn)行劃分[5]。Ritter等在2007年利用277個(gè)AFLP標(biāo)記對(duì)95份美國(guó)甜高粱、籽粒高粱進(jìn)行掃描，通過(guò)聚類(lèi)分析發(fā)現(xiàn)，并不能將2種高粱按照品種的分類(lèi)而在遺傳學(xué)上將其分為2個(gè)類(lèi)群[15]。余傳漲等在2010年利用52個(gè)SSR標(biāo)記調(diào)查了41個(gè)高粱品種的遺傳多樣性，通過(guò)聚類(lèi)分析將這些高粱分為籽粒高粱、甜高粱2個(gè)類(lèi)群，但是卻不能清晰地劃分2類(lèi)高粱之間的遺傳界限[1]。張晗等在2011年利用SSR標(biāo)記，以69份國(guó)外品種為對(duì)照，對(duì)12個(gè)地區(qū)184份中國(guó)高粱地方品種進(jìn)行的遺傳多樣性分析結(jié)果表明，中國(guó)高粱與國(guó)外高粱之間遺傳分化明顯，而中國(guó)高粱地方品種地區(qū)間和類(lèi)型間分化極弱，不能將這些高粱按地區(qū)或類(lèi)型分開(kāi)[8]。目前出現(xiàn)的高粱遺傳多樣性分析不能明確劃分類(lèi)群的原因，可能是由于栽培品種與自然品種高頻的異型雜交，這與頻繁的人類(lèi)活動(dòng)影響密不可分[5]。本研究的PCoA分析結(jié)果顯示，貴州省糯高粱育種資源多數(shù)具有紅纓子的血緣，表現(xiàn)為植株高大、無(wú)效分蘗較多、長(zhǎng)穗側(cè)散披狀。只有少數(shù)外來(lái)資源與其血緣關(guān)系較遠(yuǎn)，表現(xiàn)較大的表型差異，植株較矮，穗型直立緊湊。

本研究結(jié)果顯示，針對(duì)貴州省醬香型白酒用糯高粱育種資源具有較高的遺傳相似性，遺傳多樣性水平較低，從分子水平解釋了現(xiàn)有糯高粱種質(zhì)資源貧乏、遺傳基礎(chǔ)狹窄、產(chǎn)量水平低下等問(wèn)題。因此，在我們今后的高粱育種中，應(yīng)該增加種質(zhì)資源的遺傳多樣性，利用標(biāo)記輔助育種等手段，選育優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)抗病、適合機(jī)械化生產(chǎn)、符合醬香型白酒釀造工藝的新品種，更好地為貴州特色優(yōu)勢(shì)產(chǎn)業(yè)服務(wù)。

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