吳　莉，趙　嫻，柯騰飛，陳澤谷，陸　林，魏韓笑,張承磊，劉　流△

(1.昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)影像科 650032；2.昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院整形外科 650032；3.中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬?？卺t(yī)院放射科，?？?570208；4.昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院血管外科 650032)

自體內(nèi)皮祖細(xì)胞促進(jìn)組織工程骨血管化的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究

吳莉1，趙嫻2，柯騰飛1，陳澤谷3，陸林1，魏韓笑2,張承磊4，劉流2△

(1.昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)影像科 650032；2.昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院整形外科 650032；3.中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬?？卺t(yī)院放射科，?？?570208；4.昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院血管外科 650032)

[摘要]目的探討自體內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)在體內(nèi)、外促進(jìn)組織工程骨血管化的能力。方法將兔自體外周血EPCs及骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)按聯(lián)合培養(yǎng)時細(xì)胞增殖率最大時配比(EPCs∶BMSCs=1∶2)體外培養(yǎng)(聯(lián)合培養(yǎng)組)，在體外采用實(shí)時定量PCR方法檢測成骨相關(guān)細(xì)胞因子Osteonectin、Osteopotin、Col-1及成血管相關(guān)細(xì)胞因子血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)表達(dá)，于培養(yǎng)3、7、14 d觀察表達(dá)量的變化并與單純EPCs及BMSCs組比較；將單純EPCs、BMSCs及聯(lián)合培養(yǎng)組的組織工程骨移植到兔四肢肌袋內(nèi)，于移植后2、4、8周觀察組織工程骨生長情況，同時制成組織切片行CD34、CD105、ZO-1免疫組織化學(xué)染色，采用Image-Pro plus 6.0圖像分析軟件，測量光密度值，比較3組工程骨表達(dá)量變化。結(jié)果3、7、14 d Osteonectin、Osteopotin、Col-1、VEGF各組表達(dá)均逐漸增高，其中聯(lián)合培養(yǎng)組增高最明顯，且各時間點(diǎn)表達(dá)量最高(P<0.01)；2、4、8周兔四肢肌袋內(nèi)的組織工程骨中聯(lián)合培養(yǎng)組細(xì)胞復(fù)合的工程骨隨時間延長成骨增加最明顯，新生血管長入最多，免疫組織化學(xué)顯示CD34、CD105、ZO-1表達(dá)最明顯(P<0.01)。 結(jié)論自體EPCs與BMSCs相互作用，在體內(nèi)、體外均可促進(jìn)組織工程骨血管化。

[關(guān)鍵詞]干細(xì)胞；內(nèi)皮, 血管;間充質(zhì)干細(xì)胞；新生血管化, 生理性；組織工程骨

近些年來組織工程技術(shù)研究在骨缺損修復(fù)中顯示出巨大的潛力，組織工程骨移植入體內(nèi)，骨的血管化、成骨破骨細(xì)胞再生、骨端融合是移植骨成活的3個重要環(huán)節(jié)，其中血管化是前提，是組織工程骨內(nèi)復(fù)合的干細(xì)胞存活、增殖、轉(zhuǎn)化為成骨組織替代支架的決定因素。目前組織工程骨的血管化不足、缺乏功能性血管已成為其發(fā)展進(jìn)入臨床應(yīng)用的最大障礙[1]。國內(nèi)外學(xué)者采用多種方法加快組織工程骨內(nèi)部血管網(wǎng)的形成使新生血管或血管網(wǎng)與宿主血管溝通，如改善或改造支架結(jié)構(gòu)、成分，干細(xì)胞移植時加入血管生成因子及將內(nèi)皮細(xì)胞與成骨細(xì)胞共同培養(yǎng)等方法[2]，但均不能生成保證細(xì)胞存活的足夠密度的微血管網(wǎng)。

表1　引物序列

研究報道，內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells,EPCs)不僅可以促進(jìn)新生血管生成，還可促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)成骨[3]。因此本研究將自體來源的EPCs與骨髓MSCs(BMSCs)直接共培養(yǎng)形成共培養(yǎng)體系，體外與單純培養(yǎng)的EPCs與BMSCs兩組細(xì)胞比較成血管相關(guān)細(xì)胞因子血管內(nèi)皮生長因子(vacular endothelial growth factor,VEGF)及成骨細(xì)胞因子(Osteonectin、Osteopotin、Col-1)的表達(dá)差異；將上述3組細(xì)胞復(fù)合到包被纖維粘連蛋白的部分脫蛋白生物骨(partially deproteinised bone，PDPB)上于兔四肢肌袋內(nèi)培養(yǎng)，不同時間大體觀察及免疫組織化學(xué)檢測成骨及微血管化能力的差異，了解EPCs在BMSCs成骨中的促進(jìn)作用。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)儀器5% CO237 ℃培養(yǎng)箱購自Thermo Scientific公司，低溫離心機(jī)購自北京醫(yī)用離心機(jī)廠，RT-PCR儀購自Bio-Rad公司，倒置相差顯微鏡購自O(shè)lympus公司；L-DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)購自Hyclone公司，胰蛋白酶、Trizol購自Takara公司，PDPB由本實(shí)驗(yàn)組自制[4]，自體外周血EPCs及BMSCs由本實(shí)驗(yàn)組自行分離培養(yǎng)鑒定后凍存，本次實(shí)驗(yàn)為采用復(fù)蘇后第三代細(xì)胞，兔CD34、CD105、ZO-1一抗購自北京博奧森公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Thermo Fisher Scientific公司，熒光定量PCR試劑盒購自寶生物工程有限公司，引物設(shè)計由寶生物工程有限公司完成，Loading Buffer、DNA分子標(biāo)記物購自 Fermantas公司。

1.2方法

1.2.1外周血EPCs促進(jìn)BMSCs成骨細(xì)胞因子及成血管能力的體外檢測取本實(shí)驗(yàn)組分離培養(yǎng)鑒定后[5]凍存的自體第3代EPCs及BMSCs復(fù)蘇后培養(yǎng)3 d，將單純EPCs(EPCs組)、BMSCs(BMSCs組)及共培養(yǎng)細(xì)胞(EPCs∶BMSCs=1∶2，聯(lián)合培養(yǎng)組)[5]3組細(xì)胞種植于9塊6孔板，每孔加1.5 mL含15% FBS的L-DMEM培養(yǎng)基，置培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每3天換1次液。第3、7、14天分別取3塊板，Trizol法進(jìn)行總RNA的提取，將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行實(shí)時定量PCR反應(yīng)，引物見表1，以上步驟按試劑盒說明書進(jìn)行操作。用2-△△Ct計算Osteonectin、Osteopotin、Col-1、VEGF的相對表達(dá)量，以實(shí)驗(yàn)組與對照組表達(dá)量差異倍數(shù)=實(shí)驗(yàn)組2-△△Ct/對照組2-△△Ct表示。

1.2.2復(fù)合3組種子細(xì)胞的組織工程骨體內(nèi)實(shí)驗(yàn)取本實(shí)驗(yàn)組凍存的自體第3代EPCs及BMSCs復(fù)蘇，將3組細(xì)胞復(fù)合在4 ℃冰箱儲存的包被纖維粘連蛋白大小為0.5 cm×0.5 cm×0.3 cm的PDPB上：將PDPB置于裝有DMEM的培養(yǎng)皿中預(yù)濕后加入3組細(xì)胞，細(xì)胞濃度均為0.5×106/mL，總量為20 μL，培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4 h后置96孔板中，加完全培養(yǎng)基至總量為100 μL后培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液，第4天將復(fù)合3組細(xì)胞的組織工程骨異位移植到兔四肢肌袋內(nèi)(移植兔即為復(fù)蘇的第3代EPCs及BMSCs的宿主，從而確保了自體移植)，分別于2、4、8周觀察工程骨與周圍軟組織的變化。各時間點(diǎn)每組取3塊工程骨制作成切片，每塊組織取中心部分連續(xù)切片3張，免疫組織化學(xué)染色CD34、CD105、ZO-1，每張切片隨機(jī)拍3個視野，用Image-Pro plus 6.0圖像分析軟件，得到陽性細(xì)胞平均光密度值，比較各組工程骨內(nèi)隨時間變化CD34、CD105、ZO-1表達(dá)量變化。

2結(jié)果

2.1體外3、7、14 d Osteonectin、Osteopotin、Col-1、VEGF表達(dá)變化采用實(shí)時熒光半定量分析，計算Osteopotin、Oteonectin、Col-1的表達(dá)量，此時以EPCs組為對照組，聯(lián)合培養(yǎng)組及BMSCs組為實(shí)驗(yàn)組，結(jié)果顯示隨著時間延長Osteopotin、Osteonectin、Col-1 3個指標(biāo)相對表達(dá)量逐漸增加，各時間點(diǎn)以聯(lián)合培養(yǎng)組增加最明顯，14 d為最高；計算VEGF時以BMSCs組為對照組，EPCs組及聯(lián)合培養(yǎng)組為實(shí)驗(yàn)組，結(jié)果顯示VEGF隨時間延長，各時間點(diǎn)相對表達(dá)量值明顯增大，以聯(lián)合培養(yǎng)組最明顯，14 d為最高。見圖1。

A:Osteonectin ;B:Osteopotin ;C:Col-1 ;D:VEGF;用2-△△Ct計算相對表達(dá)量，以實(shí)驗(yàn)組/對照組相對比值為計算倍數(shù)。

2.2第2、4、8周組織工程骨異位移植大體觀察及免疫組織化學(xué)染色檢測CD34、CD105、ZO-1表達(dá)情況

2.2.1第2、4、8周異位移植骨大體觀察情況第2周見肌袋邊緣軟組織包裹組織工程骨，與工程骨局部相連，但組織工程骨邊緣銳利，切面可見明顯工程骨孔隙；第4周包繞工程骨軟組織增多，工程骨表面變紅軟組織增厚，邊緣變鈍，部分切面孔隙內(nèi)見鮮紅軟組織填充；第8周軟組織進(jìn)一步包裹工程骨，與其分界不清，工程骨邊緣圓潤，切面大部分孔隙由鮮紅軟組織填充，以上現(xiàn)象聯(lián)合培養(yǎng)細(xì)胞組最明顯(圖2A～C)，其次為BMSCs組。

2.2.2第2、4、8周CD34、CD105、ZO-1表達(dá)情況隨著時間延長，組織內(nèi)表達(dá)CD34、CD105、ZO-1的陽性細(xì)胞均增多，第2周EPCs及聯(lián)合培養(yǎng)細(xì)胞組見少量陽性細(xì)胞，BMSCs組未見陽性細(xì)胞；第4周逐漸圍成管腔形成新生血管，少量管腔內(nèi)其內(nèi)可見紅細(xì)胞；第8周，見明顯新生血管管腔且部分與宿主血管溝通。見圖2D～L。采用Image-Pro plus 6.0圖像分析軟件測量陽性細(xì)胞光密度值，第2、4、8周3組間用單因素方差分析進(jìn)行比較：F2周=5.537,P2周=0.008，F(xiàn)4周=24.167，P4周=0.000，F(xiàn)8周=6.541,P8周=0.004，均P<0.01，第2、4、8周各組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，其中聯(lián)合培養(yǎng)組陽性細(xì)胞光密度值在各時間點(diǎn)最高，進(jìn)一步兩兩比較見圖2M～O。

A～C:聯(lián)合培養(yǎng)細(xì)胞組生長大體觀察;D～F:聯(lián)合培養(yǎng)細(xì)胞組CD34(×200);G～I(xiàn):聯(lián)合培養(yǎng)細(xì)胞組CD105(×200);J～L:聯(lián)合培養(yǎng)細(xì)胞組ZO-1(×200)；M～O：聯(lián)合培養(yǎng)細(xì)胞組第CD34、CD105、ZO-1表達(dá)分析圖;a：P<0.05，與EPCs組比較；b：P<0.05，與聯(lián)合培養(yǎng)組比較；c：P<0.05，與BMSCs組比較。

圖22、4、8周組織工程骨異位移植聯(lián)合培養(yǎng)細(xì)胞組大體觀察及免疫組織化學(xué)CD34、CD105、ZO-1表達(dá)情況

3討論

組織工程骨重建是個復(fù)雜的過程，不僅涉及骨生成，還涉及血管生成。組織工程骨技術(shù)中種子細(xì)胞復(fù)合到可降解的生物載體上及時形成功能性血管才能保證種子細(xì)胞的存活[1]。在細(xì)胞和分子水平了解骨和血管生成機(jī)制及其相互關(guān)系和作用，有助于組織工程骨的存活及與宿主骨的整合，從而修復(fù)骨缺損[6]。BMSCs有高度自我更新及多向分化潛能，在體內(nèi)、體外不同的微環(huán)境下均可誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞，又由于其獨(dú)特的免疫調(diào)節(jié)作用，取材容易，不涉及倫理道德等特點(diǎn)，是組織工程應(yīng)用最多的種子細(xì)胞[7]。但只使用一種細(xì)胞作為種子細(xì)胞誘導(dǎo)成骨有一定的局限性，很多時候復(fù)合在組織工程支架內(nèi)的細(xì)胞即使同時移植了成骨所需因子，由于未形成與宿主的有效血液循環(huán)，沒有營養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)，在植入后很短時間就會死亡[2]，組織工程支架上的種子細(xì)胞只有在有氧代謝、細(xì)胞灌注充足，保證合理的營養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)和代謝產(chǎn)物的排出才能存活[8-9]。研究顯示移植復(fù)合一種種子細(xì)胞的支架結(jié)構(gòu)后，周圍宿主血管內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)的擴(kuò)散深度僅約150 μm/h[10]，尤其對于體積較大的工程骨，營養(yǎng)物質(zhì)無法很快進(jìn)入支架內(nèi)部，從而使中心復(fù)合的干細(xì)胞壞死，無法成骨。研究者曾采用人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞與間充質(zhì)細(xì)胞聯(lián)合移植促進(jìn)組織工程骨的血管化，但由于上述兩種細(xì)胞分化能力較差，會出現(xiàn)明顯的移植后凋亡，因此并未被廣泛應(yīng)用。EPCs是內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞，與造血干細(xì)胞表達(dá)相同表面標(biāo)志物，存在于臍帶血、骨髓及外周血中，骨髓是其最主要的來源，在前炎癥因子等的刺激下，可遷移到外周血及組織中，分泌VEGF，其與EPCs上的VEGF受體特異性結(jié)合，活化受體細(xì)胞內(nèi)段偶聯(lián)的絡(luò)氨酸激酶，催化下游的信號蛋白從而促使EPCs增殖并定向向內(nèi)皮細(xì)胞分化[11]，促進(jìn)新生血管管腔形成，在新生血管生成中起重要作用[12]。有研究將VEGF165基因通過腺病毒載體轉(zhuǎn)染至內(nèi)皮祖細(xì)胞，不僅提高了內(nèi)皮祖細(xì)胞分泌VEGF效率，同時也提高了EPCs自身增殖能力[13]，從而表明VEGF是EPCs促進(jìn)血管生成中最重要的因子。有研究證明[14]粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)可動員外周血EPCs細(xì)胞，提高VEGF和基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1(SDF-1)的表達(dá)，增強(qiáng)EPCs增殖能力和歸巢能力。

BMSCs通過旁分泌分泌多種可溶性細(xì)胞因子如VEGF、G-CSF、骨形成蛋白-2(bone morphogeneticp roteins-2,BMP-2)等參與EPCs促進(jìn)新生血管管腔形成過程，VEGF及G-CSF可被EPCs利用，進(jìn)一步促進(jìn)EPCs新生血管及形成血管管腔[15]。有研究報道顯示[16]BMSCs與EPCs通過直接接觸和旁分泌信號表達(dá)相互作用，促進(jìn)血管和骨的形成：直接接觸改變共培養(yǎng)環(huán)境，上調(diào)黏附蛋白、生長因子等細(xì)胞因子的分泌，其中BMP-2與VEGF間的相互作用起著很重要的作用[17]。本實(shí)驗(yàn)將自體EPCs及BMSCs按照最佳比例(1∶2)共同培養(yǎng)形成聯(lián)合培養(yǎng)體系并復(fù)合在組織工程支架上，體外培養(yǎng)3、7、14 d檢測顯示，聯(lián)合培養(yǎng)細(xì)胞組成骨相關(guān)因子Osteopotin、Osteonectin、Col-1表達(dá)量較BMSCs組及EPCs組明顯增加(P<0.01)，14 d最高，可見將兩種細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng)促進(jìn)了骨及新生血管的生成。另有報道顯示BMSCs可在低氧環(huán)境中釋放多種血管生成因子及抑制BMSCs細(xì)胞向脂肪細(xì)胞及成骨、破骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化，在這里起主要作用的調(diào)節(jié)因子是作為轉(zhuǎn)錄因子的低氧誘導(dǎo)因子(hypoxia-inducing factor 1,HIF-1)，它可以通過活化內(nèi)皮生長因子調(diào)節(jié)血管形成。在低氧條件下，HIF-1的α亞型呈指數(shù)上調(diào)，刺激了多種血管形成蛋白如VEGF等級聯(lián)式地增加，從而促進(jìn)組織工程骨內(nèi)新生血管的形成[18-19]。BMP-2既可由BMSCs分泌，其亦是EPCs分泌的重要生長因子[20]，在移植后15 min內(nèi)即可促進(jìn)BMSCs成骨分化[21-23]，將EPCs與BMSCs采用Transwell小室間接共培養(yǎng)，可明顯提高BMSCs的干性功能、增殖和分化能力及成骨能力，溫麗[24]認(rèn)為是EPCs旁分泌的細(xì)胞因子所起的作用，即在EPCs旁分泌因子的作用下，BMSCs增加了VEGF及BMP-2等的分泌，從而促進(jìn)了新生血管的形成及成骨。

本實(shí)驗(yàn)將聯(lián)合3組種子細(xì)胞的組織工程骨移植至兔四肢肌袋內(nèi)使其生長分化，觀察其變化，培養(yǎng)2個月后，聯(lián)合培養(yǎng)細(xì)胞體系復(fù)合的組織工程支架未出現(xiàn)排異反應(yīng)，且逐步降解，由膠原、骨小梁及新生骨替代，且其內(nèi)見大量表達(dá)CD34、CD105、ZO-1的血管內(nèi)皮細(xì)胞、部分形成血管腔結(jié)構(gòu)且與周圍軟組織內(nèi)血管溝通，代表組織工程骨移植成功且血管化良好，認(rèn)為EPCs可加快組織工程骨內(nèi)新生血管及血管網(wǎng)的形成，增加BMSCs的存活數(shù)量，提高其增殖和成骨轉(zhuǎn)化能力。CD34是特異性的血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物，能突出顯示較小的不成熟的微血管和單個內(nèi)皮細(xì)胞，然而成熟的血管內(nèi)皮細(xì)胞CD34也可表現(xiàn)為陽性；本研究還采用新生血管特異性標(biāo)記CD105，其是研究腫瘤、組織工程移植物及血管病變治療后探討新生血管生長能力的重要指標(biāo)。ZO-1是緊密連接蛋白，其表達(dá)代表血管為功能性血管，可見流動血流通過，ZO-1與CD105陽性說明新生血管為功能性血管，具有攜帶營養(yǎng)物質(zhì)帶走代謝產(chǎn)物的功能[25]。

本實(shí)驗(yàn)將兩種細(xì)胞共同培養(yǎng)形成聯(lián)合培養(yǎng)體系，無論在體內(nèi)、體外均增加了成骨和成血管因子的表達(dá)水平，說明EPCs不僅促進(jìn)組織工程骨血管化的形成，還促進(jìn)BMSCs成骨，認(rèn)為這是在兩種細(xì)胞直接或間接相互作用基礎(chǔ)上形成的，盡管本研究顯示了這一結(jié)果，但兩細(xì)胞相互作用的確切分子機(jī)制還沒有完全明確，有待于進(jìn)一步研究。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果為自體細(xì)胞復(fù)合的組織工程骨應(yīng)用于臨床提供了理論基礎(chǔ)。

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Autologous endothelial progenitor cells promote the neovascularization of tissue engineering bone in vitro and vivo*

WuLi1,ZhaoXian2,KeTengfei1,ChenZegu3,LuLin1,WeiHanxiao2,ZhangChenglei4,LiuLiu2△

(1.DepartmentofMedicalImaging,theFirstAffiliatedHospitalofKunmingMedicalUniversity,Kunming650032,China;2.DepartmentofPlasticSurgery,theFirstAffiliatedHospitalofKunmingMedicalUniversity,Kunming650032,China;3.DepartmentofRadiology,theAffiliatedHaikouHospitalofXiangyaSchoolofMedicine,CentralSouthUniversity,Haikou570208,China;4.DepartmentofVascularSurgery,theFirstAffiliatedHospitalofKunmingMedicalUniversity,Kunming650032,China)

[Abstract]ObjectiveInvestigate the ability of autologous endothelial progenitor cells (EPCs) in promoting the neovascularization of tissue engineering bone in vitro and vivo.MethodsCo-culture EPCs drived from autologous peripheral blood and mesenchymal stem cells drived from bone marrow (BMSCs) at the best proportion of 1∶2 which was the largest cell proliferation rate in vitro,osteogenesis related cytokines Osteonectin,Osteopotin,Collagen Type 1(Col-1) and angiogenesis related cytokine VEGF in vitro by using real-time quantitative polymerase chain reaction(PCR),and compared with pure EPCs and BMSCs groups at 3rd,7th and 14th day;the tissue engineering bone seeded with EPCs,BMSCs and co-culture cells (EPCs∶BMSCs=1∶2) were transplanted into rabbit limbs muscle,the growing states of tissue engineering bone were observed at 2,4 and 8 weeks after transplantation,at the same time the expression of CD34,CD105 and ZO-1 were detected with immunohistochemistry staining.ResultsThe mRNA expression of Osteonectin,Osteopotin,Col-1 and VEGF were gradually increased when detected at 3rd,7th and 14th day with real-time PCR,and the co-culture cells group increased most obviously in the three groups in vitro at the same period time(P<0.01)；The microvascularization of the engineering biological bone were observed in vivo with immunohistochemistry，and neovascularization of co-culture cells group was also the most obvious group in three groups,immunohistochemical showed that CD34,CD105 and ZO-1 was also higher than the other two groups(P<0.01).ConclusionAutologous EPCs interact with BMSCs could promote vascularization of tissue engineering bone both in vivo and in vitro.

[Key words]stem cells;endothelium,vascular;bone marrow mesenchymal stem cells;neovascularization, physiologic;tissue engineered bone

doi:論著·基礎(chǔ)研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.02.005

基金項目：國家自然科學(xué)基金資助項目(81460298)；云南省科技廳-昆明醫(yī)科大學(xué)應(yīng)用基礎(chǔ)研究聯(lián)合專項(2015 FB 038)。

作者簡介：吳莉(1976-)，主治醫(yī)師，在讀博士，主要從事組織工程與分子影像學(xué)方面研究。 △通訊作者：E-mail:liuliu3939@126.com。

[中圖分類號]R318.08

[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A

[文章編號]1671-8348(2016)02-0159-05

(收稿日期：2015-09-10修回日期：2015-10-10)