張亞萍，陳　勇，王文英，韓　黎，韓雪玲，劉彥君，曹延霞

(1 中國(guó)人民解放軍第三醫(yī)院，陜西 寶雞　721004； 2 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院疾病預(yù)防控制所，北京　100071)

·論著·

臨床分離大腸埃希菌耐消毒劑基因攜帶情況及5種消毒劑最低抑菌濃度

張亞萍1，陳勇2，王文英1，韓黎2，韓雪玲1，劉彥君1，曹延霞1

(1 中國(guó)人民解放軍第三醫(yī)院，陜西 寶雞721004； 2 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院疾病預(yù)防控制所，北京100071)

[摘要]目的了解臨床標(biāo)本分離的大腸埃希菌(E.coli)對(duì)常用消毒劑耐藥性及其消毒劑耐藥基因攜帶狀況。方法采用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)對(duì)82株E.coli 耐消毒劑基因sugE(c)、sugE(p)、qacEΔ1和qacE進(jìn)行檢測(cè)，瓊脂稀釋法進(jìn)行最低抑菌濃度(MIC)測(cè)定。結(jié)果臨床分離的82株E.coli中，sugE(c)、sugE(p)、qacEΔ1、qacE、sugE(c)+qacEΔ1、qacE+qacEΔ1+sugE(c)陽(yáng)性率分別為84.15%(69株)、1.22%(1株)、76.83%(63株)、73.17 %(60株)、68.29%(56株)、59.76%(49株)。產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)與非產(chǎn)ESBLs菌株，頭孢吡肟敏感株與耐藥株4種耐消毒劑基因攜帶情況比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。苯扎氯銨、西吡氯銨、溴化銨及三氯生4種消毒劑對(duì)82株E.coli的MIC值均>標(biāo)準(zhǔn)菌株；氯己定對(duì)32株E.coli的MIC值>標(biāo)準(zhǔn)菌株，對(duì)另外50株E.coli的MIC值≤標(biāo)準(zhǔn)菌株。苯扎氯銨、西吡氯銨、溴化銨及三氯生對(duì)產(chǎn)ESBLs和非產(chǎn)ESBLs組、頭孢吡肟敏感和耐藥組的MIC值結(jié)果比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)；而氯己定MIC值比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。結(jié)論臨床送檢標(biāo)本分離的E.coli耐消毒劑基因qacE、qacEΔ1和sugE(c)檢出率高，苯扎氯銨等消毒劑對(duì)E.coli的MIC普遍較標(biāo)準(zhǔn)菌株明顯升高。

[關(guān)鍵詞]大腸埃希菌； 耐消毒劑； 基因； 最低抑菌濃度

[Chin J Infect Control，2016，15(5)：289-293]

大腸埃希菌(Escherichiacoli,E.coli)屬于腸桿菌科細(xì)菌，為腸道正常菌群的組成部分，是一種條件致病菌，因定植部位不同而引起的感染通常分為腸道內(nèi)感染和腸道外感染。各大診療中心消毒滅菌是減少醫(yī)院感染的重要手段，加強(qiáng)消毒滅菌管理是控制醫(yī)院感染發(fā)生的重要環(huán)節(jié)[1]。近年來(lái)，隨著消毒劑的廣泛應(yīng)用，尤其是其不規(guī)范、不合理地使用，使細(xì)菌長(zhǎng)期暴露于消毒劑環(huán)境中，逐漸產(chǎn)生染色體或質(zhì)粒的變異，文獻(xiàn)[2]證實(shí)，獲得遺傳物質(zhì)編碼的耐藥性可穩(wěn)定遺傳，從而引發(fā)醫(yī)院感染及嚴(yán)重的耐藥問(wèn)題。文獻(xiàn)[3]報(bào)道，從E.coli中檢出耐消毒劑基因sugE(c)、sugE(p)、qacE△1及qacE，說(shuō)明開(kāi)展E.coli消毒劑耐藥基因篩查，對(duì)控制消毒劑耐藥性與基因傳播至關(guān)重要，能為消毒劑的規(guī)范使用提供理論依據(jù)，使臨床工作得到更好保障。

E.coli是臨床分離的革蘭陰性(G-)桿菌中最常見(jiàn)的菌種之一，在醫(yī)院感染監(jiān)測(cè)中，其分離率較高，且多數(shù)是耐藥株，并呈多重耐藥[4-5]。其中產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(extended-spectrum β-lactamases, ESBLs)菌株分離率也不斷上升，使臨床治療面臨嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。為了解E.coli對(duì)常用消毒劑的耐藥情況，本研究分析某院臨床送檢標(biāo)本分離的E.coli對(duì)常用消毒劑(苯扎氯銨、西吡氯銨、溴化銨、三氯生及氯己定)的耐藥譜，并對(duì)其耐消毒劑基因sugE(c)、sugE(p)、qacE△1及qacE進(jìn)行檢測(cè)?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1資料與方法

1.1菌株來(lái)源

隨機(jī)選取某院2013年7—12月臨床送檢標(biāo)本(包括血、尿、痰及分泌物等)分離的82株E.coli，無(wú)同一患者同一部位分離的重復(fù)菌株。其中，產(chǎn)ESBLs 57株，非產(chǎn)ESBLs 25株，頭孢吡肟耐藥21株，所有試驗(yàn)菌株均經(jīng)VITEK-AMS鑒定，并參照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI)2010年版進(jìn)行確認(rèn)。E.coliATCC 25923為質(zhì)控菌株。

1.2儀器和試劑

Mastercyler PCR擴(kuò)增儀(Sigma 公司)，紫外凝膠電泳成像儀，0.5麥?zhǔn)蠁挝槐葷峁?法國(guó)生物梅里埃有限公司)，Taq DNA聚合酶、PCR相關(guān)試劑及DNA Marker(TAKARA)，瓊脂糖凝膠、溴乙錠(EB，美國(guó)Promega公司)，藥敏試驗(yàn)用消毒劑包括苯扎氯銨、氯己定、西吡氯銨、溴化銨、三氯生(TCL，美國(guó)Sigma公司)。試驗(yàn)用消毒劑三氯生溶解于丙二醇，其余均用蒸餾水溶解，并稀釋、配制成所需濃度。

1.3引物設(shè)計(jì)與合成

參考文獻(xiàn)[3]，設(shè)計(jì)合成sugE(c)、sugE(p)、qacEΔ1共3對(duì)引物；根據(jù)GenBank中發(fā)布的基因序列設(shè)計(jì)qacE引物，所有引物由北京華大基因公司合成。見(jiàn)表1。

表1　消毒劑耐藥基因PCR引物序列和目的產(chǎn)物長(zhǎng)度

1.4細(xì)菌DNA模板制備

1.4.1菌株活化將于-80℃冰箱中凍存的82株E.coli接種于LB肉湯液體培養(yǎng)基，置37℃搖床中震蕩(180 r/min)培養(yǎng)過(guò)夜，次日用接種環(huán)蘸取少許菌液再次接種于LB瓊脂培養(yǎng)基，恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)37℃培養(yǎng)過(guò)夜。

1.4.2DNA提取從LB瓊脂培養(yǎng)皿上挑取3～5個(gè)菌落，用接種環(huán)研磨溶解于盛有300 μL滅菌ddH2O的1.5 mL EP管中，充分振蕩混勻；再將裝有菌液的EP管煮沸10 min；然后15 000 r/min 離心1 min，上清即為DNA提取液；最后將DNA提取液分裝數(shù)管并置于-20℃保存、備用。

1.5耐消毒劑基因檢測(cè)

1.5.1PCR反應(yīng)體系10×Buffer 5 μL、dNTPs 4 μL、上下游引物各2 μL、Taq DNA聚合酶0.25 μL、無(wú)菌去離子水36 μL、DNA模板1 μL。

1.5.2qacE基因PCR反應(yīng)條件94℃預(yù)變性5 min，然后進(jìn)入循環(huán)94℃變性30 s、55℃退火30 s和72℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)，最后72℃終延伸4 min。sugE(c)、sugE(p)、qacEΔ1基因的PCR熱循環(huán)參數(shù)見(jiàn)文獻(xiàn)[3]。

1.5.3瓊脂糖凝膠電泳PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠電泳成像儀下觀察并拍照，出現(xiàn)與陽(yáng)性對(duì)照分子相當(dāng)?shù)哪康臈l帶判為陽(yáng)性。陽(yáng)性對(duì)照DNA經(jīng)測(cè)序證實(shí)，陰性對(duì)照為純水。

1.6最低抑菌濃度(MIC)測(cè)定

將已倍比稀釋為14個(gè)不同梯度的5種消毒劑溶液分別加入滅菌MH培養(yǎng)基(每個(gè)培養(yǎng)皿含2 mL消毒劑+18 mL培養(yǎng)基)中，混勻配制成濃度為1 024、512、256、128、……、0.125 mg/L含消毒劑的MH培養(yǎng)基，凝固后備用。挑取LB平板上待測(cè)菌株的少量菌落在試管壁上研磨，配制0.5麥?zhǔn)蠁挝粷岫鹊木鷳乙?，再用滅菌雙蒸水1∶10稀釋到1.5 mL EP管中，最后滴種于含不同濃度消毒劑的MH培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)20～24 h，觀察并記錄結(jié)果。以無(wú)菌生長(zhǎng)的最低濃度為MIC，試驗(yàn)至少重復(fù)3次。質(zhì)控菌株ATCC 25923的MIC測(cè)定方法同上。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 21.0進(jìn)行分析，采用Fisher精確概率法或非參數(shù)檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)比較，P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1標(biāo)本來(lái)源

82株臨床分離的非重復(fù)E.coli標(biāo)本來(lái)源為尿(29株，35.36%)、痰(20株，24.39%)、傷口分泌物(12株，14.63%)、膿液(7株，8.54%)、膽汁(6株，7.32%)、血(5株，6.10%)及腦脊液(3株，3.66%)。

2.2耐消毒劑基因檢測(cè)結(jié)果

82株E.coli耐消毒劑基因檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2，其中檢測(cè)出sugE(c)+qacEΔ1基因56株，占68.29%，qacE+qacEΔ1+sugE(c)共49株，占59.76%。

表2　82株E.coli 耐消毒劑基因檢測(cè)結(jié)果

2.3不同E.coli耐消毒劑基因檢測(cè)結(jié)果

分別比較產(chǎn)ESBLs和非產(chǎn)ESBLs菌、頭孢吡肟敏感株和耐藥株4種耐消毒劑基因攜帶情況，結(jié)果顯示差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。見(jiàn)表3。

表3　不同E.coli耐消毒劑基因檢出情況(株，%)

注：采用Fisher精確概率法

2.4消毒劑MIC值測(cè)定結(jié)果

82株E.coli三氯生MIC值為0.25～4 mg/L，溴化銨MIC值為64～512 mg/L，西吡氯銨MIC值為32～512 mg/L,苯扎氯銨MIC值為8～512 mg/L，氯己定MIC值為0.25～8 mg/L。三氯生、溴化銨、西吡氯銨、苯扎氯銨及氯己定對(duì)ATCC 25923質(zhì)控菌株的MIC值分別為<0.125、4、2、1、0.5 mg/L。其中三氯生MIC值為0.5 mg/L的E.coli40株(48.78%)，溴化銨MIC值為256 mg/L的E.coli53株(64.63%)，西吡氯銨MIC值為64 mg/L的E.coli41株(50.00%)，苯扎氯銨MIC值為16 mg/L的E.coli70株(85.37%)。氯己定對(duì)E.coli的測(cè)試結(jié)果顯示，敏感菌(MIC<0.5 mg/L)1株、耐藥菌(MIC>0.5 mg/L)32株，與標(biāo)準(zhǔn)菌MIC值(0.5 mg/L)相等的E.coli49株(59.76%)。產(chǎn)ESBLs組和非產(chǎn)ESBLs組、頭孢吡肟敏感和耐藥組E.coli苯扎氯銨、西吡氯銨、溴化銨及三氯生的MIC值結(jié)果比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)；而氯己定的MIC值比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，見(jiàn)表4。5種消毒劑的MIC值，各組陽(yáng)性菌與陰性菌比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。見(jiàn)表5。

表4　不同 E.coli 5種消毒劑的MIC值幾何均數(shù)比較(mg/L)

表5　5種消毒劑對(duì)各組E.coli的MIC值幾何均數(shù)比較(mg/L)

3討論

目前，消毒劑耐藥基因qac家族已報(bào)道的亞型有qacA、qacB、qacC、qacD、qacE、qacEΔ1、qacF、qacG、qacH、qacJ，其中，qacEΔ1是qacE基因的突變?nèi)笔?，二者共同存在于G-菌質(zhì)粒上1型整合子3’端[6]。上述基因的表達(dá)產(chǎn)物可外排多種化合物，包括季胺鹽類(苯扎溴銨、苯扎氯銨)、雙胍類(氯己定)、堿性染料(孔雀石綠)等。qacE、qacEΔ1、sugE(p)及sugE(c)基因?qū)儆诩?xì)菌的小多重耐藥家族(small mutidrug resistance family，SMR)外排系統(tǒng)，其中的qacE、qacEΔ1和sugE(p)由質(zhì)粒編碼，而sugE(c)由染色體編碼。本研究示，E.coli攜帶的耐消毒劑基因以sugE(c)(84.15 %)和qacEΔ1(76.83%)為主，攜帶qacE+qacEΔ+sugE(c)的共49株(59.76%)。產(chǎn)ESBLsE.coli在世界范圍內(nèi)已有大量報(bào)道[7]，攜帶β-內(nèi)酰胺酶的細(xì)菌質(zhì)粒主要通過(guò)轉(zhuǎn)導(dǎo)、接合、轉(zhuǎn)化等方式在不同菌株間傳播耐藥信息。本實(shí)驗(yàn)中產(chǎn)ESBLs和非產(chǎn)ESBLs組E.coli攜帶耐消毒劑基因情況無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，與寇新明等[8]報(bào)道相符。從頭孢吡肟敏感組和耐藥組中檢測(cè)出的耐消毒劑基因結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，抗菌藥物耐藥性與消毒劑耐藥基因之間無(wú)關(guān)聯(lián)。

消毒劑是醫(yī)院中應(yīng)用范圍廣、頻率高及用量大的化合物，其中，季銨鹽類(quaternary ammonium compounds，QACs)作為一種低效消毒劑，屬于陽(yáng)離子表面活性劑，可通過(guò)正電荷與細(xì)胞表面的負(fù)電荷相互作用，由N-烷基發(fā)揮抗菌活性，而抗菌活性主要依靠破壞和變性蛋白及酶、破壞細(xì)胞膜整體性使細(xì)胞內(nèi)含物泄漏等實(shí)現(xiàn)[9]。QACs通常用于醫(yī)院病房和醫(yī)療設(shè)備的消毒、傷口清理、術(shù)前皮膚黏膜準(zhǔn)備及手消毒等方面。近年來(lái)，各醫(yī)療機(jī)構(gòu)陸續(xù)報(bào)道有些菌株對(duì)消毒劑產(chǎn)生了抗性，除季銨鹽類外，還于醇類、雙胍類、酚類等檢測(cè)到抗性。消毒劑抗性是指對(duì)常用濃度的消毒劑不再敏感，也包括那些在能殺滅或抑制大部分該種細(xì)菌的消毒劑濃度下，不能殺滅或抑制菌株[10]。由于國(guó)內(nèi)外尚未出臺(tái)細(xì)菌耐消毒劑藥敏試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)化方案，目前研究最常采用測(cè)定某消毒劑對(duì)試驗(yàn)菌的MIC值，并將測(cè)定結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)菌株比較來(lái)判讀受試菌有無(wú)抗性。

本研究顯示，受試的5種消毒劑中，苯扎氯銨、西吡氯銨、溴化銨及三氯生對(duì)82株E.coli的MIC值均大于標(biāo)準(zhǔn)菌，而氯己定對(duì)E.coli的MIC值與標(biāo)準(zhǔn)菌MIC值(0.5 mg/L)相等的49株。產(chǎn)ESBLs組和非產(chǎn)ESBLs組E.coli苯扎氯銨、西吡氯銨、溴化銨及三氯生的MIC值比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，而氯己定的MIC值比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，可見(jiàn)，季銨鹽類(包括苯扎氯銨、西吡氯銨、溴化銨)對(duì)該院臨床送檢標(biāo)本分離的E.coliMIC值明顯大于標(biāo)準(zhǔn)株，表明QACs的使用不能一味依靠增加用量達(dá)到消毒滅菌的目的，由此產(chǎn)生的耐藥問(wèn)題應(yīng)引起足夠重視。超過(guò)50%的菌株對(duì)氯己定的MIC值與標(biāo)準(zhǔn)菌相同，少數(shù)菌株產(chǎn)生了耐藥，表明雙胍類消毒劑對(duì)E.coli的敏感性尚好，但也要把握其濃度、用量及使用范圍。也有文獻(xiàn)[11]報(bào)道，含氯消毒劑需要每天現(xiàn)配現(xiàn)用，否則消毒作用會(huì)減弱?？傊R床各科室應(yīng)及時(shí)根據(jù)標(biāo)本的藥物敏感性試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果更換消毒劑種類，交替使用兩種不同類別的消毒劑，暫?；驕p少耐藥消毒劑的使用，延緩耐藥菌的進(jìn)一步發(fā)展。

5種消毒劑的MIC值，各組陽(yáng)性菌與陰性菌比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，二者之間是否存在相關(guān)性仍需更多的臨床試驗(yàn)研究證實(shí)。隨著現(xiàn)代醫(yī)療技術(shù)突發(fā)展，QACs和抗菌藥物被廣泛使用，而此時(shí)面臨的最大安全隱患是QACs消毒劑的暴露使用，發(fā)揮著篩選壓力的作用，并可以產(chǎn)生共耐藥的基因，可能導(dǎo)致耐消毒劑及耐藥菌株的選擇性生長(zhǎng)[12]。比較該院分離的對(duì)頭孢吡肟敏感與耐藥的E.coli的氯己定MIC值，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示耐藥E.coli同時(shí)與消毒劑抗性之間存在某種關(guān)聯(lián)。E.coli同時(shí)表現(xiàn)對(duì)QACs、抗菌藥物的耐藥，不僅增加了病原菌對(duì)藥物的選擇壓力，而且使臨床治療面臨嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。

截至目前，文獻(xiàn)報(bào)道的消毒劑耐藥與抗菌藥物耐藥相互關(guān)系的研究結(jié)果不全一致，但已有研究證實(shí)耐藥菌對(duì)消毒劑敏感性降低，而對(duì)消毒劑耐藥的耐藥菌也會(huì)影響抗菌藥物的敏感性[13]。綜上所述，醫(yī)務(wù)工作者應(yīng)依據(jù)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)和規(guī)范合理選擇消毒劑，嚴(yán)格控制消毒劑稀釋產(chǎn)物的濃度，掌握好消毒劑的接觸時(shí)間并結(jié)合藥敏結(jié)果合理選擇抗菌藥物等，對(duì)防止耐藥菌產(chǎn)生，減少醫(yī)院感染的發(fā)生，提高臨床治愈率有重大意義。而消毒劑耐藥機(jī)制與抗菌藥物耐藥是否相關(guān)值得深入研究，進(jìn)而為醫(yī)院感染的預(yù)防控制提供科學(xué)的理論依據(jù)。

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(本文編輯：李春輝)

Carriage of disinfectant resistance genes in clinically isolatedEscherichiacoliand minimal inhibitory concentration of five disinfectants

ZHANGYa-ping1，CHENYong2，WANGWen-ying1，HANLi2，HANXue-ling1，LIUYan-jun1，CAOYan-xia1(1TheThirdHospitalofPLA，Baoji721004，China；2InstituteforDiseaseControlandPrevention，AcademyofMilitaryMedicalSciences，Beijing100071，China)

[Abstract]ObjectiveTo understand the disinfectant resistance of clinically isolated Escherichia coli (E. coli) and carriage of disinfectant resistance genes. MethodsDisinfectant resistance gene sugE(c), sugE(p), qacEΔ1,and qacE of 82 isolates of E. coli were detected with polymerase chain reaction (PCR), minimal inhibitory concentrations (MICs) were measured with agar dilution methods. ResultsAmong 82 E. coli isolates, positive rates of disinfectant resistance gene sugE(c), sugE(p), qacEΔ1, qacE, sugE(c) +qacEΔ1, and qacE+qacEΔ1+sugE(c) were 84.15% (n=69), 1.22% (n=1), 76.83% (n=63), 73.17 % (n=60), 68.29% (n=56), and 59.76% (n=49) respectively. There was no significant differences in carriage status of four disinfectant resistance genes between extended-spectrum β-lactamases (ESBLs) - producing and non-ESBLs-producing strains, as well as cefepime sensitive and resistant strains (all P>0.05); MIC values of benzalkonium chloride, cetylpyridinium chloride, ammonium bromide, and triclosan for 82 isolates of E.coli were all > standard stain; MIC values of chlorhexidine for 32 isolates of E.coli were all > standard stain,for 50 other E.coli strains were all ≤ standard strain. There were no significant difference in MIC values of benzalkonium chloride, cetylpyridinium chloride, ammonium bromide, and triclosan between ESBLs-and non-ESBLs-producing strains, as well as cefepime sensitive and resistant strains(all P>0.05); while MIC values of chlorhexidine showed a significant difference (both P<0.05). ConclusionDetection rates of disinfectant resistance gene qacE,qacEΔ1， and sugE(c) in E. coli from clinical specimens are high, MICs of disinfectants such as benzalkonium chloride for E.coli are generally higher than standard strain.

[Key words]Escherichia coli; disinfectant resistance; gene; minimal inhibitory concentration

[收稿日期]2015-12-15

[基金項(xiàng)目]國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81102168)；蘭州戰(zhàn)區(qū)引起血流感染的多重耐藥菌分子流行病學(xué)研究課題(CLZ13JA08)

[作者簡(jiǎn)介]張亞萍(1972-)，女(漢族)，陜西省寶雞市人，副主任醫(yī)師，主要從事臨床醫(yī)學(xué)與醫(yī)院感染預(yù)防控制研究。 [通信作者]韓黎E-mail:hanlicdc@163.com

DOI:10.3969/j.issn.1671-9638.2016.05.001

[中圖分類號(hào)]R378

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1671-9638(2016)05-0289-05