蔡林奕　孔祥麗　謝靜口腔疾病研究國家重點實驗室 華西口腔醫(yī)院（四川大學），成都 610041

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體外持續(xù)傳代引起小鼠透明軟骨細胞表型和細胞外基質平衡變化的研究

蔡林奕孔祥麗謝靜
口腔疾病研究國家重點實驗室 華西口腔醫(yī)院（四川大學），成都 610041

[摘要]目的研究體外持續(xù)傳代對透明軟骨細胞形態(tài)表型、分化特性及細胞外基質（ECM）平衡狀態(tài)的影響。方法酶消化法分離培養(yǎng)小鼠透明軟骨細胞，連續(xù)傳代至第5代。采用蘇木精-伊紅染色觀察軟骨細胞的形態(tài)改變，采用半定量聚合酶鏈式反應分析軟骨細胞特異性基因、常規(guī)基因、基質金屬蛋白酶家族（MMPs）和基質金屬蛋白酶組織抑制劑家族（TIMPs）mRNA水平的變化，采用明膠酶譜分析鑒定軟骨細胞明膠酶活性的改變。結果隨著傳代次數(shù)增加，軟骨細胞形態(tài)由圓形或多邊形變?yōu)殚L梭形，其特異性基因的表達量明顯下降（P<0.05），至第5代已基本喪失。相比而言，常規(guī)基因的下調并不明顯。MMPs和TIMPs均有下調（P<0.05），僅MMP-1和TIMP-1改變的差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；MMPs/TIMPs比值隨傳代發(fā)生紊亂。在蛋白質水平，隨傳代次數(shù)增加，明膠酶的活性下降，P4和P5代細胞下調顯著（P<0.05）。結論軟骨細胞在體外培養(yǎng)過程中，其特異性表型特征會隨傳代次數(shù)增加而逐漸喪失，軟骨細胞發(fā)生反分化而表現(xiàn)出纖維化趨勢。同時，ECM的平衡狀態(tài)被打破，合成與分解代謝紊亂。在利用軟骨細胞進行相關疾病的研究或軟骨組織工程學實驗時，應選用前3代的軟骨細胞。

[關鍵詞]體外傳代； 透明軟骨細胞； 細胞表型； 細胞外基質； 組織工程

Supported by: Funding of State Key Laboratory of Oral Diseases (Sichuan University) (SKLOD201527);The Youth Start-up Fund of Sichuan University (2015SCU11013);The National Undergraduate Training Programs for Innovation and Entrepreneurship ofSichuan University (201610610374).Correspondence: Xie Jing, E-mail: Xiejing2012@scu.edu.cn.

關節(jié)軟骨的修復是骨科臨床治療的難題。生理情況下，成熟軟骨細胞處于相對靜止的狀態(tài)，增殖與合成軟骨特異性細胞外基質（extracellular matrix，

ECM）的能力極其有限，故較小的創(chuàng)傷就會造成嚴重的軟骨損傷和變性，導致關節(jié)功能障礙[1]。

組織工程為修復損傷和疾病組織提供新的治療方案，但在軟骨再生方面，組織工程的應用還存在較大的局限性[2]。例如，軟骨下骨的微創(chuàng)手術常并發(fā)關節(jié)軟骨的纖維性修復[3]；自體軟骨細胞移植會在新生關節(jié)軟骨中出現(xiàn)一定比例的纖維軟骨，且纖維化程度隨時間增加而增加[4]。軟骨細胞在體外培養(yǎng)過程中會發(fā)生反分化，表現(xiàn)出成纖維細胞的形態(tài)和特征，繼而導致軟骨纖維化，限制了軟骨組織工程的廣泛應用。由此可見，軟骨細胞在組織工程領域的應用價值取決于其表型和分化特性，有必要探索體外連續(xù)傳代培養(yǎng)對軟骨細胞表型的影響。

關節(jié)軟骨的病變常伴隨軟骨ECM穩(wěn)態(tài)的失衡。軟骨基質主要由Ⅱ型膠原和蛋白多糖構成。細胞外基質的合成、分泌和降解受軟骨細胞調控，ECM的穩(wěn)態(tài)也是軟骨細胞發(fā)揮生理功能的關鍵?；|金屬蛋白酶家族（metalloproteinases，MMPs）和MMPs組織抑制劑家族（tissue inhibitors of MMPs，TIMPs）是參與軟骨ECM代謝的重要酶類。在軟骨組織中，MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-9、MMP-10、MMP-13和MMP-14是參與軟骨內骨化的主要MMPs成員[5]。TIMPs是MMPs的生理性抑制劑[6]。正常情況下MMPs和TIMPs的表達量保持相對穩(wěn)定，共同調控ECM的代謝平衡；在各種損傷因子的作用下，MMPs 和TIMPs的比例改變，造成軟骨結構和功能異常。

本實驗通過研究透明軟骨細胞在體外傳代擴增過程中形態(tài)的改變，特異性基因和常規(guī)基因的mRNA水平的變化以及MMPs和TIMPs基因/蛋白水平的改變，揭示連續(xù)傳代對軟骨細胞表型和ECM平衡的影響，為建立性狀穩(wěn)定的軟骨細胞庫提供理論基礎。

1　材料和方法

1.1主要儀器和試劑

蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色試劑盒、BCA試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司），

RNA抽提試劑盒（Qiagen公司，美國），cDNA合成試劑盒、聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction， PCR）試劑盒、DNAseⅠ（Mbi公司，美國）。IX70型倒置顯微鏡（Olympus公司，日本），光密度計、PCR儀（Bio-Rad公司，美國），Bio-Tek ELx800酶標儀（Bio-Tek公司，美國）。

1.2實驗動物

本實驗所需動物的獲得符合倫理原則，且處理流程經(jīng)過倫理委員會的審查和批準。

1.3細胞培養(yǎng)

本研究在Gosset等[7]報道過的兩種分離培養(yǎng)原代軟骨細胞的方法上進行了改進，從1 d齡小鼠的膝關節(jié)分離透明軟骨細胞（此時的膝關節(jié)軟骨未發(fā)生鈣化，均為透明軟骨）。處死小鼠后滅菌并剝去膝關節(jié)上皮，用眼科剪收集后肢膝關節(jié)（圖1）。將膝關節(jié)剪碎，再用0.25%的胰酶消化30 min。隨后移除上清液，用0.5%的Ⅱ型膠原酶消化3 h。在處理后的軟骨細胞懸浮液中加入等體積含10%胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、1%青霉素-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基。將混合溶液1 000 r·min-1離心5 min后，去除上清液，在離心管中加入含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，使軟骨細胞再次懸浮。將懸浮的軟骨細胞接種到培養(yǎng)瓶中，放入5%CO2、37 ℃孵箱中培養(yǎng)。將分離的軟骨細胞標記為原代（P0代），待細胞長滿匯合后開始傳代，傳代第1次稱為P1代，本實驗共傳代5次。

圖1　分離新生小鼠的關節(jié)軟骨細胞Fig 1　Separation of articular chondrocytes from neonatal mice

1.4檢測方法

1.4.1HE染色使用HE染色試劑盒進行染色。軟骨細胞貼壁后用4%多聚甲醛溶液固定1 h，隨后清洗，按照試劑盒說明書操作，干燥后中性樹脂封片，倒置顯微鏡采集圖像。

1.4.2半定量PCR 將軟骨細胞接種于六孔板，棄去含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，用含2%FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h，再換成含1%FBS的DMEM培養(yǎng)基，即刻開始計時，12 h后開始提取軟骨細胞RNA。RNA純化并定量后，使用cDNA合成試劑盒得到cDNA。使用PCR試劑盒在PCR儀上進行半定量PCR，以磷酸甘油醛脫氫酶（phosphoglyceraldehyde dehydroge nase，GAPDH）和β-actin為內參，檢測軟骨細胞特異性基因蛋白聚糖、骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2（bone morphogenetic protein-2，BMP-2）和Ⅱ型膠原，同時檢測軟骨細胞常規(guī)基因纖連蛋白1和Ⅰ、Ⅲ型膠原，以及MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3、TIMP-4 mRNA的表達。各基因的引物序列見表1。

表1　半定量PCR的引物序列Tab 1　Primers sequences for semi-quantitative PCR

經(jīng)半定量PCR擴增得到的產(chǎn)物在Tris硼酸-乙二胺四乙酸緩沖液中電泳，使用溴化乙錠染色并顯色，采用Quantity One 4.6.3軟件分析光密度（optical density，OD）值。

1.4.3明膠酶譜實驗0.05%明膠酶譜用于檢測培養(yǎng)基中軟骨細胞分泌的MMP-2和MMP-9的活性。酶譜實驗所檢測的軟骨細胞為P0～P5代，所選時間點為12、24、48、72 h和1周。

通過BCA試劑盒測出蛋白質的濃度，加入相同質量的蛋白樣品，并混入等量蛋白分離緩沖液，在10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）中分離，凝膠中聚合有0.05%明膠。電泳結束后，在2.5%Triton X-100中清洗凝膠3次，每次0.5 h。清洗后的凝膠在蛋白水解緩沖液中室溫孵育12～16 h，隨后在2.5%Triton X-100溶液中漂洗，在考馬斯亮藍染液中震蕩染色1 h。當考馬斯亮藍的藍色背景中出現(xiàn)清晰的白色條帶時即開始對凝膠脫色。光密度計掃描條帶，Quantity One 4.6.3軟件定量分析。

1.5統(tǒng)計學方法

采用SPSS 19.0進行統(tǒng)計學分析，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法，檢驗水準為雙側α=0.05。

2　結果

2.1隨著傳代次數(shù)的增加，軟骨細胞的形態(tài)發(fā)生反分化

關節(jié)軟骨細胞的HE染色結果見圖2。由圖2可見，P0—P3代軟骨細胞形態(tài)多為圓形或多邊形，而P4和P5代軟骨細胞發(fā)生反分化，其形態(tài)表現(xiàn)為成纖維樣的長梭形。

2.2隨著傳代次數(shù)增加，軟骨細胞特異性基因的表達量下調，而常規(guī)基因的變化并不顯著

半定量PCR表明，軟骨細胞特異性基因Ⅱ型膠原和蛋白聚糖在P0代細胞高表達，其表達量隨傳代次數(shù)增加而下降（圖3上）。P1、P2、P3、P4、P5代細胞Ⅱ型膠原的mRNA表達量分別為P0代細胞的87%、90%、67%、20%和3%，蛋白聚糖表達量分別是P0代細胞的60%、30%、23%、18%和10%； BMP-2也隨著傳代次數(shù)增加表現(xiàn)出一定的下調趨勢（圖3下）。軟骨細胞內常規(guī)基因Ⅰ型和Ⅲ型膠原的表達量在軟骨細胞傳代過程中表現(xiàn)出一定的下調（圖4），但其下調程度不如Ⅱ型膠原顯著，纖連蛋白1在傳代過程中的表達量并無明顯變化。

圖2　關節(jié)軟骨細胞形態(tài)變化　　HEFig 2　Morphological change of the articular chondrocytes　HE

圖3　軟骨細胞特異性基因表達量的變化Fig 3　Expressions of specific marker genes in chondrocytes

2.3隨傳代次數(shù)增加，MMPs和TIMPs基因的表達量下降，MMPs與TIMPs比值失衡

MMPs和TIMPs的半定量PCR結果見圖5、6。隨傳代次數(shù)的增加，MMPs表達量下降，其中MMP-2、MMP-3和MMP-9有明顯下調（P<0.05）；TIMPs表達量也有類似改變，以TIMP-2、TIMP-3和TIMP-4的變化較為顯著（P<0.05）。MMP-1/TIMP-4、MMP-3/TIMP-4隨傳代次數(shù)增加而明顯增加，而MMP-2/ TIMP-2、MMP-9/TIMP-1、MMP-3/TIMP-1則在傳代中明顯下調，說明P2代開始發(fā)生ECM穩(wěn)態(tài)的紊亂。與P0代相比，P5代細胞MMP-1/TIMP-4、MMP-3/ TIMP-4分別增加了（9.03±0.20）和（3.15±0.19）倍，MMP-2/TIMP-2、MMP-9/TIMP-1、MMP-3/TIMP-1分別下降為P0代的8.70%、14.95%和69.93%。

圖4　軟骨細胞內常規(guī)基因表達量的變化Fig 4　Expressions of routine genes in chondrocytes

2.4明膠酶的活性隨傳代次數(shù)增加而下降，P4和P5代細胞蛋白活性的增加無明顯時間依賴性

明膠酶譜實驗結果表明，P0—P3代細胞MMP-2 和MMP-9活性的增強有明顯時間依賴性，而P4、P5代細胞MMP-2和MMP-9活性隨時間延長變化不明顯（圖7）。隨傳代次數(shù)增加，MMP-2和MMP-9的活性下降（圖7、圖8上）。當所選培養(yǎng)時間點為1周時，P4和P5代細胞MMP-2和MMP-9的活性明顯下調（圖8上），與P0代細胞相比，P4和P5代細胞MMP-2活性分別下降為P0代的19.34%和12.00%（圖8下）。

圖5　軟骨細胞中MMPs、TIMPs基因的電泳結果Fig　5　　The gene expressions of MMPs and TIMPs after continuous passaging in each generation of chondrocytes

圖6　體外連續(xù)傳代對軟骨細胞中MMPs、TIMPs基因表達量及二者間比值的影響Fig　6 The influences of in vitro continuous passaging on the gene expressions of MMPs and TIMPs, and the gene ratios of MMPs/TIMPs in chondrocytes

圖7　軟骨細胞連續(xù)傳代后MMP-2和MMP-9活性隨時間的變化Fig 7　Activities of MMP-2 and MMP-9 are time-dependent in chon- drocytes after continuous passaging

圖8　所選時間點為1周時，軟骨細胞中MMP-2和MMP-9的活性Fig 8　Activities of MMP-2 and MMP-9 in each generation of chon- drocytes after 1 week culture

3　討論

本研究通過分析連續(xù)傳代時透明軟骨細胞形態(tài)的改變、特異性基因和常規(guī)基因的表達變化，以及細胞外基質平衡的改變，試圖為軟骨損傷相關疾病和軟骨組織工程的研究奠定理論基礎。本研究結果顯示：1）透明軟骨細胞會隨傳代發(fā)生反分化，細胞形態(tài)表現(xiàn)出成纖維細胞的形態(tài)特征；2）在基因水平，隨著傳代次數(shù)增加，軟骨細胞特異性基因的表達量顯著下調，而常規(guī)基因的表達量未有明顯變化；3）透明軟骨細胞在傳代過程中，MMPs和TIMPs mRNA的表達量均下降，MMP-2和MMP-9在蛋白水平也有一致的表現(xiàn)，ECM的穩(wěn)態(tài)失衡。故在利用軟骨細胞進行相關疾病的研究或軟骨組織工程學實驗時，應選用前3代的軟骨細胞。

軟骨組織是高度特異性的組織，主要由軟骨細胞和軟骨基質構成。軟骨細胞是軟骨組織中唯一的一種細胞。軟骨基質約占軟骨總重量的90%，而軟骨細胞只占軟骨組織的很小一部分。致密的軟骨基質是軟骨發(fā)揮負重，緩沖壓力，吸收震動，減小摩擦等生理功能的結構基礎。與大多數(shù)組織不同，軟骨組織內無血管、淋巴管和神經(jīng)，營養(yǎng)物質經(jīng)軟骨基質滲透進入軟骨細胞。這種組織學結構使軟骨細胞在損傷因子的作用下，無法有效啟動機體固有的防御性修復應答。故軟骨一旦損傷，很難自發(fā)修復，甚至會導致進一步的軟骨磨損，進而引發(fā)骨關節(jié)炎[7]。軟骨ECM的有機成分主要為膠原和蛋白多糖。關節(jié)軟骨中的膠原主要包括Ⅱ、Ⅸ、Ⅺ型膠原，其中Ⅱ型膠原占軟骨膠原總量的80%～85%[8]。Ⅱ型膠原的高表達是軟骨細胞的特征性表型，也是軟骨具有一定抗拉強度和承重能力的分子學基礎。另外，在結締組織中高表達的Ⅰ、Ⅲ型膠原在軟骨組織中的表達量極低。普遍的觀點認為，正常關節(jié)軟骨細胞不合成Ⅰ、Ⅲ型膠原，這兩種膠原均為軟骨細胞的非典型基因產(chǎn)物，是去分化軟骨細胞的表型。軟骨組織中Ⅲ型膠原含量相對增加可能改變Ⅱ型膠原的正常結構，減弱膠原纖維的強度，導致軟骨生物力學特性的損害[9]。在本實驗中，蛋白聚糖和Ⅱ型膠原的表達量可在傳代過程中明顯下調，而Ⅰ、Ⅲ型膠原雖然也表現(xiàn)出下調趨勢，但下降幅度顯著小于Ⅱ型膠原。另外，隨著傳代次數(shù)增加，纖連蛋白1表達量并無明顯變化。由此可見，體外傳代會使軟骨ECM的化學組成發(fā)生改變，Ⅰ、Ⅲ型膠原和纖連蛋白1相對增加，Ⅱ型膠原和蛋白聚糖相對下降。ECM是維持組織形態(tài)結構和細胞生理功能的關鍵調控因素，各組成成分共同構成一個統(tǒng)一的整體，共同調節(jié)細胞的黏附和遷移，增殖和分化等生命活動。大量研究[10-12]表明，當提供的體外培養(yǎng)環(huán)境越接近體內環(huán)境時，軟骨細胞反分化程度延遲越多。由此可見，ECM各成分比例的改變是軟骨細胞在體外連續(xù)傳代時不能維持其細胞特異性的可能原因之一。隨著傳代次數(shù)增加，ECM與軟骨細胞相互作用，使細胞骨架組成及排列發(fā)生變化，逐漸反分化為成纖維樣的長梭形。

MMPs是一類胞外基質金屬蛋白酶，以酶原的形式被分泌，其激活依賴于Zn2+。MMPs可通過降解軟骨ECM的各種有機成分參與軟骨骨轉換。TIMPs是一組能夠抑制MMPs活性的蛋白酶家族[13]。TIMPs的不同成員可針對不同的MMPs發(fā)揮其特異性抑制作用。TIMP-1主要作用于MMP-1、MMP-3、MMP-9 和MMP-13。TIMP-2與TIMP-1相似，但對MMP-2有明顯的抑制作用。TIMP-3通過與ECM結合而發(fā)揮作用；TIMP-4能抑制數(shù)個MMPs的活化，特別是與骨關節(jié)炎進程中軟骨降解相關的家族成員[14]。MMPs 和TIMPs在軟骨ECM代謝中的作用已逐漸引起關注，其在骨關節(jié)炎發(fā)病中的作用已被證實[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，連續(xù)傳代能使MMPs和TIMPs的多個成員表現(xiàn)出明顯下調，而MMPs/TIMPs的比值與P0代細胞相比發(fā)生顯著改變。由此可以認為，軟骨細胞體外傳代擴增會導致ECM代謝紊亂，MMPs/TIMPs的比值改變或許也是ECM各組成成分比例改變的直接作用因素。

本實驗還存在一些不足：軟骨細胞取自新生小鼠，并不能真正代表體內的病理性軟骨細胞；采用的體外培養(yǎng)環(huán)境是一個二維環(huán)境，其生物化學和生物力學特性與細胞真實所處的三維環(huán)境存在較大的差異。另外，本實驗未對軟骨細胞加以各種生長因子的刺激，也未應用適宜的生物支架材料，這一方面的內容不可忽視。

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（本文采編王晴）

Effects of in vitro continuous passaging on the phenotype of mouse hyaline chondrocytes and the balance of the extra-cellular matrix

Cai Linyi, Kong Xiangli, Xie Jing.(State Key Laboratory of Oral Diseases, West China Hospital of Stomatology, Sichuan University, Chengdu 610041, China)

[Key words]in vitro passaging;hyaline chondrocyte;cell phenotype;extracellular matrix;tissue engineering

[Abstract]Objective This study aimed to investigate the effects of in vitro continuous passaging on the morphological phenotype and differentiation characteristics of mouse hyaline chondrocytes, as well as on the balance of the extracellular matrix (ECM).Methods Enzymatic digestion was conducted to isolate mouse hyaline chondrocytes, which expanded over five passages in vitro.Hematoxylin-eosin stain was used to show the changes in chondrocyte morphology.Semi-quantitative polymerase chain reaction was performed to analyze the mRNA changes in the marker genes, routine genes, matrix metalloproteinases (MMPs), and tissue inhibitors of MMPs (TIMPs) in chondrocytes.Zymography was carried out to elucidate changes in gelatinase activities.ResultsAfter continuous expansion in vitro, the morphology of round or polygonal chondrocytes changed to elongated and spindled shape.The expression of marker genes significantly decreased (P<0.05), and it was almost negatively expressed by P5 chondrocytes.By contrast, the down regulation of routine genes was insignificant.The gene expression levels of MMPs and TIMPs both decreased (P<0.05), but the change in MMP-1 and TIMP-1 was not statistically significant (P>0.05).Meanwhile, the ratio of MMPs/TIMPs was altered.At the protein level, the activities ofgelatinases decreased after passaging, especially for P4 and P5 chondrocytes (P<0.05).Conclusion Serially passaged chondrocytes dedifferentiated and lost specific phenotypic characteristics during in vitro expansion culture.Simultaneously, the anabolism and catabolism of the cartilage ECM became uncontrollable and led to the imbalance of ECM homeostasis.When hyaline chondrocytes are applied in research on relevant diseases or cartilage tissue engineering, P0–P2 chondrocytes should be used.

[中圖分類號]Q 813

[文獻標志碼]A [doi]10.7518/hxkq.2016.03.007

[收稿日期]2015-10-25； [修回日期]2016-01-29

[基金項目]口腔疾病研究國家重點實驗室（四川大學）自主研究課題（SKLOD201527）；四川大學青年教師科研啟動基金（2015SCU-11013）；四川大學大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃（201610610374）

[作者簡介]蔡林奕，學士，E-mail：865685467@qq.com

[通信作者]謝靜，講師，博士，E-mail：Xiejing2012@scu.edu.cn