鐘妮爾， 鄭小璞， 馬愛群， 王　歡， 黃　欣

(西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，西安　710061； *通訊作者，E-mail:hearthx@126.com)

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鏈脲佐菌素誘導(dǎo)糖尿病大鼠竇房結(jié)HCN通道表達(dá)的變化

鐘妮爾， 鄭小璞， 馬愛群， 王歡， 黃欣*

(西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，西安710061；*通訊作者，E-mail:hearthx@126.com)

摘要：目的觀察糖尿病對大鼠竇房結(jié)功能及超極化激活環(huán)核苷酸門控陽離子通道(HCN)表達(dá)的影響。 方法選擇3月齡健康雄性SD大鼠，隨機(jī)分為鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)誘導(dǎo)糖尿病組和對照組，測定固有心率、竇房傳導(dǎo)時間、竇房結(jié)恢復(fù)時間，觀察兩組間竇房結(jié)功能的差異；采用光標(biāo)測技術(shù)識別竇房結(jié)組織，Western blot檢測HCN通道亞型HCN1、HCN2、HCN3、HCN4蛋白在大鼠竇房結(jié)中的表達(dá)。結(jié)果糖尿病大鼠靜息心率及固有心率減慢，竇房傳導(dǎo)時間和竇房結(jié)恢復(fù)時間延長，與對照組相比，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；Western blot結(jié)果顯示，大鼠竇房結(jié)組織存在HCN2和HCN4蛋白的表達(dá)，但是未檢測到HCN1和HCN3蛋白的表達(dá)；與對照組相比，糖尿病組大鼠竇房結(jié)HCN2和HCN4蛋白表達(dá)量均顯著減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)論STZ誘導(dǎo)糖尿病大鼠竇房結(jié)組織HCN2和HCN4蛋白表達(dá)減少，這可能是糖尿病相關(guān)竇房結(jié)功能障礙的分子機(jī)制之一。

關(guān)鍵詞：超極化激活環(huán)核苷酸門控陽離子通道；鏈脲佐菌素；糖尿?。桓]房結(jié)

竇房結(jié)功能異常是糖尿病的重要并發(fā)癥之一[1]。動物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)誘導(dǎo)的糖尿病大鼠模型存在竇房結(jié)功能異常，表現(xiàn)為靜息心率減慢、校正的竇房結(jié)恢復(fù)時間(corrected sinus node recovery time，CSNRT)延長以及心率變時性異常[2-4]。心率的下降在STZ誘導(dǎo)糖尿病大鼠離體灌注心臟和表面灌流心房組織中也有發(fā)現(xiàn)[5,6]，提示這種心臟節(jié)律的異常至少部分是因?yàn)楦]房結(jié)功能的異常。

竇房結(jié)起搏電流(If電流)在竇房結(jié)自發(fā)性舒張期除極過程中起到了重要的作用。編碼If電流的超極化激活環(huán)核苷酸門控陽離子通道(hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channels，HCN)共有4個亞型(HCN1-4)。大鼠心臟中主要表達(dá)HCN2及HCN4[7,8]。既往研究已證實(shí)衰老可導(dǎo)致HCN通道表達(dá)下降[9]，但是糖尿病大鼠竇房結(jié)HCN通道亞型表達(dá)的變化尚不明確。本研究以STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠為研究對象，觀察糖尿病對大鼠竇房結(jié)功能以及竇房結(jié)HCN通道不同亞型蛋白表達(dá)的影響，以期探討糖尿病相關(guān)竇房結(jié)功能異常的分子機(jī)制。

1材料與方法

1.1主要試劑

兔抗大鼠超極化激活的陽離子通道HCN1-4的多克隆抗體(Alomone Labs，以色列)，小鼠抗大鼠β-actin單克隆抗體(Santa Cruz Biotechnology,Inc.，Texas，美國)；山羊抗兔IRDye?800CW(Li-COR Biosciences，美國)；山羊抗小鼠IRDye?680 L(Li-COR Biosciences，美國)；di-4-ANEPPS (Molecular Probes，美國)；鏈脲佐菌素(sigma，美國)；普萘洛爾(sigma，美國)；異丙腎上腺素(sigma，美國)；阿托品(sigma，美國)；甲基膽堿(sigma，美國)。

1.2實(shí)驗(yàn)動物和分組

清潔級封閉群健康雄性Sprague-Dawley大鼠(3月齡，體重200-250 g)，購自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心，生產(chǎn)許可證號：SCXK(陜)2007-001。隨機(jī)分為糖尿病組和對照組。以STZ 10 mmol/L單次腹腔注射制作大鼠糖尿病模型，注射劑量為55 mg/kg體重。以同體積生理鹽水單次腹腔注射制作大鼠對照組。所有動物均予正常飲食，自由飲水，12∶12光暗循環(huán)。

1.3大鼠在體靜息心率(RHR)和固有心率(IHR)的測定

參照Safa-Tisseront等[10]的方法確定自主神經(jīng)全阻滯藥物劑量。0.2%戊巴比妥鈉(2 ml/kg)腹腔注射麻醉大鼠，然后經(jīng)鼠尾靜脈給予心臟β受體的全阻滯劑量的普萘洛爾4.5 mg/kg，待藥物作用穩(wěn)定(約10 min)后，再給予阿托品3 mg/kg靜脈注射即達(dá)到完全的心臟自主神經(jīng)阻滯狀態(tài)，記錄心電圖，取1 min心率的平均值為固有心率。

1.4竇房結(jié)恢復(fù)時間(sinus node recovery time，SNRT)的測定

大鼠麻醉后，記錄標(biāo)準(zhǔn)Ⅱ?qū)?lián)心電圖，將雙極電極經(jīng)食道置于右心耳處，應(yīng)用超速抑制分級遞增法測定SNRT[11]。刺激的起始頻率為6.5 Hz，每次遞增0.5 Hz，刺激時間30 s，間隔15 min，脈寬10 ms，起搏電壓15-25 mV，測量每次刺激的最后一次脈沖到第一個竇性P波起點(diǎn)之間的距離(即SNRT)，至SNRT不再延長，其最大值為SNRTmax。CSNRTmax(SNRTmax的校正值)：CSNRTmax=SNRTmax-平均竇性心動周期。

1.5竇房傳導(dǎo)時間(sinoatrial conduction time，SACT)的測定

應(yīng)用短陣起搏法[12]，以高于基礎(chǔ)心率10-20次/min的頻率起搏，脈寬10 ms，起搏電壓15-25 mV，每次給予8個連續(xù)刺激，間隔15 min，重復(fù)3次。最后一次脈沖與刺激終止后第一次P波之間的距離減去刺激前的平均竇性心動周期，所得值除以2即為竇房傳導(dǎo)時間SACT。取3次測量的均值。

1.6離體灌流心臟模型的建立和心電圖記錄

根據(jù)Maier等[13]建立的方法，將離體心臟固定在Langendorff灌流裝置上，用37 ℃以95%O2+5%CO2混合氣飽和的改良Krebs-Henseleit緩沖液(KHB)經(jīng)主動脈逆行灌流，灌流壓80 mmHg。改良KHB含：118 mmol/L氯化鈉、4.7 mmol/L氯化鉀、1.2 mmol/L硫酸鎂、1.2 mmol/L磷酸二氫鉀、11 mmol/L葡萄糖、2.0 mmol/L氯化鈣、2.0 mmol/L丙酮酸鈉、25 mmol/L碳酸氫鈉、1 μmol/L普萘洛爾、100 nmol/L阿托品以及5 U/L胰島素。兩記錄電極分別固定于左右心耳，經(jīng)BL-420生理記錄儀進(jìn)行心電圖記錄和數(shù)據(jù)分析。

1.7竇房結(jié)組織電活動的光標(biāo)測

麻醉動物，開胸取出心臟，用37 ℃氧飽和的臺氏液經(jīng)主動脈行Langendorff灌注，灌注壓為80-95 mmHg。將心臟內(nèi)血液沖洗干凈后，取下心臟，于37 ℃氧飽和的臺氏液中迅速分離竇房結(jié)組織，浸入含2 mmol/L di-4-ANEPPS的臺氏液中染色約10 s，固定于中空的黑色橡皮薄板上，心內(nèi)膜面朝向高速CCD攝像機(jī)，置于組織灌流槽中。灌流槽中含37 ℃、95%O2+5%CO2平衡的臺氏液(pH 7.4±0.5)(36±0.5 ℃)。采用波長為532 nm的LED光源激發(fā)，心臟組織外表面的熒光可通過截止波長(cut of wavelength)600 nm的濾鏡，并通過高速CCD攝像機(jī)以910 frames/s的速率同時采集X軸和Y軸的64×64點(diǎn)的信號。圖像數(shù)據(jù)通過LabVIEW TM工具包采集分析。

1.8Western blot定量測定竇房結(jié)HCN1-4蛋白表達(dá)

通過光標(biāo)測技術(shù)識別竇房結(jié)首要起搏位點(diǎn)，并進(jìn)行分離，提取組織中總蛋白并檢測總蛋白含量：取20 μl樣品/泳道上樣于10% SDS-PAGE進(jìn)行凝膠電泳；4 ℃電轉(zhuǎn)膜90 min。TBST封閉1 h，洗脫后加入一抗兔抗大鼠超極化激活的陽離子通道HCN1-4的多克隆抗體(稀釋比例1∶200)或者內(nèi)參小鼠抗大鼠β-actin單克隆抗體(稀釋比例1∶1 000)，4 ℃過夜。TBST漂洗10 min×3次后，加入二抗山羊抗兔IRDye?800CW或者山羊抗小鼠IRDye?680 LT(稀釋比例1∶2 000)。室溫孵育1 h后TBST洗膜。使用Odyssey Western分析儀(Lincoln,NE)對圖像進(jìn)行分析，通過Bandscan軟件分析HCN1-4蛋白的相對含量。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2結(jié)果

2.1糖尿病大鼠竇房結(jié)功能的變化

糖尿病大鼠體質(zhì)量、心質(zhì)量以及心臟質(zhì)量/體質(zhì)量比值均顯著低于對照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見表1)。竇房結(jié)功能測定顯示，與對照組相比，糖尿病組大鼠RHR及IHR減慢，SACT和CSNRTmax延長，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見表1)。

組別BW(g,n=16)HW(mg,n=16)HBWR(mg/g,n=16)SACT(ms,n=6)CSNRTmax(ms,n=6)RHR(次/min,n=16)IHR(次/min,n=16)NFBG(mg/dl,n=16)對照組450±5.201700±124.11±0.0416.5±0.250.7±3.0392±9320±4 220±20 糖尿病組397±2.13*1326±11*3.36±0.03*22.4±0.6*63.9±1.0*402±7253±7**483±42*

BW：體質(zhì)量；HW：心臟質(zhì)量；HBWR：心臟質(zhì)量/體質(zhì)量；SACT：竇房傳導(dǎo)時間；CSNRTmax：校正的最大竇房結(jié)恢復(fù)時間；RHR：靜息心率；IHR：固有心率；NFBG：非空腹血糖；與對照組比較，*P<0.05

2.2糖尿病大鼠離體灌流心臟固有心率的變化

在整個灌流過程中，對照組大鼠離體灌流心臟自發(fā)性節(jié)律，即固有心率，維持恒定(P>0.05)，說明灌流系統(tǒng)穩(wěn)定可靠。糖尿病大鼠離體灌流心臟固有心率顯著低于對照組[(190±3)次/minvs(243±5)次/min，P<0.05,見圖1)。

2.3竇房結(jié)組織光標(biāo)測技術(shù)識別首要起搏位點(diǎn)

竇房結(jié)位于上、下腔靜脈、界嵴和房間隔之間，肉眼可見與周圍心房肌之間無明顯界限(見圖2)。竇房結(jié)組織經(jīng)di-4-ANEPPS染色后通過光學(xué)標(biāo)測系統(tǒng)能夠很好地顯示首要起搏位點(diǎn)的位置。

圖1　糖尿病大鼠離體灌流心臟固有心率的變化Figure 1　Change of the intrinsic heart rate of diabetic rats in vitro

SVC：上腔靜脈；SEP：房間隔；IVC：下腔靜脈；RA：右心耳；CT：界嵴；標(biāo)尺=5 mm圖2　光標(biāo)測技術(shù)識別竇房結(jié)首要起搏位點(diǎn)Figure 2　Identification of the leading pacemaker site of the sinoatrial node by optical mapping

2.4糖尿病大鼠竇房結(jié)HCN異構(gòu)體的表達(dá)

大鼠竇房結(jié)組織存在HCN2和HCN4蛋白的表達(dá)，但是未檢測到HCN1和HCN3蛋白的表達(dá)(見圖3)。與對照組相比，糖尿病大鼠竇房結(jié)HCN2和HCN4蛋白表達(dá)量均顯著減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，見表2)。

圖3　Western blot檢測大鼠竇房結(jié)HCN異構(gòu)體的蛋白表達(dá)Figure 3　Expression of HCN isoforms in rat sinoatrial node by Western blot

組別HCN2HCN4對照組0.56±0.060.50±0.02糖尿病組0.17±0.05*0.21±0.04*

與對照組比較，*P<0.01

3討論

心血管并發(fā)癥是糖尿病患者致死和致殘的首要原因[14]。臨床研究和動物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)即使不伴有動脈粥樣硬化，糖尿病仍然與各種心律失常的發(fā)生有關(guān)[15]。隨著2型糖尿病的患病率不斷增加，對于其機(jī)制的深入理解，為更好地預(yù)防和治療心律失常提供理論基礎(chǔ)。

竇房結(jié)功能障礙在1型和2型糖尿病患者中均很常見，可以表現(xiàn)為竇性心動過速或者竇性心動過緩[16]。動物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，糖尿病小鼠和大鼠模型均存在竇房結(jié)功能障礙，表現(xiàn)為靜息心率減慢、校正的竇房結(jié)恢復(fù)時間延長以及心率變時性異常[2-4,17]，并且胰島素替代治療可以部分逆轉(zhuǎn)這種心率的下降[18,19]。本研究結(jié)果亦顯示，STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠RHR及IHR減慢，SACT和CSNRTmax延長，離體灌流心臟自發(fā)性節(jié)律顯著降低，存在竇房結(jié)功能障礙。以上結(jié)果提示，在糖尿病的發(fā)生發(fā)展過程中，竇房結(jié)經(jīng)歷著電重構(gòu)過程，但其分子機(jī)制有待于闡明。

超極化激活的環(huán)核苷酸門控陽離子通道及其產(chǎn)生的起搏電流(If)在竇房結(jié)細(xì)胞4期自動除極過程中起重要作用[20,21]。迄今為止，共識別了4種HCN通道亞型，包括HCN1-4。本研究采用Western blot定量分析HCN1-4蛋白在大鼠竇房結(jié)組織的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，大鼠竇房結(jié)組織存在HCN2和HCN4蛋白的表達(dá)，未檢測到HCN1和HCN3蛋白的表達(dá)；并且，與對照組相比，STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠竇房結(jié)組織HCN2和HCN4蛋白表達(dá)量顯著降低。近期的基因敲除小鼠模型證實(shí)HCN2[22,23]和HCN4[24]對于維持正常的竇房結(jié)自律性以及心率變異性至關(guān)重要。HCN2基因敲除小鼠心率變異性增加。HCN4基因敲除小鼠多在胚胎9.5-11.5 d死亡，但無心臟結(jié)構(gòu)的異常。與野生型小鼠胚胎相比，HCN4基因敲除小鼠胚胎心率明顯下降。臨床上，HCN功能缺失性突變能夠?qū)е录易逍圆B(tài)竇房結(jié)綜合征的發(fā)生[25]。以上結(jié)果提示，HCN表達(dá)和功能的異常與竇房結(jié)功能障礙的發(fā)生有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠竇房結(jié)HCN2和HCN4蛋白表達(dá)量均顯著低于對照組，因此，我們推斷，HCN蛋白表達(dá)的下降與糖尿病大鼠竇房結(jié)功能的異常相關(guān)。

糖尿病相關(guān)的起搏功能障礙與患者心血管死亡率增加有關(guān)。因此揭示糖尿病相關(guān)竇房結(jié)功能障礙的機(jī)制，尋找更為有效的防治措施，對于改善患者預(yù)后至關(guān)重要。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示STZ誘導(dǎo)糖尿病大鼠竇房結(jié)組織HCN2和HCN4蛋白表達(dá)減少，這可能是糖尿病相關(guān)竇房結(jié)功能障礙的分子機(jī)制之一。尚需進(jìn)一步的電生理學(xué)研究證實(shí)。

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Expression of HCN channel isoforms in streptozotocin-induced diabetic rats

ZHONG Nier, ZHENG Xiaopu, MA Aiqun, WANG Huan, HUANG Xin*

(DepartmentofCardiology,FirstAffiliatedHospitalofXi’anJiaotongUniversity,Xi’an710061,China;*Correspondingauthor,E-mail:hearthx@126.com)

Abstract：ObjectiveTo investigate the sinoatrial node function and the expression of the HCN channel isoforms in sinoatrial node in streptozotocin-induced diabetic rats.MethodsHealthy male 3-month-old SD rats were divided into streptozotocin-induced diabetes group and control group. The intrinsic heart rate, sinoatrial conduction time and sinoatrial node recovery time were tested and compared between the two groups. The optical mapping was used to identify the sinoatrial node tissue. The expression levels of HCN channel isoforms(HCN1,HCN2,HCN3 and HCN4) in sinoatrial node were determined by Western blot.ResultsCompared with control group, the rest heart rate and intrinsic heart rate were reduced in streptozotocin-induced diabetes group with the prolonging of sinoatrial node conduction time and sinoatrial node recovery time(P<0.05). Western blot analysis revealed the expression of HCN2 and HCN4 proteins in streptozotocin-induced diabetes group was lower than in control group(P<0.01).ConclusionThe expression of HCN2 and HCN4 proteins is decreased in streptozotocin-induced diabetic rats, which might be one of the molecular mechanisms of the impaired sinoatrial node function associated with diabetes.

Key words:HCN channel;streptozotocin;diabetes;sinoatrial node

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81100132)；西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院基金資助項(xiàng)目(2015YK26)

作者簡介：鐘妮爾，女，1992-04生，碩士

收稿日期：2016-03-01

中圖分類號：R363

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1007-6611(2016)05-0406-05

DOI：10.13753/j.issn.1007-6611.2016.05.002