段永波， 趙豐蘭， 姚　磊， 滕井通， 盛　瑋， 張愛民， 薛建平

( 淮北師范大學 生命科學學院/資源植物生物學安徽省重點實驗室， 安徽 淮北 235000 )

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重組人TNFR-Fc基因水稻種子特異表達載體構(gòu)建

段永波， 趙豐蘭， 姚磊， 滕井通， 盛瑋， 張愛民， 薛建平*

( 淮北師范大學 生命科學學院/資源植物生物學安徽省重點實驗室， 安徽 淮北 235000 )

摘要：重組人Ⅱ型腫瘤壞死因子受體-抗體融合蛋白(TNFR-Fc)在治療系統(tǒng)性自身免疫疾病中有很好的功效。目前TNFR-Fc主要通過動物細胞系生產(chǎn)，高昂的成本限制了其大規(guī)模應(yīng)用。使用水稻種子作為生物反應(yīng)器有望大幅度降低TNFR-Fc的生產(chǎn)成本，提供優(yōu)質(zhì)足量的目標產(chǎn)品。為使TNFR-Fc基因能夠在水稻中高效表達，該研究擬構(gòu)建經(jīng)水稻偏好密碼優(yōu)化的TNFR-Fc基因的種子特異表達載體。通過對水稻和人全基因組密碼子使用偏好性進行比較分析并按照水稻最優(yōu)密碼對TNFR-Fc氨基酸序列進行逐一優(yōu)化，命名為RfTNFR-Fc，通過全基因合成法制備該基因片段；同時采用PCR法擴增水稻種子特異表達啟動子Glu-4，構(gòu)建種子特異表達啟動子驅(qū)動的RfTNFR-Fc基因表達載體。結(jié)果表明：水稻與人多數(shù)氨基酸中密碼子使用偏好性較為一致，但在L、S、P、R這4種氨基酸的密碼子使用偏好性差異較大，優(yōu)化時對這些密碼子進行逐一替換，優(yōu)化后30.8%的氨基酸密碼子發(fā)生了變化；PCR擴增獲得種子特異啟動子，并連接至pCAMBIA1381載體，同時將全基因合成法制備的RfTNFR-Fc基因連入該載體，PCR、雙酶切驗證及測序分析表明載體成功構(gòu)建。該研究構(gòu)建的RfTNFR-Fc基因種子特異表達載體，為在水稻種子中大規(guī)模生產(chǎn)TNFR-Fc奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：水稻， 重組人Ⅱ型腫瘤壞死因子受體-抗體融合蛋白(TNFR-Fc)， 偏好密碼優(yōu)化， 種子特異表達， 載體構(gòu)建

人Ⅱ型腫瘤壞死因子受體-抗體融合蛋白(TNFR-Fc)由467個氨基酸組成，對系統(tǒng)性自身免疫疾病，如類風濕關(guān)節(jié)炎、銀屑病、強直性脊柱炎等都有很好的治療效果(Rothe et al，1992；Stübgen，2011)。臨床上極低劑量的TNFR-Fc蛋白(推薦成人使用劑量為每次注射25 mg)即可發(fā)揮功能。目前TNFR-Fc商業(yè)化生產(chǎn)主要依靠中國倉鼠卵巢細胞(CHO)表達體系(Xu et al，2011)，高昂的反應(yīng)器維持費用及難以迅速擴大的生產(chǎn)規(guī)模使得該藥用蛋白價格居高不下，急需降低TNFR-Fc生產(chǎn)成本以滿足巨大的市場需求。植物表達體系生產(chǎn)成本低、容易規(guī)模化、產(chǎn)品質(zhì)量高、安全性高(無動物病毒污染)等優(yōu)點(Horn，2012；Stoger et al，2014)，具有很好的應(yīng)用前景。

在諸多植物表達體系中，水稻種子是生產(chǎn)藥用蛋白最具潛力的系統(tǒng)之一(Ou et al，2014)。水稻遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)已較為成熟(Mishimura et al，2007；Duan et al，2012)，為藥用蛋白生產(chǎn)的“工廠”(轉(zhuǎn)基因植株)的建立奠定了基礎(chǔ)。水稻種子已被用于特異表達白細胞介素(Fujiwara et al，2010)、蜱螨過敏原(Suzuki et al，2011)和人溶酶體酸性β-葡萄糖腦苷脂酶(Patti et al，2012)等多種外源重組蛋白，表達量介于7.0～60.0 mg·g-1之間。采用水稻種子特異的強啟動子Gt13a及其信號肽驅(qū)動人血清白蛋白基因表達，目標蛋白表達量達到2.75 mg·g-1糙米，且理化結(jié)構(gòu)及生化特征與人血漿中提取的蛋白基本一致(He et al，2011)。該體系能大幅度提高人堿性成纖維細胞生長因子表達水平(An et al，2013)。因此，使用種子特異表達強啟動子，使蛋白在特定時間和空間內(nèi)表達，減少不必要的能量和原料消耗，有利于提高目標蛋白表達水平。目前，尚未發(fā)現(xiàn)有關(guān)在植物中表達TNFR-Fc的報道。本研究按照水稻遺傳密碼使用偏好性對TNFR-Fc基因進行設(shè)計和優(yōu)化，構(gòu)建水稻谷蛋白啟動子驅(qū)動的種子特異表達載體，以期為發(fā)展水稻種子TNFR-Fc表達系統(tǒng)及其大規(guī)模生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1 材料

供試的水稻材料日本晴種子為安徽省農(nóng)業(yè)科學院水稻研究所李浩博士惠贈。植物表達載體pCAMBIA1381及大腸桿菌(Escherichiacoli)菌株DH5α為資源植物生物學安徽省重點實驗室保存。

PCR擴增試劑為生工生物工程(上海)股份有限公司產(chǎn)品；限制性內(nèi)切酶BamHI、HindⅢ、T4DNA連接酶均購自New England BioLabs(NEB)公司；DNA凝膠回收試劑盒購自AxyGen Biosciences公司；pMD18-T vector購自TaKaRa生物工程(大連)有限公司；卡那霉素和氨芐青霉素鈉鹽等購自生工生物工程(上海)股份有限公司。引物和基因合成以及測序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 水稻與人遺傳密碼使用偏好性分析水稻(Oryzasativa)和人(Homosapiens)的密碼子信息從密碼子使用數(shù)據(jù)庫www.kazusa.or.jp/codon獲得。水稻包括34、132、283個密碼子，編碼92188 CDS(coding DNA sequences)；而人類使用40 662 582個密碼子，編碼93487 CDS。對水稻和人的編碼各氨基酸的同義密碼子使用頻率進行調(diào)查比較，使用頻率最高的密碼子認定為偏好密碼子。

1.2.2RfTNFR-Fc基因設(shè)計與合成重組蛋白TNFR-Fc由人腫瘤壞死因子可溶性受體的細胞外配體結(jié)合部分(TNFR，235 AA)與人類IgG1 Fc段(232 AA)融合而成?；谒久艽a子使用偏好性，根據(jù)TNFR-Fc氨基酸序列設(shè)計重組TNFR-Fc基因(RfTNFR-Fc)，長度1 407 bp。同時在其5′端添加醇溶蛋白信號肽序列(Os07g0206400)，人工合成后克隆至pUC57載體，酶切位點為BamHI/NheI，獲得BamHI-sp-SpeI- TNFR-Fc-NheI。

1.2.3 水稻種子特異表達啟動子克隆采用谷蛋白GluB4基因(AK107238)啟動子特異引物(Patti et al，2012)，以日本晴基因組DNA為模板進行PCR擴增。引物序列為GluB4F-aagcttcggaattctacagggttcctt gcgtgaaga(下劃線表示HindIII酶切位點)和 GluB4R-ggatcccgggatccagctatttgaggatgttattgg(下劃線表示BamHI酶切位點)。PCR擴增體系如下：5 μL 10 × PCR buffer，4 μL 25 mmol·L-1MgCl2，4 μL 2.0 mmol·L-1dNTPs，2 μL 10 μmol·L-1引物(上、下游引物各1 μL)，0.4 μL 5 U·μL-1TaqDNA聚合酶，100 ng DNA 模板，ddH2O至50 μL。PCR 擴增條件為94 ℃預變性5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s進行30個循環(huán)；72 ℃延伸 7 min。PCR產(chǎn)物連接至pMD18-T vector，挑取PCR陽性克隆送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.2.4RfTNFR-Fc種子特異表達載體構(gòu)建提取含有BamHI-sp-SpeI-TNFR-Fc-NheI片段的pUC57質(zhì)粒進行BamHI/NheI雙酶切，回收1 482 bp片段；同時采用BamHI/NheI對pCAMBIA1391質(zhì)粒進行線性化處理。用TaKaRa T4DNA連接酶將目標片段與線性化載體進行連接重組，提取陽性菌落質(zhì)粒進行PCR擴增和BamHI/NheI雙酶切鑒定，鑒定正確的克隆送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

2結(jié)果與分析

2.1 水稻與人密碼子使用偏好性比較

對水稻與人全基因組密碼子使用偏好性分析表明(圖1)，水稻CDSs中GC含量為55.3%，比人使用GC的頻率(52.3%)高出3.0%。這2個物種在密碼子1、2、3位使用GC的頻率也有差異。水稻在1、2、3位使用GC頻率為58.2%、46.0%和61.6，分別比人類高2.5%、3.5%和3.0%。

圖 1　水稻與人全基因組編碼區(qū)及各密碼子位GC含量比較Fig. 1　Comparison of GC contents in genetic codons and various positions between rice and human

這2個物種全基因組范圍內(nèi)的密碼子使用頻率統(tǒng)計情況見表1。對各氨基酸的簡并密碼進行分析，各氨基酸使用頻率最高的密碼子作為偏好密碼子。水稻偏好密碼子：TTC (F)、CTC(L)、TCC(S)、TAC(Y)、TGC(C)、TGG(W)、CCG(P)、CAC(H)、CAG(Q)、CGC(R)、ATC(I)、ATG(M)、ACC(T)、AAC(N)、AAG(K)、GTG(V)、GCC(A)、GAC(D)、GAG(E)、GGC(G)、TGA(stop)；人類偏好密碼子：TTC (F)、CTG(L)、AGC(S)、TAC(Y)、TGC(C)、TGG(W)、CCC(P)、CAC(H)、CAG(Q)、AGA(R)、ATC(I)、ATG(M)、ACC(T)、AAC(N)、AAG(K)、GTG(V)、GCC(A)、GAC(D)、GAG(E)、GGC(G)、TGA(stop)。分析表明，水稻及人類編碼F、Y、C、W、H、Q、I、M、T、N、K、V、A、D、E、G及終止密碼的偏好密碼子相同。L在水稻的偏好密碼為CTG(使用頻率25.8‰)，而人類偏好密碼為CTC(39.6‰)，比水稻(21.0‰)中高出18.6‰；S在水稻的偏好密碼為TCC(使用頻率16.3‰)而人類偏好密碼為AGC(19.5‰)；P在水稻的偏好密碼為CCG(使用頻率18.0‰)，該密碼子在人類中使用頻率僅為6.9‰，而人類偏好密碼為CCC(19.8‰)；R在水稻的偏好密碼為CGC(使用頻率16.1‰)，而人類偏好密碼為AGA(12.2‰)。如直接以人源的原始核苷酸序列在水稻中進行基因表達，可能導致表達量極低。而因此有必要按照水稻密碼子偏好性對TNFR-Fc進行逐一優(yōu)化，以提高其在水稻中的表達水平。

2.2 RfTNFR-Fc設(shè)計與合成

TNFR-Fc氨基酸序列包括235 aa的TNFR和232 aa的Ig gamma-1 chain C 片段，采用水稻偏好密碼子對整個氨基酸序列進行逐一編碼，獲得1 407 bp長的基因片段RfTNFR-Fc(圖2)。共有144個氨基酸的密碼子發(fā)生改變，占全氨基酸序列的30.8%。

表 1　水稻與人全基因組各密碼子使用頻率比較

注： 使用頻率指每1 000堿基對中該密碼子出現(xiàn)的頻率，下劃線黑體表示最優(yōu)密碼子。

Note: Use frequency is defined as the frequency of specific codons in every 1 000 base pairs, and the underlined bold data represent preferred codons.

圖 2　RfTNFR-Fc基因序列　小寫字母表示醇溶蛋白信號肽序列； 下劃線部分表示酶切位點。Fig. 2　Sequence of synthetic RfTNFR-Fc　Lowercase letters represent signal peptide of prolamin, and the underlined ones are the endonuclease recognition sites.

在RfTNFR-Fc 5′端前加上醇溶蛋白信號肽序列和相應(yīng)酶切位點，獲1 482 bp片段。全基因人工合成后導入克隆載體pTC57，獲得pUC57-RfTNFR-Fc。

2.3 種子特異啟動子GluB-4克隆

以GluB-4特異引物進行PCR擴增，獲得1 447 bp片段(圖3：a)?；厥赵撈芜M行HindIII/BamHI雙酶切，將酶切產(chǎn)物與線性化處理的pCAMBIA1381載體進行重組。提取陽性菌落質(zhì)粒進行酶切驗證，獲得約1 500 bp特異條帶(圖3：b)，說明GluB-4啟動子片段成功連入表達載體，獲得種子特異表達載體pCAMBIA-Glu。

2.4 RfTNFR-Fc種子特異表達載體構(gòu)建與驗證

用BamHI/NheI同時雙酶切處理pUC57- RfTNFR-Fc和載體pCAMBIA1381，分別回收小片段和大片段進行重組(用RfTNFR-Fc替換Gus)。對重組質(zhì)粒進行BamHI/NheI雙酶切驗證表明，RfTNFR-Fc已成功連接至pCAMBIA Glu載體(圖4)，獲得pCAMBIA Glu -RfTNFR-Fc。測序結(jié)果驗證表明種子特異啟動子驅(qū)動的水稻偏好密碼子優(yōu)化的TNFR-Fc植物表達載體pCAMBIA Glu -RfTNFR-Fc已成功構(gòu)建。

圖 3　GluB-4啟動子克隆與表達載體pCAMBIA 1381構(gòu)建　a. GluB-4啟動子PCR擴增結(jié)果； b. pCAMBIA-Glu載體雙酶切檢測結(jié)果； M. 標準分子量 DL2000； 1. 產(chǎn)物。Fig. 3　Cloning of GluB-4 promoter and ligation into expression vector pCAMBIA 1381　a. PCR product of GluB-4 promoter; b. Identification of pCAMBIA-Glu by double enzyme digestion； M. DNA marker DL2 000; 1. Product.

圖 4　 pCAMBIA Glu -RfTNFR-Fc 酶切驗證　M. λ Hind Ⅲ; 1, 2. 不同重組子克隆。Fig. 4　Identification of pCAMBIA Glu -RfTNFR-Fc via double enzyme digestion.　M. λ Hind Ⅲ; 1, 2. Represent different clones of recombinants.

3討論與結(jié)論

采用異源表達方式生產(chǎn)藥用重組蛋白已成為藥物生產(chǎn)從化學合成到生物合成轉(zhuǎn)變的必要途徑，對于免疫自缺陷類疾病更是如此。在異源表達過程中，宿主、分泌途徑、啟動子特性和密碼子使用偏好性等因素都可能導致目標蛋白表達水平降低(蔡海鶯等，2013)。相關(guān)研究中必須考慮上述因素，進而提高目標蛋白表達量。目前有關(guān)基因密碼子優(yōu)化的研究多集中在抗病蟲害基因工程領(lǐng)域，如將蘇云金芽孢桿菌毒蛋白基因Cry1進行作物偏好密碼子優(yōu)化(周宗梁等，2012；Song et al，2014)，以提高植物中的表達水平。此類研究通常將微生物來源的基因優(yōu)化后在高等生物中表達，常需根據(jù)密碼子偏好性提高G+C含量，消除attta(Nicolai et al，2000)、A+T富含區(qū)(Goodall & Filipowicz，1989)及polyA(Dean et al，1986)等易導致表達量低的因素。

通過對水稻與人全基因組密碼子使用偏好性分析，發(fā)現(xiàn)水稻CDSs中GC含量為55.3%，而人使用GC的頻率為52.3%；2個物種多數(shù)氨基酸密碼子使用情況較為一致，但L、S、P、R這4種氨基酸差異極大。推測高等生物間異源表達時基因優(yōu)化的關(guān)鍵不在于消除A+T造成的序列不穩(wěn)定，極可能是少數(shù)氨基酸差異密碼子的優(yōu)化。本研究以人Ⅱ型腫瘤壞死因子受體-抗體融合蛋白(TNFR-Fc)為對象，選擇水稻種子特異表達系統(tǒng)，按照水稻密碼子使用偏好進行優(yōu)化，構(gòu)建植物表達載體。PCR法獲得種子特異啟動子并克隆至植物表達載體pCAMBIA1381。全基因組范圍分析水稻與人密碼子使用偏好性并進行優(yōu)化，全基因合成時在RfTNFR-Fc 5′端加入醇溶蛋白信號肽序列指導目標蛋白的分泌。將人工合成的RfTNFR-Fc連入pCAMBIA-Glu，酶切及測序驗證表達載體成功構(gòu)建，獲得水稻種子特異表達載體pCAMBIA-Glu- RfTNFR-Fc。本研究為以水稻種子為“工廠”生產(chǎn)TNFR-Fc及其理化結(jié)構(gòu)和生物活性評價奠定了基礎(chǔ)。

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(Continueonpage581)(Continuefrompage594)

Construction of rice seed-specific expression vector expressing rice-preferred codon-optimizedTNFR-Fcgene

DUAN Yong-Bo, ZHAO Feng-Lan, YAO Lei, TENG Jing-Tong, SHENG Wei, ZHANG Ai-Min, XUE Jian-Ping*

(KeyLaboratoryofResourcePlantBiologyofAnhuiProvince,CollegeofLifeSciences,HuaibeiNormalUniversity, Huaibei 235000, China )

Abstract:Recombinant human α receptor antibody- protein of tumor necorsis factor Type II fusion protein (TNFR-Fc) is an effective mean to treat the systemic autoimmune diseases. This protein is currently produced via animal cell lines. The high cost of bioreactor maintenance brings an economic burden for common patients, which largely limits the application of TNFR-Fc. Rice seed offers a good expression system for production of recombinant proteins. To efficiently express TNFR-Fc in rice seed, we constructed seed-specific expression vector of rice-preferred codon optimized TNFR-Fc (RfTNFR-Fc), by analyzing the whole genomic difference in codon preference and replacing bases with rice-preferred codons. Rice seed specific promoter Glu-4 was amplified via PCR and ligated into pCAMBIA 1381, followed by the ligation with full length synthetic RfTNFR-Fc. The construct was identified by PCR, double enzyme digestion and sequencing. The preferred codons of L, S, P and R differed between rice and human, though most of the amino acids shared the same preferred codons. In the optimized RfTNFR-Fc, 30.8% of the amino acids changed compared with the original version. PCR, double enzyme digestion and sequencing identified that pCAMBIA Glu -RfTNFR-Fc was successfully constructed. This study lays foundation for the expression of TNFR-Fc in rice seed, further facilitating its commercial production.

Key words:Oryza sativa, recombinant human α receptor antibody-protein of tumor necorsis factor type II fusion protein (TNFR-Fc), preferred codon optimization, seed-specific expression, vector construction

DOI:10.11931/guihaia.gxzw201509024

收稿日期:2015-09-26修回日期： 2015-12-29

基金項目：國家自然科學基金(31501368, 81573518)；安徽省自然科學基金(1408085MC58, 1608085MC52)；安徽省教育廳省級高校自然科學基金重點項目和重大項目(KJ2014A226, KJ2015ZD35)[Supported by the National Natural Science Foundation of China (31501368, 81573518), Natural Science Foundation of Anhui Province, China (1408085MC58, 1608085MC52); Key Project of Natural Science Research of Colleges and Universities in Anhui Province, China (KJ2014A226, KJ2015ZD35)]。

作者簡介：段永波(1981-)，男，貴州貴陽人，博士，講師，主要從事植物生物技術(shù)研究，(E-mail)yboduan@163.com。*通訊作者： 薛建平，博士，教授，主要從事藥用植物生物技術(shù)研究，(E-mail)xuejp@163.com。

中圖分類號：Q943.2, Q78， S18

文獻標識碼：A

文章編號：1000-3142(2016)05-0589-06

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