廖澤君，蔡萍莉，王永東，史文革，鄒　延

(1南華大學(xué)核資源工程學(xué)院，湖南 衡陽 421001；2鈾礦冶生物技術(shù)國(guó)防重點(diǎn)學(xué)科實(shí)驗(yàn)室，湖南 衡陽 421001；3南華大學(xué)城市建設(shè)學(xué)院，湖南 衡陽 421001)

海藻酸鈉-聚丙烯酰胺固定氧化亞鐵硫桿菌技術(shù)的研究

廖澤君1，蔡萍莉3，王永東2，史文革1，鄒延1

(1南華大學(xué)核資源工程學(xué)院，湖南 衡陽 421001；2鈾礦冶生物技術(shù)國(guó)防重點(diǎn)學(xué)科實(shí)驗(yàn)室，湖南 衡陽 421001；3南華大學(xué)城市建設(shè)學(xué)院，湖南 衡陽 421001)

摘要：以海藻酸鈉(SA)、聚丙烯酰胺(HPAM)為復(fù)合載體，加入聚乙二醇(PEG)為致孔劑，對(duì)氧化亞鐵硫桿菌進(jìn)行固定化研究。實(shí)驗(yàn)考察了SA、HPAM、PEG的濃度對(duì)SA-HPAM凝膠微球的機(jī)械強(qiáng)度及固定化細(xì)胞的氧化活性的影響，確定了三種材料的最佳濃度：SA為2.5%，HPAM為0.4%，PEG為2%，此條件下固定化細(xì)胞對(duì)Fe2+的最大氧化速率可達(dá)2.853 g·(L·h)-1，24h后Fe2+的氧化率在98%以上，固定化細(xì)胞目前重復(fù)使用了15次，并在3 ℃冰箱中存放兩個(gè)月后，依然具有很好的氧化活性，表明SA-HPAM固定化的氧化亞鐵硫桿菌具有較好的穩(wěn)定性。

關(guān)鍵詞：固定化；氧化亞鐵硫桿菌；海藻酸鈉；聚丙烯酰胺；氧化；穩(wěn)定性

嗜酸性氧化亞鐵硫桿菌[1](Acidithiobacillus ferrooxidans，簡(jiǎn)稱A.f菌)在有氧條件下能氧化酸性環(huán)境中的Fe2+離子和低價(jià)態(tài)硫，并從這一過程獲取維持其自身生長(zhǎng)繁殖的能量[2]。該菌可以通過直接作用和間接作用兩種機(jī)制氧化硫化礦，其中間接作用機(jī)制是利用A.f菌的代謝產(chǎn)物Fe3+和H2SO4對(duì)硫化礦或方鉛礦進(jìn)行氧化[3]。作為最主要的浸礦微生物，可應(yīng)用于低品位銅、鈾、金、鋅、鈷等礦的浸出。

然而，游離態(tài)的A.f菌密度小，對(duì)Fe2+的氧化緩慢。將A.f菌固定化，可以增加細(xì)菌密度，具有提高氧化速率和浸出效率，縮短浸礦周期，循環(huán)利用等諸多優(yōu)點(diǎn)。因此，固定化A.f菌技術(shù)得到了廣泛的研究。劉曉偉[4]以活性炭為載體固定化A.f菌，蘇峰[5]采用新型固定化載體通過吸附法固定A.f菌，結(jié)果表明，相比游離態(tài)A.f菌，固定化A.f菌對(duì)Fe2+的氧化速率明顯提高，但都存在不同程度的局限性。

SA作為常用的固定化載體，對(duì)微生物毒性小，操作簡(jiǎn)單，價(jià)格低廉，但機(jī)械強(qiáng)度較低；HPAM的交聯(lián)體機(jī)械強(qiáng)度高，穩(wěn)定性好，但是固定化操控性差。本實(shí)驗(yàn)以海藻酸鈉-聚丙烯酰胺為載體，加入PEG為致孔劑，以CaCl2、檸檬酸鋁為交聯(lián)劑，用包埋法固定A.f菌?？疾炝瞬煌瑮l件下固定化A.f菌小球的機(jī)械強(qiáng)度及其對(duì)Fe2+的氧化能力，確定最佳固定化條件，以考察這種固定化技術(shù)的可行性。

1材料和方法

1.1材料

1)菌種。嗜酸性氧化亞鐵硫桿菌，由南華大學(xué)鈾礦冶生物技術(shù)國(guó)防重點(diǎn)學(xué)科實(shí)驗(yàn)室提供。

2) 9k液體培養(yǎng)基。A液：K2HPO40.5g，KCl 0.1g，(NH4)2SO43g，Ca(NO3)20.01g，MgSO4·7H2O 0.5g，蒸餾水800mL，pH值為2.0，120℃高溫滅菌15min；B液：FeSO4·7H2O 39.71g，加入200mL容量瓶定容，pH值為2.0，抽濾除菌。A、B液混合后Fe2+濃度為8g/L。

3)主要試劑和儀器。海藻酸鈉(化學(xué)純，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司)，聚丙烯酰胺(分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)，CaCl2(分析純，天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司)，聚乙二醇400(分析純，天津市曉晶精細(xì)化工有限公司)，檸檬酸鋁(分析純，成都艾科達(dá)化學(xué)試劑有限公司)。雷磁pHSJ-3F實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)(上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司)，Dai-Ds-2012R疊加式大容量恒溫培養(yǎng)搖床(上海世平實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)，Z36HK臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)HERMLE公司)，顯微鏡(日本奧林巴斯)。

1.2氧化亞鐵硫桿菌擴(kuò)大培養(yǎng)與收集

將A.f菌菌種按10%接種量接種至9k培養(yǎng)基，于搖床中31℃、120 r·min-1條件下培養(yǎng)50～60 h，用離心機(jī)將培養(yǎng)液2000 r·min-1離心5 min，去沉淀后于13500 r·min-1、3℃條件下離心15 min，用蒸餾水清洗并收集A.f菌細(xì)胞，放入3℃冰箱冷藏備用。

1.3細(xì)胞固定化

稱取一定量的SA、HPAM，分別于沸水浴中溶解，密封并于室溫條件存放8～12 h，按一定比例將SA、HPAM溶液及PEG混合，加入A.f菌細(xì)胞液，充分混合后用2.5 mL注射器滴入濃度為2%(w/v)的CaCl2溶液，置于3℃冰箱內(nèi)交聯(lián)6 h后濾出小球，轉(zhuǎn)入2%檸檬酸鋁溶液中交聯(lián)6 h，濾出小球并用蒸餾水反復(fù)清洗，放置于3℃的冰箱12 h后取出于室溫風(fēng)干，備用。

1.4小球機(jī)械強(qiáng)度測(cè)定

每組選取四顆大小均勻的小球置于兩塊載玻片之間的四個(gè)角，載玻片平放于桌面，在載玻片上放置小燒杯，往燒杯緩慢注入蒸餾水并觀察小球形狀變化。等小球形狀輕微扁平時(shí)停止加水，稱量上層載玻片、小燒杯及燒杯中水的質(zhì)量，計(jì)算其總重力，以評(píng)價(jià)小球的機(jī)械強(qiáng)度。

1.5小球氧化能力測(cè)定

分別取大小均勻的小球20 mL，接種至含9k培養(yǎng)基(200 mL)的錐形瓶中，恒溫培養(yǎng)搖床中30℃、120 r·min-1條件下活化并連續(xù)培養(yǎng)。測(cè)定培養(yǎng)液中Fe2+濃度并計(jì)算Fe2+的最大氧化速率、轉(zhuǎn)化率等，以此評(píng)價(jià)各組小球的氧化能力。

1.6分析方法

Fe2+及全鐵濃度用鄰菲啰啉分光光度法測(cè)定[6]，細(xì)菌數(shù)量用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)法。

2結(jié)果與討論

2.1海藻酸鈉(SA)濃度對(duì)小球的影響

SA濃度分別為1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%(w/v)，其余條件均相同，固定A.f菌制凝膠小球。

小球機(jī)械強(qiáng)度測(cè)試結(jié)果如表1所示，SA濃度越大，小球機(jī)械強(qiáng)度越大。

表1　SA濃度對(duì)小球機(jī)械強(qiáng)度的影響

固定化細(xì)胞經(jīng)活化培養(yǎng)后接種至新的9k培養(yǎng)基，定時(shí)測(cè)培養(yǎng)液中Fe2+的濃度，結(jié)果見圖1，對(duì)Fe2+最大氧化速率見表2，相同時(shí)刻SA濃度為2.5%的組分的培養(yǎng)基Fe2+濃度最低，說明其固定化細(xì)胞的氧化活性最強(qiáng)，其最大氧化速率亦為最大值2.63 g·(L·h)-1。由此選擇SA最佳濃度為2.5%。

2.2聚丙烯酰胺(HPAM)濃度對(duì)小球的影響

HPAM濃度分別為0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%(w/v)，其余條件均相同，固定A.f菌制凝膠小球。

小球機(jī)械強(qiáng)度測(cè)試結(jié)果見表3，隨HPAM濃度增加而增加，其機(jī)械強(qiáng)度也就增加。

小球經(jīng)活化培養(yǎng)后，轉(zhuǎn)入新的9k培養(yǎng)基，測(cè)得培養(yǎng)基中Fe2+濃度變化如圖2所示，固定化細(xì)胞的最大氧化速率如表4所示。相同時(shí)刻HPAM濃度為0.4%的組分中Fe2+濃度最低，說明其固定化細(xì)胞的氧化活性最強(qiáng)，最大氧化速率達(dá)到最大值2.697 g·(L·h)-1。由此選擇HPAM最佳濃度為0.4%。

2.3聚乙二醇濃度(PEG)對(duì)小球的影響

PEG濃度分別為0、0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%(v/v)，其余條件均相同，固定化A.f菌制凝膠小球。

小球機(jī)械強(qiáng)度測(cè)試結(jié)果見表5，PEG濃度越大，小球孔隙度越大，機(jī)械強(qiáng)度越低。

圖1　SA濃度對(duì)Fe2+濃度的影響

SA濃度1%1.5%2%2.5%3%3.5%4%最大氧化速率/g·(L·h)-11.9842.3852.5642.632.4272.3392.078

表3　HPAM濃度對(duì)小球機(jī)械強(qiáng)度的影響

圖2　HPAM濃度對(duì)培養(yǎng)基中Fe2+濃度的影響

HPAM濃度0.10%0.20%0.30%0.40%0.50%0.60%0.70%最大氧化速率/g·(L·h)-12.4012.4972.532.6972.5692.3121.908

表5　PEG對(duì)小球機(jī)械強(qiáng)度的影響

小球活化后接種至新培養(yǎng)基，測(cè)得培養(yǎng)液中Fe2+濃度變化如圖3，最大氧化速率如表6。相同時(shí)刻PEG濃度為2%的組分中Fe2+濃度最低，說明其固定化細(xì)胞的氧化活性最強(qiáng)，最大氧化速率達(dá)到最大值2.853 g·(L·h)-1。由此選擇PEG的最佳濃度為2%。

圖3　PEG濃度對(duì)培養(yǎng)基中Fe2+濃度的影響

PEG濃度0%0.5%1%1.5%2%2.5%3%3.5%最大氧化速率/g·(L·h)-12.4992.5472.6422.7782.8532.7412.3871.807

2.4小球的穩(wěn)定性

按實(shí)驗(yàn)所選擇的最佳包埋條件：SA濃度為2.5%，HPAM濃度為0.4%，PEG濃度為2%包埋A.f菌制凝膠小球，活化后轉(zhuǎn)移至新培養(yǎng)基，定時(shí)測(cè)培養(yǎng)基中Fe2+、Fe3+濃度，結(jié)果見圖4。固定化細(xì)胞將Fe2+逐漸氧化成Fe3+，使Fe3+濃度逐漸增加，24 h左右時(shí)Fe2+已被氧化了98%，培養(yǎng)基中Fe3+濃度達(dá)到最大值，其后由于水解等作用，F(xiàn)e3+濃度略降低。培養(yǎng)基pH值變化見圖5，pH值呈先增后降趨勢(shì)，在16 h左右達(dá)到最大值2.55。

圖4　培養(yǎng)基中Fe2+、Fe3+濃度變化

圖5　培養(yǎng)基pH值變化

用檸檬酸三鈉與碳酸氫鈉的混合溶液溶解小球[7]，并用血球計(jì)數(shù)板統(tǒng)計(jì)平均每顆小球內(nèi)A.f菌數(shù)量，結(jié)果見圖6。在第16 h左右時(shí)平均每顆小球內(nèi)A.f菌數(shù)量達(dá)到最大值7.5×106個(gè)左右，增殖比例為1.51，16 h以后小球內(nèi)A.f菌數(shù)略微下降。

每隔24 h將固定化細(xì)胞轉(zhuǎn)移新培養(yǎng)基，并測(cè)定此時(shí)舊培養(yǎng)基中Fe2+的氧化率r，以此評(píng)價(jià)固定化細(xì)胞氧化活力的穩(wěn)定性，結(jié)果見圖7。第1d對(duì)Fe2+的氧化率為98.32%，第15 d對(duì)Fe2+的氧化率為84.78%，氧化活性略有下降。將小球?yàn)V出清洗后放入新培養(yǎng)基并于3℃冰箱中冷藏，兩個(gè)月后取出小球，活化后接種至新培養(yǎng)基，24 h后測(cè)得Fe2+的氧化率為68.08%，說明其氧化活性保持良好。

圖6　平均每顆小球內(nèi)A.f菌的數(shù)量

圖7　固定化細(xì)胞的穩(wěn)定性

3結(jié)論

根據(jù)實(shí)驗(yàn)選擇的三種材料最佳濃度：SA

2.5%，HPAM 0.4%，PEG 2%，在此條件下固定化A.f菌制得凝膠小球，經(jīng)培養(yǎng)后測(cè)得Fe2+最大氧化速率為2.853 g·(L·h)-1。培養(yǎng)16 h小時(shí)后，平均每顆小球內(nèi)細(xì)胞數(shù)量達(dá)到最大值7.5×106個(gè)左右，是固定化初期的1.51倍。固定化細(xì)胞到目前重復(fù)使用15 d以后，固定化細(xì)胞的氧化能力因?yàn)辄S鉀鐵礬的附著作用，使得小球體積略有增加，氧化活性略有下降。將小球?yàn)V出再冷藏兩個(gè)月，活化后依舊保持良好氧化活性。由此試驗(yàn)取得了較好的結(jié)果，證明用這種技術(shù)固定化A.f菌具有良好可行性。

參考文獻(xiàn)

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Technology of immobilized acidithiobacillus ferrooxidans with SA-HPAM

LIAO Ze-jun1，CAI Ping-li3，WANG Yong-dong2，SHI Wen-ge1，ZOU Yan1

(1.College of Nuclear Resources Engineering，University of South China，Hengyang 421001,China；2.Key Discipline Laboratory for National Defense for Biotechnology in Uranium Mining and Hydrometallurgy，University of south China，Hengyang 421001,China；3.College of City Construction，University of South China，Hengyang 421001,China)

Abstract:The SA and HPAM was used as compound carrier，and the PEG was added as pore-foaming agent to study the immobilized technology of acidithiobacillus ferrooxidans.Effect of concentration of the three materials on the mechanical strength of gelatinous microspheres and the activity of immobilized cells have been investigated.The optimal concentration of the three materials for SA-HPAM co-immobilization was obtained：mass fraction of SA solution 2.5%，mass fraction of HPAM solution 0.4%，volume fraction of PEG solution 2%.The rate of maximum oxidation was 2.853 g·(L·h)-1of the immobilized cells for Fe2+，and 98% of ferrous ions can be oxidized within 24 hours in that optimal condition.The oxidative activity of the immobilized cells still kept all right after the immobilized cells were reused for 15 times and refrigerated in the 3 ℃ refrigerator for two months.It show the good stability of SA-HPAM co-immobilized Acidithiobacillus ferrooxidans.

Key words：immobilization；acidithiobacillus ferrooxidans；sodium Alginate；hydrolyzed polyacryamide；oxidation；stability

收稿日期：2015-02-15

作者簡(jiǎn)介：廖澤君(1990-)，男，南華大學(xué)2012級(jí)碩士研究生，研究方向?yàn)槿芙赦?。E-mail：zerliao2009@163.com。 通訊作者：史文革(1967-)，男，漢族，湖南衡陽人，教授，博士，目前在南華大學(xué)從事科研與教學(xué)工作，研究方向?yàn)槿芙赦櫯c濕法冶金。E-mail：741446938@qq.com。

中圖分類號(hào)：Q939.9

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1004-4051(2016)03-0150-04