余霜，蘇晶晶，徐曼，張奎，崔紅娟家蠶基因組生物學國家重點實驗室 西南大學，重慶　400716

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家蠶血細胞特異表達新基因Bm04862的鑒定及表達

余霜，蘇晶晶，徐曼，張奎，崔紅娟
家蠶基因組生物學國家重點實驗室 西南大學，重慶400716

余霜, 蘇晶晶, 徐曼, 等. 家蠶血細胞特異表達新基因Bm04862的鑒定及表達. 生物工程學報, 2016, 32(2): 241–249.

Yu S, Su JJ, Xu M, et al. Identification and characterization of a novel hemocyte specific gene Bm04862 in silkworm, Bombyx mori. Chin J Biotech, 2016, 32(2): 241–249.

摘 要:通過家蠶組織芯片數(shù)據(jù)篩選得到家蠶血細胞特異表達基因Bm04862，并首次對該基因進行了克隆與鑒定。應用RACE技術(shù)獲得該基因全長，并對其進行生物信息學分析。Bm4862基因開放閱讀框819 bp，共編碼273 個氨基酸殘基，預測其為跨膜蛋白；通過qRT-PCR技術(shù)對其時空表達情況進行分析；結(jié)果顯示Bm04862基因在家蠶血細胞中特異高表達，并在4齡眠期和預蛹2 d時達到表達高峰；構(gòu)建Bm04862真核表達載體，轉(zhuǎn)染Sf9細胞分析其蛋白的亞細胞定位情況，結(jié)果表明其定位于細胞核膜和部分細胞質(zhì)中。此外，用大腸桿菌刺激蠶體24 h后，Bm04862基因表達水平顯著上調(diào)，表明大腸桿菌可以誘導該基因的表達，由此推測該基因可能參與家蠶的免疫應答。這為深入研究該基因在家蠶免疫反應中的功能提供了參考。

關(guān)鍵詞:家蠶，血細胞特異基因，Bm04862，表達特征，亞細胞定位

Received: March 17, 2015; Accepted: June 8, 2015

Supported by: National Natural Science Foundation of China (No. 31172268), National Basic Research Program of China (973 Program) (No. 2012CB114600).

國家自然科學基金 (No. 31172268)，國家重點基礎研究發(fā)展計劃 (973計劃) (No. 2012CB114600) 資助。

昆蟲血細胞在修復組織損傷、清除體內(nèi)凋亡組織與細胞以及對抗病原體、微生物等外源物侵襲的免疫反應中都發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[1-4]。昆蟲與哺乳動物的先天免疫系統(tǒng)在結(jié)構(gòu)和功能上十分相似[5-6]，且只具有先天性免疫系統(tǒng)，這為先天性免疫的研究提供了一個良好的模型。家蠶作為鱗翅目模式昆蟲，研究家蠶血細胞特異性的表達基因及其功能，對于闡釋家蠶以及哺乳動物血細胞的生長發(fā)育分子機理具有重要意義。鱗翅目昆蟲血細胞主要分為5種類型：原血細胞 (Prohemocyte)、漿細胞(Plasmatocyte)、顆粒細胞 (Granular cell)、小球細胞 (Spherule cell) 以及擬絳色細胞(Oenocytoid)[6-8]。每種血細胞都具有并行使其特有的功能。原血球細胞是一種多潛能的血細胞，能分化成其他類型的血細胞；顆粒細胞的主要作用是吞噬微生物、病原體、死細胞以及凋亡細胞[7]，擬絳色細胞通過調(diào)節(jié)黑化作用來參與免疫反應，漿細胞主要對病原體或死細胞進行包裹，維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定[8-9]。

近年來，昆蟲血細胞相關(guān)新基因越來越多的被研究者發(fā)現(xiàn)，這為解析昆蟲造血過程的分子調(diào)控機制以及免疫應答通路的研究提供了重要依據(jù)。2000年Hori等在麻蠅屬Sarcophaga中發(fā)現(xiàn)并鑒定了一種具有18個表皮生長因子樣結(jié)構(gòu)域的新型Ⅰ型跨膜蛋白，該蛋白只在預蛹期的血細胞中特異性表達，并作為組織重塑清道夫受體，對變態(tài)過程中所產(chǎn)生的凋亡細胞及組織碎片的識別和消除起著至關(guān)重要的作用[10]；2003年Kurucz等發(fā)現(xiàn)在果蠅中Hemese基因編碼一種跨膜蛋白，其在3種果蠅血細胞中特異性表達并調(diào)控血細胞參與細胞免疫應答[11]；2005年，Levin等研究表明在煙草天蛾中血細胞特異表達的整合素異質(zhì)二聚體亞基β (Integrin β1)，該基因具有刺激漿細胞發(fā)生包囊外源病原物的作用[12]；2007年Gajewski等在果蠅中發(fā)現(xiàn)黑色細胞基因 (Black cells，Bc) 編碼酚氧化酶 (Prophenoloxidase)，并在成熟后期的結(jié)晶細胞中特異表達，參與黑化作用[13]。家蠶各組織全基因組芯片表達數(shù)據(jù)的完成為家蠶血細胞特異性表達基因的研究奠定了重要基礎[14]。目前對家蠶血細胞特異表達基因的研究甚少，本研究針對血細胞特異表達基因Bm04862，對其組織表達情況以及亞細胞定位特征進行了研究，并初步探索了其在抵御外來微生物過程中的功能，我們的工作為深入研究Bm04862基因的結(jié)構(gòu)及其功能奠定了基礎。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

試驗所用家蠶品種大造 (P50) 由西南大學家蠶基因資源庫提供，于25 ℃，濕度80%?90%條件下用新鮮桑葉人工飼養(yǎng)；Sf9細胞系由本實驗室保存；RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑購自Promega公司；Trizol試劑、GeneRacerTMRACE Ready cDNA Kit購自Invitrogen公司；細胞轉(zhuǎn)染試劑X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent 購自Roche公司；Grace昆蟲細胞培養(yǎng)基和胎牛血清購自Gibco公司。

1.2基于家蠶組織芯片數(shù)據(jù)的篩選

基于本實驗室家蠶組織芯片數(shù)據(jù)庫，分析與預測家蠶基因在5齡3 d幼蟲各組織基因的表達情況。對家蠶血細胞特異表達基因進行篩選，獲得一個探針號為sw04862的基因，該基因在血細胞中有較高表達信號值，在其他組織中信號值較低。SW04862探針所代表的基因為血細胞特異表達候選基因，命名為Bm04862。

1.3總RNA提取以及cDNA的合成

解剖獲得家蠶5齡3 d幼蟲的血細胞、中腸、絲腺、馬氏管、脂肪體、精巢等各組織，液氮研磨后，經(jīng)Trizol消化后提取總RNA，并參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成第一鏈cDNA。

1.4RACE獲得Bm04862全長

根據(jù)家蠶Bm04862探針序列以及家蠶基因組EST數(shù)據(jù)庫序列，設計特異引物，擴增得到該基因的部分中間序列，最后設計該序列特異引物，GSP1、NGSP1、GSP2、NGSP2 (表1)。按照RACE試劑盒說明書分別進行5′RACE和3′RACE，檢測到目的條帶后，進行T克隆程序：回收、連接、轉(zhuǎn)化和陽性克隆篩選，并將陽性質(zhì)粒送至華大公司測序，利用BioEdit軟件對5′RACE和3′RACE結(jié)果進行拼接，獲取其cDNA全長。

1.5生物信息學分析

利用在線工具對Bm04862分子量、等電點(http://web.expasy.org/compute_pi/)、信號肽(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignaIP/)、蛋白保守結(jié)構(gòu)域 (http://smart. embl-heidelberg.de/)、跨膜結(jié)構(gòu)域 (http://www.ch.embnet.org/software/ TMHMM_form.html) 和蛋白二級結(jié)構(gòu)算法軟件GOR4軟件(https://prabi.ibcp.fr/htm/index.php) 對Bm04862蛋白進行預測。

表1　PCR引物序列Table 1 PCR primer sequences

1.6Bm04862時空表達分析

基于家蠶EST數(shù)據(jù)庫，設計Bm04862的特異引物Bm04862-1，選擇家蠶持家基因BmGAPDH為內(nèi)參基因，引物序列見表1。分別以5齡3 d幼蟲各組織器官及家蠶不同發(fā)育時期血液cDNA為模板，進行qRT-PCR。反應條件為：95 ℃變性30 s；95 ℃ 3 s，60 ℃ 30 s，共40個循環(huán)，制備融解曲線，利用2－DD Ct進行計算[15]。

1.7Bm04862的亞細胞定位

通過PCR擴增得到 Bm04862全長ORF序列片段，將該片段限制性內(nèi)切酶BamHⅠ酶切鏈接到pSL1180-A4-dsred-SV40載體上，挑選陽性克隆送至北京華大基因公司進行測序。陽性質(zhì)粒命名為pSL1180-A4-Bm04862-dsred-SV40。27 ℃條件下，用含10%胎牛血清的Grace昆蟲細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)Sf9細胞，轉(zhuǎn)染前將細胞接種于24 孔板 (1×105)，當細胞生長狀態(tài)良好，達到80%密度時進行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染按照轉(zhuǎn)染操作說明進行，6 h后，換成完全Grace培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染72 h后，用4%多聚甲醛固定15 min，再用DAPI進行細胞核染色10 min，最后在Olympus FV1000共聚焦熒光顯微鏡下觀察。

1.8Bm04862微生物誘導分析

大腸桿菌DH5α于LB培養(yǎng)基中37 ℃，300 r/min 培養(yǎng)12 h后，在4 ℃以1 000 ×g離心15 min收集菌體，用PBS清洗2 次，最后用PBS配制大腸桿菌懸液備用。用毛細管對人工飼養(yǎng)5 齡3 d家蠶幼蟲腹部第二對氣孔注射10 μL已滅活的大腸桿菌 (1×106個/頭)。對照組注射10 μL PBS。分別收集實驗組和對照組注射后3、6、12、24、36和48 h的家蠶血液，于4 ℃、3 000×g離心5 min收集血細胞，提取RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以大腸桿菌誘導后家蠶血細胞的cDNA為模板，PBS處理為對照，以Bm04862為定量引物，BmGAPDH為內(nèi)參基因進行qRT-PCR反應，程序如上所述。

2　結(jié)果

2.1Bm04862克隆

根據(jù)家蠶組織芯片數(shù)據(jù)，分析目前已知家蠶基因在5齡3 d各個組織的表達情況，篩選出血液特異表達基因Bm04862，設計Bm04862基因特異性引物，以家蠶血細胞cDNA為模板進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳，得到600 bp左右的條帶。進一步利用RACE技術(shù)對Bm04862的5′端和3′端cDNA進行擴增，得到Bm04862基因cDNA，全長為936 bp。該全長包括23 bp的5′非編碼區(qū)，94 bp 3′非編碼區(qū)，以及819 bp開放閱讀框，共編碼272個氨基酸殘基 (圖2)，蛋白分子量為30 kDa，等電點為7.87 (圖1B)。該基因位于家蠶22號染色體上，基因全長20 796 bp，分別含有8個外顯子，7個內(nèi)含子 (圖1C)。

圖1　家蠶Bm04862基因的克隆及分析Fig. 1 Cloning and analysis of Bm04862. (A) Agar gel analysis of the Bm04862 PCR product. M: DNA marker; PCR: the conservative sequence cloning; 5′RACE: fragment of 5′RACE; 3′RACE: fragment of 3′RACE. (B) The diagram of the Bm04862 complete cDNA sequence. (C) The diagram of the Bm04862 complete genomic sequence. : extron; : intron.

圖2　家蠶Bm04862的全長cDNA序列及推導的氨基酸序列Fig. 2 The full length cDNA sequence of Bm04862 gene and its deduced amino acid.

2.2Bm04862蛋白結(jié)構(gòu)分析

對Bm04862信號肽進行預測 (http://www. cbs.dtu.dk/services/SignaIP/)，發(fā)現(xiàn)在1?17氨基酸區(qū)域為一個信號肽區(qū)域 (圖3B)。利用蛋白保守結(jié)構(gòu)域預測網(wǎng)址 (http://smart.embl-heidelberg.de/)在線分析Bm04862蛋白的保守結(jié)構(gòu)域，發(fā)現(xiàn)2?16氨基酸、61?73氨基酸兩個區(qū)域存著低密度保守區(qū)域，238?260氨基酸區(qū)域存在典型跨膜結(jié)構(gòu)域 (圖3A)。對跨膜結(jié)構(gòu)域 (http:// www.ch.embnet.org/software/TMHMM_form.htm l) 等進行預測，發(fā)現(xiàn)該蛋白有1個跨膜螺旋區(qū)域 (圖3C)。利用GORIV對蛋白二級結(jié)構(gòu)進行預測，發(fā)現(xiàn)該蛋白主要有3種二級結(jié)構(gòu)：56.25%無規(guī)卷曲 (Random coil)、23.9% α螺旋結(jié)構(gòu)(α-Helix) 以及19.85%延伸主鏈 (Extended strand) 組成。在家蠶基因組數(shù)據(jù)庫以及NCBI中BLASTp比對未發(fā)現(xiàn)相似性較高的同源蛋白，這一結(jié)果暗示該蛋白為一個未報道過的新蛋白。

2.3時空表達分析

家蠶基因組數(shù)據(jù)庫前期芯片數(shù)據(jù)表明Bm04862為一個血細胞特異表達基因。利用qRT-PCR對該基因時空表達模式進行分析，結(jié)果表明在5齡3 d幼蟲的不同組織中，Bm04862基因在血細胞中顯著高表達，而在頭部、精巢、卵巢、中腸、馬氏管、體壁、絲腺、脂肪體中均無明顯表達；4齡3 d幼蟲到預蛹2 d蠶體發(fā)育過程血細胞中，檢測到Bm04862均有表達，且分別在幼蟲4齡眠期和預蛹2 d表達量達到峰值。此結(jié)果表明Bm04862是一個血細胞特異表達基因，且可能在眠期和預蛹期的變態(tài)發(fā)育過程中發(fā)揮著重要的功能 (圖4)。

圖3　家蠶Bm04862蛋白結(jié)構(gòu)預測與分析Fig. 3 Prediction and analysis of the Bm04862 protein. (A) The prediction of Bm04862 protein domain. (B) The prediction of the Bm04862 protein signal peptide. (C) The prediction of Bm04862 transmembrane helices protein.

圖4　Bm04862組織與時期表達Fig. 4 Tissue and stage expression profile of Bm04862. (A) The expression of Bm04862 mRNA in the different tissues of the 3rd day of the 5th larvae. He: hemocytes; Ha: head; Te: testis; Ov: ovary; Mi: midgut; Ma: malpighian tubules; Ep: rpidermis; Si: silk gland; Fa: fat body. (B) The expression of Bm04862 mRNA in hemocytes from the molting period of the 4th larvae to the 1st day of spinning. L4D3: day 3 of the fourth instar larval; L4M: molting stage of the fourth instar larval; W: wandering stage; PP1: day 1 of prepup.

2.4Bm04862基因全長過表達載體構(gòu)建以及亞細胞定位分析

蛋白在細胞中的定位情況往往可以反應蛋白的功能，為了對Bm04862的亞細胞定位情況進行研究。我們采用PCR技術(shù)克隆得到的Bm04862基因ORF片段，將其連接到pSL1180-A4-dsred-SV40載體的BamHⅠ限制性酶切位點上，得到pSL1180-A4-Bm04862-dsred-SV40全長過表達載體。Sf9是一種經(jīng)典的昆蟲細胞系模式，具有轉(zhuǎn)染效率高等優(yōu)勢，因此本論文選用Sf9細胞進行細胞定位實驗。利用細胞轉(zhuǎn)染技術(shù)將其轉(zhuǎn)染進入Sf9細胞72 h后，在共聚焦顯微鏡下觀察其dsred融合蛋白的表達情況。結(jié)果顯示空白對照組的dsred熒光信號在細胞質(zhì)中表達 (圖5B)，而實驗組dsred信號在整個細胞核膜表達以及在局部細胞質(zhì)中表達(圖5A)。

圖5　Bm04862蛋白在細胞系中的亞細胞表達定位Fig. 5 The subcellular localization of Bm04862 in embryonic cell line. (A) The cells transfected with pSL1180-A4-Bm04862-dsred-SV40 plasmid. (B) The cells transfected with pSL1180-A4-dsred-SV40 empty plasmid.

2.5微生物誘導分析

昆蟲血細胞在昆蟲代謝、發(fā)育變態(tài)以及先天免疫方面承擔著重要的作用，Bm04862在血細胞中高表達，為研究Bm04862是否在免疫過程中發(fā)揮作用，我們用大腸桿菌Escherichia coli對家蠶5齡2 d幼蟲進行了微生物誘導實驗。在大腸桿菌分別誘導3、6、12、24、36和48 h后，利用qRT-PCR檢測了Bm04862基因在血細胞中表達量變化情況 (圖6)，結(jié)果顯示Bm04862基因在大腸桿菌刺激3?24 h表達量緩慢上調(diào)，其中刺激24 h后表達量上升顯著，為對照組的2倍，之后恢復到正常表達水平。此結(jié)果表明大腸桿菌可以誘導Bm04862的表達，表明Bm04862基因可能參與到了家蠶抵御外源微生物侵襲的免疫反應過程，且在此過程中扮演著重要的角色。

圖6　微生物誘導后Bm04862的表達量分析Fig. 6 Expression analysis of Bm04862 after induced by microbes. *P<0.05 vs control PBS, **P<0.01 vs control PBS, Student’s t-test. n=3.

3　討論

昆蟲基因在不同時間和空間的表達差異決定著生物體的發(fā)育、分化、細胞周期調(diào)控、衰老、程序性死亡等生理代謝過程[16]。越來越多的研究表明昆蟲造血系統(tǒng)的發(fā)育及功能都與脊椎動物的血液系統(tǒng)存在著相似之處[1,17-18]。家蠶作為昆蟲模式生物，對其血液系統(tǒng)相關(guān)基因的研究工作，有利于新的血細胞的類型和譜系的分子標記鑒定以及分子遺傳工具和分析方法的改進，表達調(diào)控機理、免疫應答和應用研究具有重要的意義。本研究通過家蠶組織芯片數(shù)據(jù)庫，獲得了血細胞特異表達的Bm04862基因，通過各組織表達譜分析證實，該基因為血細胞特異表達基因，但與其他物種的比對中未發(fā)現(xiàn)相似性較高的同源基因，暗示該基因為一個未報道過的基因。血細胞時期表達模式分析表明該基因在4齡眠期以及預蛹2 d時期表達量顯著上調(diào)，而眠期是家蠶變態(tài)發(fā)育中較為特別的時期，在此期間，其內(nèi)部進行著大量舊組織衰退、新組織生成的劇烈過程，且容易受到外界病原微生物的入侵，該基因的表達特征反映了Bm04862基因可能在此過程中扮演著重要的角色[19-21]。經(jīng)過序列分析以及亞細胞定位發(fā)現(xiàn)Bm04862蛋白擁有一個信號肽結(jié)構(gòu)，一個跨膜結(jié)構(gòu)并在細胞核膜表達，推測該基因為核膜蛋白。核膜蛋白對染色質(zhì)組織、基因調(diào)控、信號轉(zhuǎn)導等方面起著非常重要的作用[22-24]。結(jié)合微生物誘導實驗，推測該基因參與對抗外源微生物的免疫應答中，可能在關(guān)鍵的免疫反應信號通路中扮演著關(guān)鍵的角色。本文為對血細胞特異基因Bm04862進一步的功能研究提供了數(shù)據(jù)參考。

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(本文責編 陳宏宇)

Identification and characterization of a novel hemocyte specific gene Bm04862 in silkworm, Bombyx mori

Shuang Yu, Jingjing Su, Man Xu, Kui Zhang, and Hongjuan Cui
Southwest University, State Key Laboratory of Silkworm Genome Biology, Chongqing 400716, China

Abstract:Bm04862 is a novel hemocyte-specific gene, which has been identified and cloned through the microarray data in silkworm, Bombyx mori. Initially, we successfully obtained the full-length cDNA sequence of Bm04862 via the rapid amplification of cDNA ends (RACE). The sequence consists of an open reading frame (ORF) with 819 bp, which could encode 273 amino acid residues. The bioinformatics analysis predicted that Bm04862 was a transmembrane protein.Furthermore, qRT-PCR analysis revealed that the expression of Bm04862 was specifically detected in hemocyte and reached a peak at L4M and PP2 stage. Bm04862 was overexpressed in Sf9 insect cells, and the cellular localization indicated that Bm04862 was specifically located in cytoplasm and nuclei membrane. Interestingly, the expression of Bm04862 increased dramatically after challenged with Escherichia coli for 24 hours, which predicted its potential role in the innate immune system. Overall, this study could provide the fundamental knowledge for further research.

Keywords:Bombyx mori, hemocyte-specific gene, Bm04862, expression feature, subcellular localization

Corresponding author:Hongjuan Cui. Tel: +86-23-68251713; E-mail: hcui@swu.edu.cn, Hongjuan.cui@gmail.com