王艷云 郭篤發(fā)

（山東師范大學(xué)地理與環(huán)境學(xué)院，濟(jì)南 250000）

應(yīng)用高通量測序技術(shù)研究檉柳、獐茅土壤真菌多樣性

王艷云 郭篤發(fā)

（山東師范大學(xué)地理與環(huán)境學(xué)院，濟(jì)南 250000）

應(yīng)用454高通量測序技術(shù)對(duì)檉柳和獐茅地土壤真菌種類及多樣性進(jìn)行研究，并對(duì)其進(jìn)行真菌多樣性指數(shù)和相似性分析，為黃河三角洲真菌多樣性深入的研究和鹽堿地的改良提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和理論依據(jù)。結(jié)果表明，4個(gè)土樣共獲得5門17綱37目48科51屬。OTU數(shù)和多樣性指數(shù)表明：檉柳上層（C1：0-20 cm）土壤真菌多樣性最豐富，其OTU數(shù)、Shannon指數(shù)、Chao1指數(shù)分別是獐茅下層（Z2：20-40 cm）相應(yīng)指數(shù)的1.7倍、1.2倍和2.4倍。距離熱圖分析表明，Z1和Z2真菌群落間的相似性最大，Unifrac metric值為0.269 9；C1和C2真菌群落間相似性最小，Unifrac metric值為0.690 2。檉柳地土壤真菌較獐茅地土壤真菌豐富。

黃河三角洲；檉柳；獐茅；真菌；真菌多樣性

黃河三角洲是我國暖溫帶保存最完整、最廣闊和最年輕的濕地生態(tài)系統(tǒng)，在北方河口濕地中具有代表性，地處渤海之濱的黃河入海口，土壤鹽堿化尤為嚴(yán)重［1，2］。鹽堿土是鹽土（含有可溶性鹽分較高）和堿土（含有代換性鈉較多）的總稱，二者在形成上聯(lián)系密切，常交錯(cuò)分布，所以，統(tǒng)稱為鹽堿土［3］。作為中國最主要的中低產(chǎn)田的土壤類型之一［4］，鹽堿土限制了植物生長，同時(shí)，獨(dú)特的土壤條件造就了特殊的植被類型：鹽生植物。檉柳和獐茅作為典型的鹽生植物［5-8］，在黃河三角洲具有代表性，前人對(duì)它們的研究多集中在植被本身的耐鹽機(jī)制［9-12］，而目前關(guān)于黃河三角洲生物多樣性方面的研究則主要集中在土壤、動(dòng)物植被分類、植物群落物種組成及多樣性梯度變化等方面［13，14］，但這些研究都不是以植被下土壤微生物多樣性為研究目的。

土壤真菌數(shù)量巨大，種類繁多［15-18］。傳統(tǒng)的培養(yǎng)法遺漏了土壤中絕大多數(shù)真菌，難以反映真菌群落多樣性全貌。分子指紋圖譜如變性梯度凝膠電泳（denatured gradient gel electrophoresis，DGGE）和末端限制性片段長度多態(tài)性（terminal-restriction fragment length polymorphism，T-RFLP）方法雖然具有高通量的優(yōu)勢，能夠指示不同群落結(jié)構(gòu)的差別，但對(duì)微生物的認(rèn)識(shí)也是有限的［19，20］?？寺y序的方法雖然能給出微生物群落的更多信息，但與土壤真菌巨大的多樣性相比，克隆文庫顯得太小，提供的信息仍然偏少。454高通量測序技術(shù)擁有數(shù)據(jù)產(chǎn)出通量高、獲得信息豐富、快捷和讀長長等優(yōu)點(diǎn)，使人們有能力研究高度復(fù)雜的真菌群落和稀有的微生物類群，因此454高通量測序技術(shù)越來越多地被應(yīng)用于土壤微生物生態(tài)學(xué)研究中［21-23］。454高通量測序是一種利用DNA乳膠擴(kuò)增系統(tǒng)和皮升體積的焦磷酸的測序方法，其主要原理是［24］，獨(dú)特的短DNA片段與一個(gè)特別設(shè)計(jì)的DNA捕獲磁珠結(jié)合，用擴(kuò)增試劑使其乳化成微反應(yīng)體系（包含有一個(gè)磁珠和一個(gè)獨(dú)特DNA片段）并確保每個(gè)反應(yīng)體系都是DNA單拷貝。DNA片段在各自反應(yīng)體系中發(fā)生擴(kuò)增反應(yīng)后打破乳化體系，隨后將帶有PCR產(chǎn)物的磁珠放入只能容納單個(gè)磁珠的PTP（pico titer plate）板中開始測序。

本研究利用454高通量測序技術(shù)對(duì)黃河三角洲檉柳和獐茅地土壤真菌進(jìn)行研究，探討兩種典型鹽生植物下土壤真菌物種種類、多樣性的變化規(guī)律，對(duì)豐富我國的物種資源、保護(hù)生物多樣性具有重要意義，以及為本區(qū)真菌多樣性深入研究和鹽堿地的改良提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)土樣采集于黃河三角洲的中心城市——東營市河口區(qū)，在檉柳及獐茅地各選取有代表性的3個(gè)地點(diǎn)進(jìn)行采樣，具體操作是在每個(gè)地點(diǎn)（共6個(gè)）的0-20 cm和20-40 cm深度各取樣1次（盡量避免雨季采樣），共獲得12個(gè)土樣。將在多個(gè)地點(diǎn)采集的土壤分別進(jìn)行充分混合，將各土樣混勻并除去較大的根系等雜物后，對(duì)獲得的4個(gè)土樣進(jìn)行編號(hào)：C1（檉柳：0-20 cm）、C2（檉柳：20-40 cm）、Z1（獐茅：0-20 cm）和Z2（獐茅：20-40 cm）。放入液氮罐帶回實(shí)驗(yàn)室，保存在-80℃條件下，用于生物信息學(xué)分析。

1.2 方法

1.2.1 土壤DNA提取 土壤樣品DNA的提取采用Omega DNA提取試劑盒（D5625-01），依據(jù)試劑盒操作說明書進(jìn)行操作。

1.2.2 PCR擴(kuò)增 PCR擴(kuò)增體系（50 μL）包括：模 板 DNA 10 μg、10×buffer、0.4 mmol/L dNTP（0.5 μL）、5 U/μL Taq DNA聚合酶（0.5 μL）、1 μL Bar-PCR primer F（50 μmol/L）、1 μL primer R（50 μmol/L）。PCR擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性5 min；95℃變性45 s，57℃退火30 s，72℃延伸45 s，30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸5 min。

PCR擴(kuò)增用Roche 454FLX 測序平臺(tái)的通用引物，包括：18S F引物（5'-CGTATCGCCTCCTCGCGC CATCAG+bar+CAGTAGTCATATGCTTGTCT-3'）、18sR引物（5'-CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAGGCTGC TGGCACCAGACTTGC-3'）。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析 將PCR產(chǎn)物在1%（m/v）的瓊脂糖凝膠中電泳，電泳測定后采用上海生工瓊脂糖回收試劑盒（cat：SK8131）對(duì)DNA進(jìn)行回收。使用Qubit?2.0熒光劑對(duì)回收產(chǎn)物進(jìn)行定量處理。使用羅氏公司454測序儀（Roch GS FLX sequencer）進(jìn)行測序。

去除非靶區(qū)域序列后，然后用uchime對(duì)得到的質(zhì)量文件做進(jìn)一步處理，去掉測序質(zhì)量不好的序列，并對(duì)序列長度進(jìn)行篩選，只保留長度在400-600 bp的序列；采用軟件uclust將相似性大于97%的序列歸為同一種可操作分類單元（OTU），從每個(gè)OTU中選擇代表性序列，與NCBI的GenBank進(jìn)行Blast比對(duì)，確定真菌序列的分類信息，獲得門、綱、目、科和屬各水平下的分類單元。

計(jì)算土壤真菌的多樣性指標(biāo)：香農(nóng)指數(shù)（Shannon Index）、Chao1指數(shù)、Coverage 等。

Shannon指數(shù)計(jì)算公式：H=-（ni/N）log（ni/N）其中：ni=峰面積，N=所有峰的總面積［25，26］。

Chao1由Chao（1984）最早提出。計(jì)算公式=Schao1=Sobs+n1（n1-1）/2（n2+1），Schao1=估計(jì)的OTU數(shù)；Sobs=實(shí)際OTU數(shù)；n1=只有一條序列的OTU數(shù)目；n2=只有兩條序列的OTU數(shù)目。

Coverage：是指各樣品文庫的覆蓋率，其數(shù)值越高，則樣本中序列沒有被測出的概率越低。該指數(shù)實(shí)際反映了本次測序結(jié)果是否代表樣本的真實(shí)情況。計(jì)算公式為：C=1-n1/N，n1=只含有一條序列的OTU的數(shù)目；N=抽樣中出現(xiàn)的總的序列數(shù)目。

基于Unifrac metric來比較多組樣本之間的差別度量。Unifrac metric是一種基于系統(tǒng)發(fā)育樹的計(jì)算值，可很好的用于衡量樣本間物種組成的相似度［27］，值在0-1之間，值越小說明樣本間相似度越高。

2 結(jié)果

2.1 數(shù)據(jù)預(yù)處理結(jié)果

為獲取更多土壤真菌群落多樣性信息，利用454高通量測序技術(shù)對(duì)真菌18S rRNA進(jìn)行擴(kuò)增，序列比對(duì)后分析種群多樣性和結(jié)構(gòu)組成。經(jīng)序列質(zhì)量篩選，去除堿基錯(cuò)配、缺失、含（N）序列和短序列等，使得質(zhì)控之后序列長度大部分分布在400-600 bp之間，且C1、C2、Z1和Z2土壤真菌高質(zhì)量序列數(shù)分別為4 468、4 921、6 859和7 439條，滿足基本分析要求，可用于進(jìn)一步的生物信息學(xué)分析。

2.2 土壤真菌種類分析

本研究共獲得5門（亞門）17綱37目48科51屬。在門（亞門）分類水平上屬于5個(gè)類群（圖1-A），主要包括：子囊菌門（Ascomycota）、擔(dān)子菌門（Basidiomycota）、毛霉亞門（Mucoromycotina）、壺菌門（Chytridiomycota）和球囊菌門（Glomeromycota），其中，子囊菌門在所有樣本中的相對(duì)豐度為9.01%-75.81%，是最優(yōu)勢門，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于次優(yōu)勢門-擔(dān)子菌門（0.83%-16.39%），表現(xiàn)出非常明顯的優(yōu)勢地位。另外，毛霉亞門和球囊菌門在C2土樣中不存在。在屬分類水平上，優(yōu)勢類群主要包括（相對(duì)豐度＞1.0%）：Diatrype、暗球腔菌屬（Phaeosphaeria）、旋孢腔菌（Cochliobolus）、Lulwoana、莖點(diǎn)霉屬（Phoma）、綠僵菌屬（Metarhizium）、Knufia、被孢霉屬（Mortierella）、毛霉菌屬（Mucor）。其中最優(yōu)勢屬是Diatrype，它在C1、C2、Z1和Z2中的相對(duì)豐度依次為：0.11%、0.06%、47.81%和68.67%，而且它的相對(duì)豐度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于相應(yīng)土樣中的次優(yōu)勢屬Phaeosphaeria，具體為：C1中0.11＞0.02，C2中 0.06＞0.04，Z1中 47.81＞3.14，Z2中68.6＞2.27，Diatrype表現(xiàn)出非常明顯的優(yōu)勢地位，這與真菌在門中的表現(xiàn)規(guī)律一樣，說明檉柳和獐茅地中的土壤真菌優(yōu)勢菌群組成相對(duì)單一。

2.3 土壤真菌在不同深度土層上的分布

土壤真菌群落在不同土樣上的相對(duì)豐度和種類變化，見圖1。其中，從C1樣地中共獲得土壤真菌5門39屬，相對(duì)豐度較高的幾種依次是：旋孢腔菌（1.19%）、Knufia（1.05%）、被孢霉屬（1.07%）、毛霉菌屬（1.81%），其余35屬的相對(duì)豐度均小于1.0%。從C2樣地中共獲得土壤真菌3門25屬，其中，子囊菌門、擔(dān)子菌門和壺菌門相對(duì)豐度分別為9.01%、0.83%和0.57%；在屬水平上，相對(duì)豐度較高的只有旋孢腔菌（0.65%），其余24屬的相對(duì)多度均小于1.0%。從Z1樣地中共獲得土壤真菌5門40屬，相對(duì)豐度較高的依次是：Diatrype（47.81%）、旋孢腔菌（3.02%）、暗球腔菌屬（3.14%）、Lulwoana（1.08%）、綠僵菌屬（1.68%），其余35屬的相對(duì)豐度均小于1.0%。從Z2樣地中共獲得土壤真菌5門23屬，相對(duì)豐度較高的幾種依次是：Diatrype（68.67%）、暗球腔菌屬（2.27%）、Lulwoana（1.2%）、莖點(diǎn)霉屬莖點(diǎn)霉屬（1.04%），其余19屬的相對(duì)豐度均小于1.0%。說明C1和Z1土壤真菌種類較多。

檉柳地中，0-20 cm土壤真菌種類多于20-40 cm土壤真菌種類；同樣地，在獐茅地中，0-20 cm土壤真菌種類也多于20-40 cm土壤真菌種類。土壤真菌相對(duì)豐度的變化規(guī)律與種類上的變化規(guī)律基本一致：同一真菌，其在0-20 cm的相對(duì)豐度普遍大于20-40 cm的相對(duì)豐度。本研究中總體呈現(xiàn)出隨土壤深度增加，真菌種類和相對(duì)豐度減少的趨勢，原因可能是上層土透氣性好、營養(yǎng)物質(zhì)相對(duì)豐富。

各土樣土壤真菌種類有一定差別（圖2），只11個(gè)屬為4個(gè)土樣所共有。此外，青霉菌屬（Penicillium）、盤多毛孢屬（Pestalotia）、Cyphellophora、Ophiocordyceps、Hemileia、Burgoa、Sistotrema、Powellomyces、 毛 霉 菌 屬（Mucor）、Conidiobolus、Thamnocephalis這11個(gè)屬只存在于檉柳地土壤中，所有這11個(gè)屬在C1中都存在，而C2中只有青霉菌屬、盤多毛孢屬、Cyphellophora、Hemileia、Burgoa、Conidiobolus 6個(gè)屬存在。只存在于獐茅中的屬（ 共12個(gè) ） 包 括：綠 僵 菌 屬（Metarhizium）、Halosarph-eia、中國盤菌屬（Peziza）、光柄菇屬（Pluteus）、Filobasidium、Sakaguchia、Volvariella、裸 蓋 菇 屬（Psilocybe）、Hannaella、Hyphoderma、Rhizophagus、Funneliformis，其中，Halosarpheia、中國盤菌屬、Hannaella在Z2中不存在。

圖1 各樣地土壤真菌在門（A）及屬（B）分類水平上的種類和相對(duì)豐度

2.4 土壤真菌多樣性分析

檉柳和獐茅地土壤真菌群落多樣性結(jié)果，見表1。采用Mothur軟件對(duì)群落結(jié)構(gòu)多樣性進(jìn)行分析（表1）可知，4個(gè)土樣中土壤真菌覆蓋率均高于89%，表明本次測序深度合理，基本能代表樣本的真實(shí)情況。檉柳上層土壤OTU（操作分類單元）數(shù)最多，為858，獐茅下層土壤OTU數(shù)最少為501，前者是后者的1.7倍。4種樣地中Shannon指數(shù)平均值和Chao1指數(shù)平均值由高到低依次為C1＞Z1＞C2＞Z2，其中，C1的Shannon指數(shù)平均值和Chao1指數(shù)平均值分別是Z2相應(yīng)指數(shù)的1.2倍和2.4倍。由此可見，檉柳地土壤真菌比獐茅地土壤真菌豐富，且檉柳上層土壤真菌多樣性最豐富。

圖2 各土樣真菌種類維恩圖

表1 壤真菌群落多樣性

2.5 檉柳、獐茅土壤真菌的相似性分析

從圖3可以看出，Z1和Z2真菌群落間的Unifrac metric值最小，為0.269 9；C1和Z1真菌群落間的Unifrac metric值為0.387 7；C2和Z2、C1和C2真菌群落間的Unifrac metric值分別為0.683 6、0.690 2，說明Z1和Z2真菌群落間的相似性最大，而C1和C2真菌群落間相似性最小。表明檉柳地土壤真菌群落多樣性高于獐茅地土壤真菌群落多樣性，前者土壤真菌種類較后者豐富。

圖3 各土樣真菌群落距離熱圖

3 討論

本研究檉柳地和獐茅地土壤采集于黃河三角洲，應(yīng)用高通量測序技術(shù)對(duì)其檉柳地上下層和獐茅地上下層土壤真菌種類和多樣性進(jìn)行了研究。

在本研究中，以子囊菌門為主（在C2中相對(duì)豐度高達(dá)75.81%），其次是擔(dān)子菌門（在C1中相對(duì)豐度最高，僅為16.39%），這與袁超磊等［28］的研究結(jié)果一致，但本研究共獲得5個(gè)真菌門，而后者僅僅獲得3個(gè)（毛霉亞門和壺菌門未獲得），這可能與檉柳和獐茅地中含有包括動(dòng)植物殘?bào)w的沉積物有關(guān)［29］。另外，Buée等［23］和李超等［30］都發(fā)現(xiàn)最豐富真菌類群為擔(dān)子菌門，其次才是子囊菌門，與本研究不同，這種差異可能是由各自土壤在pH、鹽分含量和CaCO3含量等性質(zhì)的不同造成的。

檉柳地和獐茅地中，均是0-20 cm土壤真菌種類多于20-40 cm土壤真菌種類，總體呈現(xiàn)出隨土壤深度增加，真菌種類減少的趨勢，說明自然狀態(tài)下土壤的真菌多樣性受到土壤垂直分布的影響，優(yōu)勢真菌種群隨土壤深度的變化略有差異，與前人研究一致［31，32］。

通過多樣性和相似性分析可知，檉柳地土壤真菌群落多樣性高于獐茅地土壤真菌群落多樣性，且檉柳上層土壤真菌多樣性最豐富。由前面土壤真菌種類分析可知，獐茅地土壤真菌種類略多于檉柳地，與多樣性和相似性分析的結(jié)果不一致。這可能是由于多樣性和相似性分析均是以O(shè)TU為基礎(chǔ)，而OTU是通過將多條序列按其序列間的距離對(duì)它們進(jìn)行聚類，后根據(jù)序列之間的相似性作為域值分成的操作分類單元，此操作分類單元被認(rèn)為可能屬于屬或種，也可以是菌株，所以所得結(jié)果有所不同，具體原因有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本研究共獲得5門（亞門）17綱37目48科51屬。在門分類水平上，子囊菌門（Ascomycota）是所有樣本中的最優(yōu)勢門，其相對(duì)豐度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于次優(yōu)勢門擔(dān)子菌門（Basidiomycota）。在屬分類水平上，最優(yōu)勢類群是Diatrype。

本研究中土壤真菌種類和相對(duì)豐度總體呈現(xiàn)出隨土壤深度增加，真菌種類和相對(duì)豐度減少的趨勢。

C1土壤真菌的OTU數(shù)、Shannon指數(shù)、Chao1指數(shù)分別是Z2相應(yīng)指數(shù)的1.7倍、1.2倍和2.4倍，且Z1和Z2真菌群落間的相似性最大，C1和C2真菌群落間相似性最小，檉柳地土壤真菌多樣性高于獐茅地土壤真菌多樣性。

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（責(zé)任編輯 狄艷紅）

The Application of 454 High-throughput Sequencing Technology into Anlaysing the Diversity of Soil Fungi in the Field Planting Tamarix chinensis and Angiospermae

WANG Yan-yun GUO Du-fa
（College of Geography and Environment，Shandong Normal University，Ji’nan 250000）

The study，which was related to the variety and diversity of soil fungi in the field planting Tamarix chinensis and Angiospermae，and the corresponding analysis of fungal diversity index and similarity were conducted by applying 454 high-throughput sequencing technology. It is aimed at providing the basic datas and theoretical gist for the futher study into the diversity of fungi in Yellow River Delta and the improvement of saline-alkali soil. And the result indicated four soil samples were divided into 5 phyla，17 classes，37 orders，48 families and 51 genus. The OTU number and diversity index showed that the diversity of soil fungal diversity was the richest in Tamarix chinensis surface（C1：0-20 cm），which was accordingly 1.7 times，1.2 times and 2.4 times of OTU number，Shannon index and Chao1 index in Angiospermae substratum（Z2：20-40 cm）. In addition，the analysis of the distance heat map indicated the fungal communities of Z1 and Z2 had the most similarity，whose Unifrac metric value was 0.269 9 and the fungal communities of C1 and C2 have the least similarity，whose value was 0.690 2. In a word，the soil fungi in the field planting Tamarix chinensis was richer than one in the field planting Angiospermae.

The Yellow River Delta；Tamarix chinensis；Angiospermae；fungi；fungal diversity

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.07.007

2015-10-30

山東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（ZR2012DM013）

王艷云，女，碩士，研究方向：黃河三角洲土壤真菌；E-mail：1786582634@qq.com

郭篤發(fā)，男，教授，研究方向：黃河三角洲土壤微生物與重金屬；E-mail：guodufa@163.com