顧春凱王根宇劉宏娟王革華吳劍榮張建安

（1. 江南大學(xué)生物工程學(xué)院 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，無(wú)錫 214122；2. 清華大學(xué)核能與新能源技術(shù)研究院，北京 100084）

玉米芯半纖維素水解液中抑制物對(duì)丁醇發(fā)酵的影響

顧春凱1，2王根宇2劉宏娟2王革華2吳劍榮1張建安2

（1. 江南大學(xué)生物工程學(xué)院 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，無(wú)錫 214122；2. 清華大學(xué)核能與新能源技術(shù)研究院，北京 100084）

半纖維素水解液抑制物對(duì)微生物細(xì)胞的毒性限制了其在丁醇發(fā)酵中的應(yīng)用，旨在探討其對(duì)產(chǎn)丁醇共生體系TSH06的抑制作用并為其應(yīng)用于丁醇發(fā)酵奠定基礎(chǔ)。通過(guò)稀酸水解半纖維素制得水解液，采用P2培養(yǎng)基稀釋的半纖維素水解液為底物，分別利用NaOH和氨水調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH值，結(jié)合實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法來(lái)研究水解液對(duì)產(chǎn)丁醇共生體系TSH06的抑制作用。以NaOH調(diào)節(jié)pH抑制菌體的生長(zhǎng)，氨水調(diào)節(jié)pH菌體可生長(zhǎng)發(fā)酵。產(chǎn)丁醇菌株TSH06可以在50%稀釋度以下的水解液中發(fā)酵生長(zhǎng)，并且能夠耐受并降解抑制物糠醛與5-羥甲基糠醛，最終丁醇產(chǎn)量達(dá)到4.16-5.16 g/L，低于P2培養(yǎng)基中的丁醇產(chǎn)量（8.83 g/L）。稀釋水解液中，48 h之后乙酸濃度在3.18-4.16 g/L，遠(yuǎn)大于P2培養(yǎng)基中的乙酸濃度（低于2 g/L）。相對(duì)于P2培養(yǎng)基，在50%水解液中培養(yǎng)的TSH06有機(jī)酸生成途徑關(guān)鍵基因的基因轉(zhuǎn)錄水平明顯提高，而有機(jī)酸返耗途徑以及丁醇生成途徑的關(guān)鍵基因的基因轉(zhuǎn)錄水平則明顯下降。水解液中過(guò)多的乙酸抑制了產(chǎn)酸期到產(chǎn)溶劑期的轉(zhuǎn)化，而酸的累積使得菌體在底物被完全消耗之前就趨于衰退死亡，從而造成丁醇產(chǎn)量的降低與底物的不完全利用。

半纖維素水解液；抑制物；丁醇發(fā)酵；代謝相關(guān)基因

全球能源危機(jī)和環(huán)境惡化引起了對(duì)可再生生物能源的研究熱潮，生物丁醇具有熱值高、蒸汽壓力低、與汽油配伍性好、腐蝕性較小，可以直接應(yīng)用于發(fā)動(dòng)機(jī)而無(wú)需對(duì)發(fā)動(dòng)機(jī)進(jìn)行改造等優(yōu)點(diǎn)，不僅是理想的可再生生物能源，而且是優(yōu)良的有機(jī)溶劑、重要的化工原料，被廣泛應(yīng)用于化工、塑料、有機(jī)合成、油漆等工業(yè)［1-3］。傳統(tǒng)丁醇發(fā)酵以糧食作物如玉米作為主要原料，存在“與人爭(zhēng)糧”的問(wèn)題，采用糖蜜、木薯作為生產(chǎn)原料可以避免上述問(wèn)題，但是其來(lái)源有限，同時(shí)還受季節(jié)的限制，這些都嚴(yán)重影響了丁醇工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)。

木質(zhì)纖維素生物質(zhì)原料來(lái)源豐富，成本低廉，它主要包括纖維素、半纖維素和木質(zhì)素［4，5］。纖維素是D-葡萄糖基以β-糖苷鍵聯(lián)結(jié)而成的鏈狀高分子化合物，半纖維素是無(wú)定型的生物高聚物，它們含有六碳糖與五碳糖等不同糖基［6］，通過(guò)氫鍵與纖維素的微纖絲結(jié)合，形成細(xì)胞壁骨架的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)［7，8］。纖維素和半纖維素經(jīng)過(guò)酸水解處理可降解為能發(fā)酵的戊糖和己糖，但同時(shí)又會(huì)產(chǎn)生乙酸、糠醛，5-羥甲基糠醛等抑制物［9，10］，這些抑制物的存在對(duì)微生物發(fā)酵丁醇有抑制作用，所以必須對(duì)其進(jìn)行脫毒處理［11-14］，但同時(shí)這又會(huì)增加成本。單獨(dú)抑制物的存在，如糠醛類物質(zhì)在丙酮丁醇發(fā)酵中對(duì)菌體生長(zhǎng)并不一定起到抑制作用［15，16］。但是，單獨(dú)的一種抑制物并不能代表水解液，在水解液的應(yīng)用中，也很難把各種抑制物分開(kāi)。因此，本研究以自行篩選獲得的產(chǎn)丁醇共生體系TSH06（包括丙酮丁醇梭菌Clostridium acetobutylicum TSH1，芽孢桿菌Bacillus sp.TSH1）［17］為丁醇發(fā)酵菌株，利用酸水解處理的玉米芯半纖維素水解液為底物，探討水解液中抑制物對(duì)丁醇發(fā)酵的抑制作用，旨在為利用半纖維素水解液發(fā)酵丁醇提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 玉米芯半纖維素水解液的制備 粉碎的玉米芯與稀酸溶液，其中混合酸：0.5%（M/V）H2SO4，1.5%（M/V）H3PO4）以1∶3（M/V）的比例進(jìn)行混合，高溫高壓（130℃）處理1 h，對(duì)所有固形物進(jìn)行擠壓抽濾，抽濾的同時(shí)加入稀酸溶液兩倍體積的去離子水即得半纖維素水解液。水解液中糖濃度為：葡萄糖5 g/L，木糖30 g/L。

1.1.2 菌種與培養(yǎng)基 菌種：產(chǎn)丁醇共生體系TSH06，由本室分離并保存。種子培養(yǎng)基：玉米醪（6%）煮沸15 min，115℃滅菌15 min。P2培養(yǎng)基：按照水解液中糖的成分配制；葡萄糖 5.6 g/L，木糖 30.1 g/L，酵母粉 1 g/L。115℃滅菌15 min。發(fā)酵培養(yǎng)基：將玉米芯半纖維素水解液與糖含量相同的P2培養(yǎng)基以不同比例混合，使其總糖達(dá)到35 g/L，pH調(diào)至7.0，115℃滅菌15 min。營(yíng)養(yǎng)液1：MgSO420 g/L，MnSO41 g/L，F(xiàn)eSO41 g/L，NaCl 1 g/L，對(duì)氨基苯甲酸 0.1 g/L，硫胺素 0.1 g/L，生物素 0.001 g/L。營(yíng)養(yǎng)液2：KH2PO450 g/L，K2HPO450 g/L，CH3COONH4220 g/L。

1.2 方法

1.2.1 玉米芯半纖維素水解液的稀釋 對(duì)上述水解液按照表 1所示比例進(jìn)行不同程度的稀釋，水解液的含量分別為35%-60%。

表1 玉米芯半纖維素水解液不同稀釋濃度

1.2.2 培養(yǎng)基pH的調(diào)節(jié) 用氨水或NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至7.0，裝入100 mL搖瓶，裝液量為60 mL，115℃滅菌15 min。對(duì)每一稀釋度的水解液做3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 培養(yǎng)方法 種子復(fù)蘇：甘油凍存的菌株TSH06接種于玉米培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)至氣泡產(chǎn)出。種子培養(yǎng)：將種子液 以7%的接種量接種于100 mL三角瓶（裝液量60 mL）的P2培養(yǎng)基中，并添加裝液量1%的溶液1與溶液2，37℃靜置培養(yǎng)至產(chǎn)生均勻氣泡。發(fā)酵玉米芯半纖維素水解液：將TSH06種子液以7%的接種量接種于100 mL三角瓶（裝液量60 mL）的玉米芯半纖維素水解液與P2培養(yǎng)基對(duì)照組中，并添加1%的溶液1與溶液2，37℃靜置培養(yǎng)。

1.2.4 培養(yǎng)基中Na+與的添加 P2培養(yǎng)基中已加入裝液量1%的溶液1與溶液2，故培養(yǎng)基中含有0.17 mmol/L的NaCl以及28.54 mmol/L CH3COONH4，以普通P2培養(yǎng)基為對(duì)照，向已加入1%的溶液1與溶液2的P2培養(yǎng)基中分別添加NaCl以及NH4Cl至如下濃度（表2）。

表2 P2培養(yǎng)基中Na+與NH濃度

表2 P2培養(yǎng)基中Na+與NH濃度

培養(yǎng)基 濃度Na+濃度/（mmol·L-1） NH4+濃度/（mmol·L-）P2 0.17 28.54 P2+NH4Cl 0.17 57.08 P2+NH4Cl 0.17 114.16 P2+NH4Cl 0.17 228.32 P2+NaCl 0.34 28.54 P2+NaCl 0.68 28.54 P2+NaCl 1.36 28.5

1.2.5 菌體RNA的提取以及實(shí)時(shí)熒光定量（real time）PCR 分析 分別提取TSH06接種P2培養(yǎng)基和50%水解液培養(yǎng)基24 h后的菌體總RNA（Kit名稱，OMEGA），電泳檢測(cè)樣品完整性，并測(cè)定樣品濃度，RNA反轉(zhuǎn)錄生成 cDNA補(bǔ)充反轉(zhuǎn)錄體系。采用SYBR Premix Ex Taq（TaKaRa）進(jìn)行real time PCR，反應(yīng)體系為20 μL，包括：2×SYBR Premix Ex Taq II 10 μL；引物×2（10 μmol/L）0.8 μL；cDNA模板（＜100 ng）；無(wú)菌蒸餾水補(bǔ)齊至20 μL。采用三步法進(jìn)行反應(yīng)：95℃預(yù)變性1 min；95℃變性10 s，50℃退火20 s，72℃延伸20 s，40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品做3個(gè)平行。熒光定量PCR采用相對(duì)定量方法中的2-△△Ct，其中△△Ct=（待測(cè)組目的基因平均Ct值 - 待測(cè)組管家基因平均Ct值）-（對(duì)照組目的基因平均Ct值 - 對(duì)照組管家基因平均Ct值），以16S RNA基因作為內(nèi)參，計(jì)算mRNA的轉(zhuǎn)錄水平。

1.2.6 分析方法 溶劑（乙醇、丙酮、丁醇）測(cè)定方法：采用氣相色譜儀（GC，島津公司2010）進(jìn)樣檢測(cè)。根據(jù)氣相色面積信息對(duì)溶劑進(jìn)行定性和定量分析。糖類、有機(jī)酸及抑制物的測(cè)定方法：采用高效液相色譜法（HPLC，島津公司LC-20A）測(cè)定，根據(jù)液相色譜保留時(shí)間和峰面積信息對(duì)糖類、有機(jī)酸及抑制物進(jìn)行定性和定量分析［18］。生物量測(cè)定方法：生物量測(cè)定采用比濁法［19］，采用分光光度計(jì)在600 nm 處測(cè)定其OD600值。

表3 R-eal time PCR引物

2 結(jié)果

2.1 不同pH調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)TSH06在玉米芯半纖維素水解液生長(zhǎng) 的影響

酸處理的玉米芯半纖維素水解液中葡萄糖濃度為5.6 g/L，木糖濃度30.1 g/L，根據(jù)這一比例配制P2培養(yǎng)基，并以此P2培養(yǎng)基對(duì)水解液進(jìn)行稀釋，對(duì)50%稀釋度的水 解液分別利用NaOH和氨水進(jìn)行pH的調(diào)節(jié)，接種TSH06。結(jié)果（表 4）表明，利用NaOH進(jìn)行pH調(diào)節(jié)的水解液在發(fā)酵過(guò)程中并未出現(xiàn)菌體生長(zhǎng)和發(fā)酵產(chǎn)氣的現(xiàn)象，葡萄糖和木糖沒(méi)有消耗。利用氨水進(jìn)行pH調(diào)節(jié)的水解液中，出現(xiàn)了發(fā)酵液大量產(chǎn)氣的現(xiàn)象，葡萄糖與木糖都有一定程度的消耗，發(fā)酵產(chǎn)生了丁醇。

表4 不同pH調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)發(fā)酵的影響

2.2 P2培養(yǎng)基中Na+與濃度對(duì)TSH06生長(zhǎng)情況的影響

為探究培養(yǎng)基中Na+與濃度對(duì)TSH06生長(zhǎng)的影響，在向已加入1%的溶液1與溶液2的P2培養(yǎng)基中分別添加NaCl 以及NH4Cl。TSH06生長(zhǎng)情況，如圖1所示。

圖1 P2培養(yǎng)基中Na+與NH濃度對(duì)TSH06生長(zhǎng)情況的影響

以半合成培養(yǎng)基P2作為對(duì)照，在整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中，添加有NaCl的P2培養(yǎng)基中OD600值變化很小，也沒(méi)有出現(xiàn)產(chǎn)氣的現(xiàn)象，證明兩倍于普通P2培養(yǎng)基中Na+濃度，即濃度達(dá)到0.34 mmol/L已經(jīng)對(duì)TSH06的生長(zhǎng)產(chǎn)生了抑制作用。而添加有NH4Cl的P2培養(yǎng)基中，雖然對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期TSH06的生長(zhǎng)情況相對(duì)于普通P2培養(yǎng)基中差異不大，但當(dāng)菌株生長(zhǎng)達(dá)到穩(wěn)定期以及衰亡期時(shí)，其生物量都大于普通P2培養(yǎng)基中的生物量，證明的加入對(duì)TSH06的生長(zhǎng)在一定程度上起到了一定促進(jìn)作用。

2.3 TSH06對(duì)稀釋玉米芯半纖維素水解液中抑制物的耐受程度

為探究TSH06對(duì)水解液中抑制物的耐受濃度，將水解液與相同糖濃度P2培養(yǎng)基以稀釋比分別為10∶0、6∶4、5∶5進(jìn)行混合稀釋，得到100%、60%、50%的水解液培養(yǎng)基。初始玉米芯半纖維素水解液中糖類與抑制物濃度如表5所示。在100%與60%的水解液中，接種后48 h都沒(méi)有出現(xiàn)菌體生長(zhǎng)且產(chǎn)氣的現(xiàn)象，也沒(méi)有糖的消耗與丁醇等溶劑的產(chǎn)生，而在50%及以下的水解液中，菌株能夠生長(zhǎng)發(fā)酵丁醇。

表5 玉米芯半纖維素水解液原料的底物及抑制物濃度

2.4 TSH06在稀釋玉米芯半纖維素水解液中的丁醇發(fā)酵過(guò)程

由于抑制物的毒性，使得產(chǎn)丁醇菌株不能直接利用半纖維素水解液，脫毒處理去除抑制物后可以進(jìn)行丁醇發(fā)酵，但會(huì)增加脫毒成本。因此，本實(shí)驗(yàn)利用相同糖濃度的P2培養(yǎng)基與水解液按一定比例混合，得到35%-50%的水解液培養(yǎng)基，探討以部分水解液作為底物的可行性。通過(guò)氨水調(diào)節(jié)pH，以P2培養(yǎng)基作對(duì)照，接種TSH06進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)束后測(cè)得各種產(chǎn)物的濃度及丁醇得率（表6），TSH06在P2培養(yǎng)基和各種稀釋水解液中，均能生長(zhǎng)發(fā)酵，并產(chǎn)生乙醇、丙酮、丁醇（圖2）。在相同糖濃度的P2發(fā)酵液中，糖幾乎完全被消耗，丁醇濃度達(dá)8.84 g/L，在35%-50%稀釋水解液中，糖均有10 g以上的剩余，丁醇產(chǎn)量有不同程度降低。在35%的水解液中（圖2-B），丁醇濃度為5.17 g/L，在40%-50%的水解液中，丁醇濃度為4.2 g/L左右（圖2-C，2-D，2-E），而水解液中乙醇與丙酮產(chǎn)量與P2培養(yǎng)基對(duì)照中的差別不大。到48 h，P2發(fā)酵液中丁醇達(dá)4 g/L左右，之后在72 h達(dá)到最大（圖2-A）。而在35%-45%的稀釋水解液中，48 h丁醇濃度也達(dá)4 g/L，之后略有升高，但變化不大；在50%的稀釋水解液中，48 h丁醇濃度為2.74 g/L，之后繼續(xù)升高，在72 h達(dá)到最大值4.22 g/L。

在P2發(fā)酵液中，乙酸和丁酸的濃度在發(fā)酵開(kāi)始后升高，48 h達(dá)到最高，乙酸、丁酸分別為1.61 g/L、1.44 g/L；到發(fā)酵結(jié)束，略有下降，乙酸、丁酸分別為1.40 g/L，1.26 g/L（圖2-A）。從生長(zhǎng)曲線看（圖 3），在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，P2培養(yǎng)基與稀釋水解液中TSH06的生長(zhǎng)情況差異不大，在24 h的稀釋水解液培養(yǎng)中沒(méi)有檢測(cè)糠醛和5-羥甲基糠醛（圖2），說(shuō)明稀釋后水解液中的少量糠醛和5-羥甲基并未抑制菌體本身的生長(zhǎng)。得到稀釋水解液TSH06生長(zhǎng)過(guò)程中所達(dá)到的最大的生物量均低于P2培養(yǎng)基中的水平，在菌株生長(zhǎng)進(jìn)入衰亡期后，水解液中TSH06的衰亡速率明顯快于P2培養(yǎng)基，至發(fā)酵結(jié)束，最終生物量也低于P2培養(yǎng)基中的水平。

表6 溶劑濃度、丁醇得率及有機(jī)酸濃度峰值

圖2 P2培養(yǎng)基及35%-50%水解液發(fā)酵生產(chǎn)丁醇

圖3 P2培養(yǎng)基及35%-50%水解液中TSH06生長(zhǎng)曲線

稀釋水解液中，乙酸起始濃度在1-2 g/L之間，之后隨著產(chǎn)酸期的進(jìn)行，乙酸濃度繼續(xù)升高，達(dá) 4 g/L左右，遠(yuǎn)高于P2中乙酸的濃度（圖 4）。在35%-45%的稀釋水解液中，48 h乙酸以及丁酸濃度幾乎達(dá)最大，之后略有波動(dòng)，變化不大。在50%的稀釋水解液中，48 h乙酸濃度為4.16 g/L，丁醇濃度2.45 g/L，之后乙酸濃度下降，丁醇濃度上升，到72 h，乙酸、丁醇濃度分別為3.86 g/L、4.22 g/L。發(fā)酵結(jié)束時(shí)，各稀釋水解液中乙酸濃度相似，為P2中乙酸濃度的2.34-2.58倍（圖4，圖5）。在稀釋水解液中，丁酸濃度在48 h達(dá)最大，之后略有降低，至發(fā)酵結(jié)束，仍較P2發(fā)酵液高42%-78%（圖5）。

圖4 不同培養(yǎng)基中乙酸濃度

圖5 發(fā)酵結(jié)束時(shí)不同培養(yǎng)基中丁醇濃度以及發(fā)酵過(guò)程中乙酸與丁酸濃度峰值

2.5 發(fā)酵過(guò)程中關(guān)鍵基因的轉(zhuǎn)錄情況

為了探討抑制物對(duì)關(guān)鍵酶基因表達(dá)的影響，通過(guò)real time PCR，檢測(cè)發(fā)酵代謝通路中，乙酸生成的關(guān)鍵酶磷酸乙酰轉(zhuǎn)移酶基因（pta）和乙酸激酶基因（ack）、丁酸生成的關(guān)鍵酶基因磷酸丁酰轉(zhuǎn)移酶基因（ptb）和丁酸激酶基因（buk）、酸返耗的關(guān)鍵酶CoA轉(zhuǎn)移酶基因（ctf）和3個(gè)丁醇生成的關(guān)鍵酶醇脫氫酶基因（adhE、bdhA和bdhB）的mRNA表達(dá)水平。選取以稀釋度最高的50%的稀釋水解液為研究對(duì)象，以P2培養(yǎng)基為對(duì)照，取24 h發(fā)酵液，進(jìn)行分析。結(jié)果（圖6）表明，丁酸生成途徑的關(guān)鍵酶基因buk和ptb的mRNA在水解液中水平分別為P2培養(yǎng)基的1.12和1.45倍；而在乙酸生成途徑中，pta和ack mRNA在水解液中為P2培養(yǎng)基的1.75和7.45倍；同時(shí)水解液中，丁酸、乙酸向丁酰輔酶A以及乙酰輔酶A轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵基因ctf mRNA只有P2培養(yǎng)基的0.21倍。而TSH06乙醇、丁醇生成途徑的adhE、bhdA、bdhB的mRNA水平分別是在P2培養(yǎng)基中的0.09、0.83及0.44倍。這些結(jié)果表明乙酸、丁酸合成途徑關(guān)鍵酶表達(dá)水平上升，而返耗途徑關(guān)鍵酶表達(dá)受到抑制，這種變化導(dǎo)致了乙酸、丁酸的積累。丁醇和乙醇生成途徑關(guān)鍵酶基因表達(dá)水平的下降，導(dǎo)致丁醇合成受阻，使得最終水解液中丁醇產(chǎn)量降低。

3 討論

本研究通過(guò)用用氨水或NaOH溶液調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中添加Na+會(huì)抑制TSH06的生長(zhǎng)，而用氨水調(diào)節(jié)pH可為菌株的生長(zhǎng)提供氮源，有利于菌株的生長(zhǎng)。

TSH06在體積比等于或低于50%的酸水解液，抑制物糠醛與5-羥甲基糠醛在接種24 h后可被TSH06代謝，菌株生長(zhǎng)并發(fā)酵產(chǎn)丁醇，最終丁醇產(chǎn)量只有P2培養(yǎng)基的一半左右，而乙酸濃度明顯高于P2發(fā)酵液。張杰［20］在以木質(zhì)纖維素為原料發(fā)酵生產(chǎn)丙酮丁醇的過(guò)程以及科學(xué)機(jī)理研究中說(shuō)明，丁醇的發(fā)酵分為產(chǎn)酸期和產(chǎn)溶劑期。產(chǎn)酸期主要產(chǎn)物是乙酸和丁酸，隨著酸的累積，pH下降，細(xì)胞代謝向產(chǎn)溶劑期轉(zhuǎn)化，產(chǎn)酸期形成的乙酸和丁酸在CoA轉(zhuǎn)移酶的作用下，分別生成乙酰CoA和丁酰CoA，又進(jìn)入代謝通路，參與溶劑的生成，因此，乙酸和丁酸有一個(gè)先升高再降低的過(guò)程。48 h之前，在P2發(fā)酵液和稀釋水解液中，乙酸都逐漸升高。P2發(fā)酵液的乙酸濃度維持在2 g/L以下；而在稀釋水解液中，乙酸的起始濃度為1.5-2 g/L，在此濃度下，TSH06可以生長(zhǎng)進(jìn)行丁醇發(fā)酵，但乙酸、丁酸的濃度也隨著升高，到48 h時(shí)，乙酸達(dá)最大為3.78-4.16 g/L以上，大于同類發(fā)酵中乙酸濃度的最高值。Lu等［21］的研究表明，拜氏梭菌在稀釋水解液發(fā)酵過(guò)程中乙酸初始濃度在2 g/L以上，最高濃度未超過(guò)2.9 g/L。而在48 h時(shí)，在35%-45%的水解液中，丁醇濃度也達(dá)最大，此時(shí)，盡管糖還有15 g/L左右，但也只產(chǎn)生少量或不再產(chǎn)丁醇，糖也只有少量消耗，發(fā)酵結(jié)束，糖濃度還有12 g/L以上。在水解液中，糠醛，5-羥甲基糠醛在24 h內(nèi)已經(jīng)被代謝消耗完全，不會(huì)抑制菌體生長(zhǎng)。Qureshi［22］研究發(fā)現(xiàn)，拜氏梭菌在未脫毒水解液發(fā)酵，乙酸初始濃度達(dá)到6.5 g/L，發(fā)酵過(guò)程中乙酸最高濃度13.3 g/L，菌體丙酮乙醇丁醇總量只有1.7 g/L，幾乎不發(fā)酵，說(shuō)明高的有機(jī)酸濃度，尤其是乙酸濃度可能使菌體受到抑制，發(fā)酵停止。

圖6 50%水解液以及P2培養(yǎng)基中TSH06關(guān)鍵基因轉(zhuǎn)錄水平的對(duì)比

由發(fā)酵結(jié)果可知，在50%稀釋水解液中，有機(jī)酸尤其是乙酸濃度較P2發(fā)酵液顯著提高，而丁醇產(chǎn)量明顯降低（圖3），故通過(guò)Real-time PCR，根據(jù)Lütke-Eversloh等［23］的研究表明，檢測(cè)發(fā)酵代謝通路中，乙酸生成的關(guān)鍵酶磷酸乙酰轉(zhuǎn)移酶基因（pta）和乙酸激酶基因（ack）、丁酸生成的關(guān)鍵酶基因磷酸丁酰轉(zhuǎn)移酶基因（ptb）和丁酸激酶基因（buk）、酸返耗的關(guān)鍵酶CoA轉(zhuǎn)移酶基因（ctf）和3個(gè)丁醇生成的關(guān)鍵酶醇脫氫酶基因（adhE、bdhA、bdhB）的mRNA表達(dá)水平。選取以稀釋度最高的50%的稀釋水解液為研究對(duì)象，以P2培養(yǎng)基為對(duì)照，取24 h發(fā)酵液，進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，生成乙酸與丁酸途徑的關(guān)鍵基因轉(zhuǎn)錄水平的提高，而返耗途徑的ctf基因轉(zhuǎn)錄水平的降低，是造成乙酸和丁酸的大量積累的原因。在水解液中，醇生成的關(guān)鍵酶基因表達(dá)受到影響，進(jìn)而會(huì)影響丁醇的產(chǎn)量。這些結(jié)果為T(mén)SH06在水解液發(fā)酵中大量產(chǎn)酸，阻滯丁醇發(fā)酵以及菌體生長(zhǎng)提供了分子生物學(xué)依據(jù)。

4 結(jié)論

利用含糖培養(yǎng)基對(duì)半纖維素水解液進(jìn)行稀釋，研究了抑制物對(duì)產(chǎn)丁醇共生體系TSH06生長(zhǎng)發(fā)酵的抑制作用，發(fā)現(xiàn)產(chǎn) TSH06在60%及以上稀釋度的水解液中不能生長(zhǎng)進(jìn)行丁醇發(fā)酵，合適的稀釋濃度為50%及以下。利用NaOH或氨水調(diào)節(jié)稀釋水解液的pH值，菌體的生長(zhǎng)存在差異，用NaOH調(diào)節(jié)pH值會(huì)抑制菌體的生長(zhǎng)，而利用氨水調(diào)節(jié)pH值有利于菌體生長(zhǎng)，且發(fā)酵丁醇。稀釋水解液中的糠醛和5-羥甲基糠醛不會(huì)對(duì)TSH06產(chǎn)生抑制作用。但是在水解液中生長(zhǎng)的產(chǎn)丁醇菌株TSH06相對(duì)于P2培養(yǎng)基有機(jī)酸生成途徑關(guān)鍵基因的轉(zhuǎn)錄水平明顯提高，有機(jī)酸返耗途徑以及丁醇生成途徑關(guān)鍵基因的轉(zhuǎn)錄水平明顯下降，而有機(jī)酸尤其是乙酸濃度對(duì)TSH06丁醇發(fā)酵有明顯的抑制作用。

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

Effects of Inhibitors in Corncob Hemicellulose Hydrolysate on Butanol Fermentation

GU Chun-kai1，2WANG Gen-yu2LIU Hong-juan2WANG Ge-hua2WU Jian-rong1ZHANG Jian-an2
（1. The Key Laboratory of Industrial Biotechnology（Ministry of Education），School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122；2. Institute of Nuclear and New Energy Technology，Tsinghua University，Beijing 100084）

Due to the toxicity of inhibitors in hemicellulose hydrolysate to microorganism，hemicellulose hydrolysate cannot be directly used as substrate for butanol fermentation. The effects of inhibitors to non-anaerobic butanol-producing symbiotic system TSH06 was studied，aiming at laying the foundation for the butanol fermentation using hydrolysate without detoxification. Hemicellulose hydrolysate of corncob diluted with P2 medium was used as substrate in butanol fermentation. The pH of culture media was adjusted to be neutral with NaOH and ammonia respectively. The inhibition effect of the hydrolysate on TSH06 was studied by qPCR with gene primes of key enzymes. Results showed that the existence of Na+inhibited the growth of TSH06. Furthermore，TSH06 grew and fermented in 50% or lower degrees of diluted hemicellulose hydrolysate，tolerated and degraded the furfural and 5-HMF，and the ultimate butanol concentration reached 4.16-5.16 g/L，lower than that in P2 medium（butanol concentration of 8.83 g/L）. In diluted hemicellulose hydrolysate，acetic acid concentration remained above 3.18 to 4.16 g/L after 48 h，much higher than that in P2 medium（＜2 g/L）. Compared with P2 medium，the transcription ratio of key genes in the organic acid production pathway rose significantly while TSH06 in the 50% hemicellulose hydrolysates and declined significantly in the organic acid reflux pathway and butanol production pathway. In conclusion，excessive acetic acid in the hemicellulose hydrolysate might damage cells and block the transition from acidogenesis phase to solventogenesis phase. As the accumulation of acid，bacterial cells tend to decline and death before the substrate is completely consumed，leading to the reduction of butanol production and the substrate is not fully utilized.

hemicellulose hydrolysate；inhibitor；butanol fermentation；metabolism related genes

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.07.026

2015-09-24

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（21176141），清華大學(xué)自主科研項(xiàng)目（2012THZ02289），國(guó)家能源局項(xiàng)目（20131448926）

顧春凱，男，碩士研究生，研究方向：微生物發(fā)酵；E-mail：guchunkai314@163.com

張建安，男，博士，研究方向：生物化工；E-mail：zhangja@tsinghua.edu.cn

吳劍榮，男，博士，研究方向：生化工程；E-mail：kinowu76@163.com