周忠光　費洪新

(黑龍江中醫(yī)藥大學，黑龍江　哈爾濱　150040)

補陽還五湯對阿爾茨海默病小鼠海馬晚期糖基化終產(chǎn)物受體的影響

周忠光費洪新1

(黑龍江中醫(yī)藥大學，黑龍江哈爾濱150040)

〔摘要〕目的探討補陽還五湯(BYHWD)對阿爾茨海默病(AD)小鼠海馬晚期糖基化終產(chǎn)物受體(RAGE)的影響。方法選用30只APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠，隨機分成模型組，治療組(多奈哌齊0.001 g/kg)，BYHWD高、中、低劑量組(BYHWD 37.06、18.53、9.26 g/kg)，另選6只C57BL/16J小鼠分為對照組，各組連續(xù)治療35 d后取材。采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定海馬APP、Aβ1～42、Aβ1～40和血清Aβ1～40水平，采用HE染色和尼氏染色觀察各組小鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元組織形態(tài)病理改變，采用免疫組化檢測海馬RAGE表達，采用RT-PCR和Western印跡檢測海馬RAGE、VCAM和ICAM-1 基因和蛋白表達。結(jié)果與模型組比較，BYHWD高、中劑量組可明顯改善海馬形態(tài)結(jié)構(gòu)，明顯降低海馬APP、Aβ1～42和Aβ1～40水平，明顯升高血清Aβ1～40水平(P<0.05)，明顯降低海馬RAGE、VCAM和ICAM-1 基因和蛋白表達 (P<0.05)。結(jié)論BYHWD通過抑制RAGE表達來改善AD小鼠海馬的形態(tài)結(jié)構(gòu)。

〔關(guān)鍵詞〕補陽還五湯；阿爾茨海默病

阿爾茨海默病(AD)發(fā)病與β淀粉樣蛋白(Aβ)沉積〔1〕和血腦屏障(BBB)功能異?！?〕等有關(guān)。Aβ來源于β淀粉樣前體蛋白(APP)，毛細血管內(nèi)皮細胞上存在晚期糖基化終產(chǎn)物受體(RAGE)〔3〕，RAGE 與Aβ結(jié)合，介導Aβ轉(zhuǎn)運進入腦組織〔4,5〕。在AD中，RAGE與血管內(nèi)皮黏附因子(VCAM)和細胞間黏附因子(ICAM)-1表達相關(guān)〔6,7〕，使用RAGE抑制劑后VCAM表達下調(diào)〔8〕。本課題前期工作顯示，補陽還五湯(BYHWD)可改善AD小鼠學習記憶〔9,10〕，減少海馬細胞凋亡〔11〕，改善海馬結(jié)構(gòu)〔12〕，降低BBB通透性〔13〕，下調(diào)海馬核因子(NF)-κBp65表達〔14〕等，但是BYHWD對AD轉(zhuǎn)基因小鼠RAGE的研究國內(nèi)外尚無文獻報道?；诖?，本研究探討B(tài)YHWD對APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠海馬RAGE基因和蛋白的影響。

1材料和方法

1.1實驗動物7月齡雄性清潔級APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠30只(哈爾濱醫(yī)科大學吳樹亮教授贈送)，體重(23±2)g；野生型C57BL/6J小鼠6只(北京維通利華實驗動物技術(shù)公司)，動物生產(chǎn)合格證號：SCXK(京)2012-0001。小鼠按照清潔級標準常規(guī)飼養(yǎng)于黑龍江中醫(yī)藥大學實驗動物中心。

1.2試劑和藥品RAGE(Boster，ba-1789)；β-actin(Santa Cruz Biotechnology，sc-47778)；APP、Aβ1～42和Aβ1～40酶聯(lián)免疫試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號20140401)；VCAM和ICAM-1 (Santa Cruz Biotechnology)；RNeasy@Mini Kit(美國QIAGEN公司)；鹽酸多奈哌齊片(中國重慶植恩藥業(yè)有限公司)；BYHWD包括黃芪120 g(131109)、當歸尾6 g(131001)、赤芍4.5 g (121003)、川芎3 g(20140501)、地龍3 g(121002)、桃仁3 g(20140401)和紅花3 g(130901)，均購買于黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院，由本校實驗中心田明教授制備成干粉，-80℃冰箱中保存。

1.3主要儀器Applied Biosystems step one plus定量PCR儀(美國應用生物系統(tǒng)公司)；-80℃冰箱(日本SANYO公司)；CM1900型冰凍切片機(德國Leica公司)；BMJ-B型包埋機(常州市中威電子儀器有限公司)；E600型尼康顯微鏡(日本尼康公司)；HHS型水浴鍋(鞏義市予華儀器有限責任公司)；6100型RT-雷杜酶標儀(美國RT公司)等。

1.4方法

1.4.1基因鑒定實驗剪取APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠的鼠尾0.5 cm，設計APP基因和PS1基因引物。APP：正義引物：5′-GAC TGA CCA CTC GAC CAG GTT CTG-3′，反義引物：5′-CTT GTA AGT TGG ATT CTC ATA TCC G-3′；PS1：正義引物：5′-AAT AGA GAA CGG CAG GAG CA-3′，反義引物：5′-GCC ATG AGG GCA CTA ATC AT-3′，按照試劑盒說明書操作，采用PCR法獲得電泳圖并拍照。

1.4.2分組與給藥30只APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠隨機分為模型組(予生理鹽水)，治療組(多奈哌齊0.001 g/kg)，BYHWD高、中、低劑量組(37.06、18.53、9.26 g/kg)，每組6只。6只野生型C57BL/6J小鼠為對照組(予生理鹽水)，各組小鼠持續(xù)灌胃給藥35 d。

1.4.3ELISA方法實驗結(jié)束后，各組小鼠眼球采血，勻漿，靜置；另取海馬，勻漿，靜置，將血清和海馬勻漿液4 000 r/min離心15 min，取上清液，分裝，-80℃保存。在酶標儀上450 nm波長處測定吸光度(A)，繪制標準曲線，求得海馬APP、Aβ1～42、Aβ1～40和血清Aβ1～40。

1.4.4蘇木素-伊紅(HE)染色實驗結(jié)束后，小鼠水合氯醛麻醉，左心室灌注100 ml生理鹽水，然后用4%多聚甲醛緩慢勻速灌注，腦固定于4%多聚甲醛中，石蠟包埋，制備石蠟切片，經(jīng)過常規(guī)HE染色過程，光學顯微鏡觀察海馬CA1區(qū)結(jié)構(gòu)。

1.4.5尼氏體染色實驗結(jié)束后，小鼠麻醉，左心室灌注100 ml生理鹽水，4%多聚甲醛灌注100 ml，取腦放于4%多聚甲醛中，石蠟包埋，制備石蠟切片，經(jīng)過二甲苯脫蠟處理，下行梯度乙醇脫水，1%焦油紫染色，上行梯度乙醇脫水，二甲苯處理，中性樹膠封片，用E600型尼康顯微鏡觀察小鼠海馬CA1區(qū)。

1.4.6免疫組織化學采用SP法開始實驗，石蠟切片脫蠟、H2O2處理、滴加一抗和二抗、DAB顯色、蘇木精復染、脫水、透明、封片等過程。400倍顯微鏡計數(shù)棕色細胞的陽性目標數(shù)，采用HMIAS高清晰度彩色醫(yī)學圖文系統(tǒng)分析。

1.4.7實時定量PCR實驗結(jié)束后，取材小鼠腦海馬，按照Trizol試劑盒方法提取海馬總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，PCR擴增。設計引物：RAGE：正義：5′-AAA ACG ACA ACC CAG GCG T-3′，反義：5′-ATT CTC TGG CAT CTC CGC TTC-3′；VCAM：正義：5′-TGT GAA GAT GGT CGC GAT CTT-3′，反義：5′-CAA TCT GAG CGA GCG TTT TGT-3′；ICAM-1：正義：5′-ACC ACG GAG CCA ATT TCT CAT-3′，反義：5′-AAG ATC GAA AGT CCG GAG CTG-3′；β-actin：正義：5′-CGT GCG TGA CAT CAA AGA GAA-3′，反義：5′-AAC CGC TCG TTG CCA ATA GT-3′。引物由中國上海捷瑞生物工程有限公司合成，設置PCR參數(shù)：50℃ 2 min，95℃ 10 min，95℃ 15 s，60℃ 1 min，40個循環(huán)，分析實驗數(shù)據(jù)，采用2-ΔΔCt法計算RAGE、VCAM和ICAM-1 mRNA。

1.4.8Western印跡實驗結(jié)束后，取小鼠海馬，按照Western印跡說明書操作，加裂解液，勻漿，4℃ 12 000 r/min離心10 min，測定蛋白濃度，100℃變性5 min，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，加一抗、二抗，以目的蛋白灰度值/β-actin灰度值評價RAGE、VCAM和ICAM-1表達。

1.5統(tǒng)計學分析采用SPSS19.0軟件行單因素方差分析。

2結(jié)果

2.1基因鑒定APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠可檢測到APP基因與PS1基因同時表達；野生型C57BL/6J小鼠未檢測到APP基因與PS1基因同時表達。見圖1。

M：分子量Marker；2、4、5、7為APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠；1、3、6為野生型C57BL/6J小鼠圖1　APP與PS1基因電泳圖(PCR法)

2.2ELISA檢測與對照組比較，模型組小鼠海馬APP、Aβ1～42和Aβ1～40明顯增加且血清Aβ1～40明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，治療組及BYHWD高、中劑量組小鼠海馬APP、Aβ1～42和Aβ1～40明顯降低且血清Aβ1～40明顯升高(P<0.05)，而低劑量組小鼠海馬APP、Aβ1～42、Aβ1～40和血清Aβ1～40改變不明顯(P>0.05)。見表1。

表1　海馬APP、Aβ1～42、Aβ1～40和血清Aβ1～40

與對照組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05；下表同

2.3HE染色對照組小鼠海馬CA1區(qū)錐體細胞呈多邊形，3～5層、細胞較大，染色均勻；模型組小鼠海馬CA1區(qū)錐體細胞數(shù)量較少，2～3層，分散排列；治療組、高劑量組和中劑量組小鼠海馬CA1區(qū)錐體細胞數(shù)量較多，3～4層，排列比較緊密，細胞核清晰；低劑量組海馬CA1區(qū)錐體細胞較小，染色淺，2～3層。見圖2、圖3。

2.4尼氏體染色對照組小鼠海馬CA1區(qū)錐體細胞尼氏體豐富，染色深；模型組小鼠海馬CA1區(qū)錐體細胞尼氏體染色淺，尼氏體數(shù)量較少；治療組，BYHWD高、中、低劑量組小鼠海馬CA1區(qū)錐體細胞尼氏體豐富，染色較深。見圖4、圖5。

2.5免疫組織化學檢測RAGE主要表達于小鼠海馬神經(jīng)元細胞膜和細胞質(zhì)內(nèi)。與對照組〔(16.83±2.23)個〕比較，模型組海馬RAGE〔(35.33±4.46)個〕陽性目標數(shù)明顯增加(P<0.05)；與模型組〔(35.33±4.46)個〕比較，治療組〔(24.50±4.18)個〕、高劑量組〔(23.17±4.07)個〕、中劑量組〔(17.33±3.50)個〕海馬RAGE陽性目標數(shù)明顯降低(P<0.05)，而低劑量組(31.83±2.14)個海馬RAGE陽性目標數(shù)改變不明顯(P>0.05)。見圖6、圖7。

2.6實時定量PCR測定與對照組比較，模型組海馬RAGE、VCAM和ICAM-1 mRNA明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，治療組、高劑量組和中劑量組海馬RAGE、VCAM和ICAM-1 mRNA明顯降低(P<0.05)，而低劑量組海馬RAGE、VCAM和ICAM-1 mRNA改變不明顯(P>0.05)。見表2。

圖2　海馬CA1區(qū) (HE，×100)

圖3　海馬CA1區(qū) (HE，×400)

圖4　海馬CA1區(qū) (尼氏體染色，×100)

圖5　海馬CAI區(qū)(尼氏體染色，×400)

圖6　海馬RAGE表達 (免疫組化染色，×100)

圖7　海馬RAGE表達(免疫組化染色，×400)

組別RAGEVCAMICAM-1對照組1.01±0.151.02±0.241.07±0.44模型組1.69±0.211)2.10±0.411)2.21±0.621)治療組1.05±0.192)1.22±0.442)1.26±0.512)高劑量組1.17±0.462)1.34±0.312)1.37±0.552)中劑量組1.07±0.262)1.60±0.372)1.50±0.532)低劑量組1.51±0.261.81±0.381.89±0.30

2.7Western印跡測定RAGE、VCAM和ICAM-1蛋白表達與對照組比較，模型組海馬RAGE、VCAM和ICAM-1明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，治療組、高劑量組和中劑量組海馬RAGE、VCAM和ICAM-1明顯降低(P<0.05)，而低劑量組海馬RAGE、VCAM和ICAM-1改變不明顯(P>0.05)。見表3，圖8。

表3　RAGE、VCAM和ICAM-1蛋白表達

1.對照組；2.模型組；3.治療組；4.高劑量組；5.中劑量組；6.低劑量組圖8　RAGE、VCAM和ICAM-1表達

3討論

AD病變主要集中在海馬、皮質(zhì)等〔15〕，海馬CA1區(qū)與學習記憶關(guān)聯(lián)較大〔16〕。本實驗模型組小鼠海馬CA1區(qū)尼氏體數(shù)量減少，說明蛋白質(zhì)合成功能減弱，模型穩(wěn)定。經(jīng)過治療后，BYHWD高、中劑量組海馬結(jié)構(gòu)逐漸恢復，說明BYHWD可改善AD小鼠海馬結(jié)構(gòu)。

Aβ主要分為Aβ1～42和Aβ1～40，Aβ1～42形成老年斑(SP)，Aβ1～40可經(jīng)過BBB轉(zhuǎn)運進入腦組織，加重AD。本實驗顯示模型組海馬Aβ1～40增加，而血清Aβ1～40降低，說明Aβ1～40經(jīng)過某種機制進入了腦組織，加重AD。治療后，海馬Aβ1～40降低且血清Aβ1～40增加，說明BYHWD可通過某種機制將腦海馬Aβ1～40外排進入血液中，減緩AD的發(fā)生發(fā)展。

為了進一步明確海馬Aβ1～40與血清Aβ1～40的關(guān)系，本實驗測定了RAGE、VCAM和ICAM-1基因和蛋白的表達。結(jié)果顯示，模型組RAGE、VCAM和ICAM-1基因和蛋白表達上調(diào)，RAGE-Aβ1～40復合體增加，加速Aβ1～40進入腦組織，促進了Aβ1～42的成熟，增加SP的形成。經(jīng)過治療后，RAGE、VCAM和ICAM-1基因和蛋白表達下調(diào)，RAGE-Aβ1～40復合體減少，減少Aβ1～40進入腦組織，減緩Aβ1～42成熟，從而減緩AD發(fā)生發(fā)展。

本實驗顯示海馬RAGE的變化趨勢與海馬Aβ1～40及血清Aβ1～40變化趨勢密切相關(guān)。經(jīng)過BYHWD治療后，出現(xiàn)降低海馬Aβ1～40、增加血清Aβ1～40和改善海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)等現(xiàn)象，說明BYHWD可通過影響RAGE及下游蛋白表達來改善海馬Aβ1～40的含量及其海馬形態(tài)結(jié)構(gòu)。

4參考文獻

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〔2015-08-12修回〕

(編輯袁左鳴)

The effects of Buyang Huanwu decoction on advanced glycation end product receptor of hippocampus in Alzheimer′s disease mice

ZHOU Zhong-Guang，F(xiàn)EI Hong-Xin.

Heilongjiang University of Chinese Medicine，Harbin 150040，Heilongjiang，China

【Abstract】ObjectiveTo explore the effects of Buyang Huanwu decoction(BYHWD) on advanced glycation end product receptor(RAGE) of hippocampus in Alzheimer′s disease(AD) mice.MethodsThe APP/PS1 transgenic mice were randomly divided into control，model，treatment (Donepezil 0.001 g/kg)，BYHWD high-dose (37.06 g/kg)，BYHWD medial-dose (18.53 g/kg), BYHWD low-dose groups (9.26 g/kg).The levels of APP, Aβ1～42and Aβ1～40in the hippocampus and Aβ1～40in the serum were measured by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). HE staining and Nissl′s staining were used to observe pathological changes of morphology in mice hippocampus CA1 area. Immunohistochemistry was used to detect the protein expression of RAGE in the hippocampus. The content levels of RAGE mRNA and RAGE protein in the hippocampus were determined by RT-PCR and Western bolt.ResultsCompared with those of model group，the expressions of APP, Aβ1～42and Aβ1～40in the hippocampus were significantly decreased in BYHWD high-dose and BYHWD medial-dose groups(P<0.05)，the expressions of Aβ1～40in the serum were significantly increased(P<0.05). BYHWD high-dose and medial-dose maintained brain normal morphological structure of nerve cells, and the expressions of RAGE, VCAM and ICAM-1 genes and protein expressions were decreased significantly compared with those of AD model group(P<0.05).ConclusionsBYHWD could maintain normal morphological structure of nerve cells of AD mice. BYHWD plays a certain role in the treatment of AD through inhibiting RAGE.

【Key words】Buyang Huanwu decoction；Alzheimer′s disease

基金項目：國家自然科學基金項目(No.81373777，81173599)；高校博士學科點科研基金 (博導類，20132327110010)

通訊作者：費洪新(1978-)，男，講師，博士，博士后，主要從事癡呆、痛風、腫瘤研究。

〔中圖分類號〕R285

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)11-2593-05；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.11.011

1齊齊哈爾醫(yī)學院

第一作者：周忠光(1957-)，男，博士，教授，博士生導師，主要從事癡呆、痛風、腫瘤研究。