寶東艷　胡真真　李　芳　羅　啟　崔　紅　張　琳

(錦州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，遼寧　錦州　121001)

葛根素對(duì)卡那霉素耳中毒小鼠耳蝸核因子-κB p50活性的影響

寶東艷胡真真李芳羅啟崔紅張琳

(錦州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，遼寧錦州121001)

〔摘要〕目的觀察葛根素對(duì)卡那霉素(KM)耳中毒小鼠耳蝸核因子(NF)-κB p50活性的影響，探討葛根素對(duì)KM耳毒性發(fā)揮防護(hù)作用的機(jī)制。方法BALB/c小鼠隨機(jī)分成四組：正常對(duì)照組，KM組，KM+葛根素組，葛根素組，各組小鼠于用藥前及停藥后分別測(cè)試聽腦干反應(yīng)(ABR)以進(jìn)行正常BALB/c小鼠的篩選及聽力損傷后聽閾的測(cè)定。停藥后測(cè)試完ABR通過Western印跡檢測(cè)各組NF-κB p50的表達(dá)水平。結(jié)果KM組連續(xù)用藥14 d后，不同頻率的ABR閾值和NF-κB p50的表達(dá)水平明顯提高，而且與正常對(duì)照組比較差異顯著(P<0.01)；KM+葛根素組雖然用藥后不同頻率的ABR閾值和NF-κB p50的表達(dá)水平也比正常對(duì)照組高，但較KM組明顯降低；正常對(duì)照組和葛根素組在整個(gè)用藥期間不同頻率的ABR閾值和NF-κB p50的表達(dá)水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論NF-κB p50參與了KM的耳毒性，葛根素通過下調(diào)NF-κB p50進(jìn)而拮抗了KM的耳毒性。

〔關(guān)鍵詞〕葛根素；卡那霉素；耳蝸；核因子(NF)-κB

卡那霉素(KM)有很強(qiáng)的耳毒性，所以目前KM的應(yīng)用受到一定的限制，用藥物有效拮抗KM的耳毒性越來越為人們所重視。葛根素為葛根中提取的一種異黃酮類化合物。已有報(bào)道通過體外培養(yǎng)的方法發(fā)現(xiàn)，葛根素對(duì)KM培養(yǎng)后的小鼠毛細(xì)胞的損傷有明顯拮抗效應(yīng)〔1〕。也有報(bào)道稱，葛根素注射液對(duì)慶大霉素所致的大鼠耳蝸毒性有防護(hù)作用〔2〕。葛根素對(duì)在體小鼠應(yīng)用KM產(chǎn)生的耳毒性中的作用與核因子(NF)-κB的關(guān)系還鮮見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過制備KM耳中毒模型，結(jié)合聽腦干反應(yīng)觀察葛根素對(duì)KM耳中毒的拮抗作用，同時(shí)應(yīng)用蛋白質(zhì)印跡技術(shù)探討葛根素發(fā)揮作用是否與NF-κB有關(guān)。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物BALB/c小鼠40只，雄性，4周齡，體重25～30 g，耳廓反應(yīng)靈敏，由大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SYXK(遼)2004-0029。

1.2主要試劑和儀器硫酸卡那霉素粉劑購(gòu)自美國(guó)Ameresco公司。該粉劑用生理鹽水溶解，根據(jù)動(dòng)物數(shù)量和體重每日新鮮配制使用。葛根素注射液購(gòu)自康普藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)H20043980。兔抗NF-κB p50多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司，β-actin購(gòu)自博士德生物工程有限公司。Smart EP&OAE聽覺誘發(fā)電位-耳聲發(fā)射記錄系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)智聽公司。

1.3方法

1.3.1實(shí)驗(yàn)分組及小鼠耳毒模型的制備BALB/c小鼠隨機(jī)分成四組：KM組：皮下注射新鮮配制KM 750 mg/kg，2次/d；KM+葛根素組：皮下注射KM 750 mg/kg，2次/d，同時(shí)每日腹腔注射葛根素200 mg/kg；葛根素組：每日腹腔注射葛根素200 mg/kg；正常對(duì)照組：每日腹腔注射等量生理鹽水。各組動(dòng)物均連續(xù)注射2 w，用藥期間每天監(jiān)測(cè)體重以調(diào)整藥量。

1.3.2ABR測(cè)試各組小鼠于用藥前及停藥后分別測(cè)試ABR。小鼠用1%戊巴比妥鈉100 mg/kg經(jīng)腹腔麻醉后，將電極的正極置于小鼠顱頂正中皮下，負(fù)極置于給聲側(cè)耳廓后下，接地電極置于對(duì)側(cè)耳廓后下，操作在隔音屏蔽室內(nèi)進(jìn)行并注意動(dòng)物保溫。應(yīng)用Smart EP&OAE聽覺誘發(fā)電位一耳聲發(fā)射記錄系統(tǒng)給予短純音刺激，選取8 kHz、12 kHz、24 kHz 3個(gè)頻率分別進(jìn)行測(cè)試并記錄ABR閾值(聽閾)，重復(fù)率39.1次/秒，帶通濾波100～3 000 Hz，疊加1 024次，掃描時(shí)程16.0 ms。聲刺激強(qiáng)度從95 dB開始，以5 dB逐次遞減，聽閾判定以剛出現(xiàn)ABRⅠ波為準(zhǔn)并至少重復(fù)2次。測(cè)試在隔音屏蔽室內(nèi)進(jìn)行。用藥前及停藥后分別測(cè)試ABR以進(jìn)行正常BALB/c小鼠的篩選及聽力損傷后聽閾的測(cè)定。

1.3.3Western印跡停藥后測(cè)試完ABR后，立即斷頭處死，速取聽泡，充分暴露耳蝸后，取小鼠耳蝸組織，置于液氮中，冷凍后放入-80℃冰箱備用。每組取3只小鼠的耳蝸，剪碎，PBS洗3遍，每份加入含PMSF 1 mmol/L的RIPA裂解液后勻漿，以上步驟在冰上操作。將勻漿液倒入離心管中，4℃，離心5 min后取上清，加入5倍上樣緩沖液后，離心，渦旋，95℃變性5 min。將處理好的樣品用SDS聚丙烯凝膠電泳分離，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。5%脫脂奶粉封閉1h，分別加入NF-κB p50 (1∶300)，β-actin一抗，4℃孵育過夜，分別加入二抗，室溫?fù)u床上孵育90 min，ECL法發(fā)光顯影。顯影的結(jié)果經(jīng)GE Image Quent 350 電泳凝膠成像分析系統(tǒng)掃描后，用Image進(jìn)行光密度分析，密度分析結(jié)果經(jīng)內(nèi)參蛋白矯正。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2結(jié)果

2.1ABR測(cè)試KM組連續(xù)用藥14 d后，不同頻率的ABR閾值明顯提高，而且與正常對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；KM+葛根素組雖然用藥后不同頻率的ABR閾值也比正常對(duì)照組高，但較KM組明顯降低；正常對(duì)照組和葛根素組在整個(gè)用藥期間不同頻率的ABR閾值無明顯變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

2.2Western印跡NF-κB p50蛋白的表達(dá)圖1可見，KM組(1.43±0.14)與正常對(duì)照組(0.84±0.11)比較，NF-κB p50的表達(dá)水平明顯升高。KM+葛根素組(0.97±0.15)與正常對(duì)照組比較NF-κB p50的表達(dá)水平升高，但較KM組低。葛根素組(0.81±0.13)和正常對(duì)照組差異不顯著。

表1　不同頻率的腦干聽覺閾值

與給藥前比較：1)P<0.01；與KM組比較：2)P<0.01

1：正常對(duì)照組；2：KM組；3：KM+葛根素組；4：葛根素組圖1　NF-κB p50蛋白在各組的表達(dá)

3討論

KM等氨基甙類抗生素(AmAn)耳中毒后可引起耳蝸結(jié)構(gòu)的破壞，具有損害內(nèi)耳的副作用，目前對(duì)這類抗生素所引起的耳聾尚無較好的防治辦法。

NF-κB的活化調(diào)節(jié)著凋亡及對(duì)炎性刺激和氧化應(yīng)激的反應(yīng)。NF-κB的過度表達(dá)可能導(dǎo)致變態(tài)反應(yīng)性疾病，血管疾病，缺血再灌注性神經(jīng)損傷等。在內(nèi)耳中，NF-κB的作用還沒有完全清楚，因?yàn)镹F-κB的活化可能對(duì)細(xì)胞有保護(hù)作用或者毒性作用〔3〕。一方面，Jiang等〔4〕報(bào)道NF-κB的活化對(duì)KM誘導(dǎo)的聽力損傷有保護(hù)作用。2004年就有人提出內(nèi)耳毛細(xì)胞發(fā)揮正常功能需要NF-κB〔5〕。另一方面，耳毒性刺激，例如噪聲或耳毒性藥物都能誘導(dǎo)NF-κB的活化，導(dǎo)致耳蝸側(cè)壁產(chǎn)生很多ROS，從而造成聽力損傷〔6，7〕。NO活化NF-κB，Caspase-1，進(jìn)而產(chǎn)生ROS，造成聽力損傷；茶多酚的主要成分(EGCG)則通過抑制NF-κB和Caspase，保護(hù)了聽力〔8〕。順鉑誘導(dǎo)促炎因子的產(chǎn)生，通過上調(diào)NF-κB的活性產(chǎn)生耳毒性〔9〕。順鉑能活化NF-κB，進(jìn)而介導(dǎo)了順鉑誘導(dǎo)的聽覺細(xì)胞的凋亡，而同時(shí)應(yīng)用NF-κB抑制劑后減弱了順鉑誘導(dǎo)的凋亡〔10〕。由上可知，NF-κB在聽力中的作用還有爭(zhēng)議。本實(shí)驗(yàn)通過檢測(cè)聽功能及NF-κB p50水平發(fā)現(xiàn)，聽功能下降的同時(shí)NF-κB p50的表達(dá)增多，提示NF-κB p50 表達(dá)增多能損傷聽力，與Kim等〔8〕的報(bào)道一致。

本實(shí)驗(yàn)室的前期工作表明〔11，12〕，正常豚鼠耳蝸多種細(xì)胞的胞質(zhì)中存在NF-κB p65和p50，注射慶大霉素后，NF-κB被誘導(dǎo)激活，進(jìn)而造成聽力損害，丹參通過顯著抑制KM所致NF-κB的高活性，從而有效拮抗KM的耳毒性。本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)KM造成了聽力損傷，可能通過活化NF-κB p50進(jìn)而損傷了聽力。

葛根素為葛根中提取的一種異黃酮類化合物，對(duì)突發(fā)性耳聾有明顯的療效，能有效地?cái)U(kuò)張血管，促進(jìn)內(nèi)耳的微循環(huán)〔13〕。通過體外培養(yǎng)的方法發(fā)現(xiàn)，葛根素對(duì)KM培養(yǎng)后的小鼠毛細(xì)胞的損傷有明顯拮抗效應(yīng)〔1〕。另外葛根素注射液對(duì)慶大霉素所致的大鼠耳蝸毒性有防護(hù)作用〔2〕。劉衛(wèi)紅等〔14〕研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)耳后注射葛根素注射液聯(lián)合聲頻共振對(duì)早期老年性聾有較好治療作用，并能延緩老年性聾，對(duì)耳鳴也有很好療效。本實(shí)驗(yàn)證明了葛根素對(duì)KM耳毒性的拮抗作用。

本實(shí)驗(yàn)推測(cè)應(yīng)用KM后，NF-κB p50活化，進(jìn)而產(chǎn)生了ROS，誘導(dǎo)了毛細(xì)胞的凋亡，聽功能下降，而葛根素通過抑制NF-κB p50，抑制了毛細(xì)胞的凋亡，進(jìn)而保護(hù)了毛細(xì)胞，聽功能較KM組有所改善。葛根素對(duì)KM耳毒性的拮抗作用可能有很多因子參與其中，NF-κB p50 只是其中一個(gè)，葛根素發(fā)揮作用的具體機(jī)制需要進(jìn)一步探討。

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〔2014-12-31修回〕

(編輯苑云杰/曹夢(mèng)園)

基金項(xiàng)目：2014年度遼寧省科技廳自然科學(xué)基金(2014022026)；2013年遼寧省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(201310160015)；遼寧醫(yī)學(xué)院校長(zhǎng)基金項(xiàng)目-奧鴻博澤基金-大學(xué)生創(chuàng)新課題(2013D21)

〔中圖分類號(hào)〕R764.5

〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A

〔文章編號(hào)〕1005-9202(2016)11-2574-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.11.003

第一作者：寶東艷(1980-)，女，在讀博士，講師，主要從事聽覺生理研究。