袁新榮，左強(qiáng)強(qiáng)，馮琴，潘澤民（.克拉瑪依市第二人民醫(yī)院 檢驗(yàn)科，新疆 克拉瑪依 834007；2.石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院 生物化學(xué)教研室，新疆 石河子832002）

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HS3ST2基因啟動(dòng)子甲基化與新疆維吾爾族婦女子宮頸癌的相關(guān)性

袁新榮1，左強(qiáng)強(qiáng)1，馮琴1，潘澤民2Δ
（1.克拉瑪依市第二人民醫(yī)院 檢驗(yàn)科，新疆 克拉瑪依 834007；2.石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院 生物化學(xué)教研室，新疆 石河子832002）

摘要：目的 探討HS3ST2基因啟動(dòng)子甲基化與新疆維吾爾族婦女子宮頸癌的相關(guān)性以及早期診斷的可行性.分析HS3ST2基因甲基化對(duì)mRNA表達(dá)的影響。方法 采用甲基化特異性PCR方法和HPV16，HPV18特異的PCR方法分別檢測(cè)了40例正常子宮頸組織，40例新疆維吾爾族婦女子宮頸癌組織的HS3ST2基因啟動(dòng)子甲基化情況和高危險(xiǎn)性HPV的感染情況。用RT-PCR方法檢測(cè)了10例甲基化陽(yáng)性和10例甲基化陰性的組織HS3ST2基因的mRNA表達(dá)情況。結(jié)果 37例宮頸癌組織，發(fā)生HS3ST2基因啟動(dòng)子甲基化，正常組織沒(méi)有發(fā)生甲基化，相應(yīng)的高危險(xiǎn)性HPV（HPV16，HPV18）的感染例數(shù)分別為27、5例.40例宮頸癌組織，在10例甲基化陽(yáng)性的組織中HS3ST2基因mRNA的表達(dá)水平明顯低于10例甲基化陰性的組織。結(jié)論 HS3ST2基因啟動(dòng)子甲基化可能是維吾爾族宮頸癌發(fā)生關(guān)鍵分子標(biāo)志，具有大規(guī)模臨床試驗(yàn)和早期子宮頸癌篩查的臨床應(yīng)用潛力。

關(guān)鍵詞：HS3ST2基因；新疆維吾爾族婦女；基因啟動(dòng)子甲基化；HPV；子宮頸癌

宮頸癌是女性常見(jiàn)腫瘤，是全球范圍內(nèi)導(dǎo)致女性死亡的重要疾病，并且有年輕化趨勢(shì)。人類(lèi)乳頭狀瘤病毒（HPV）感染與宮頸癌高度相關(guān)，被認(rèn)為是必要條件，已用其進(jìn)行子宮頸癌篩查，但是其特異性尤其是對(duì)于年輕女性的篩查相對(duì)較低。當(dāng)前，大量的科學(xué)報(bào)道發(fā)現(xiàn)，抑癌基因啟動(dòng)子甲基化可能在宮頸癌的發(fā)生中起了重要作用［1、2］。 硫酸乙酰肝素3-O-磺基轉(zhuǎn)移酶2基因（heparan sulfate 3-O-sulfotransferase 2，HS3ST2）是新近發(fā)現(xiàn)的一個(gè)抑癌基因，在細(xì)胞的機(jī)械支持、粘附、運(yùn)動(dòng)、增殖、分化和形態(tài)形成中起重要作用［3］。近來(lái)研究顯示，HS3ST2基因啟動(dòng)子CpG島甲基化率在多種腫瘤中處于很高的狀態(tài)［4，5］，具有作為早期診斷宮頸癌分子標(biāo)志物的潛力。但是HS3ST2 基因在宮頸癌中的作用機(jī)制尚不清楚，因此，本文分析HS3ST2基因啟動(dòng)子甲基化，HPV16，HPV18（High-risk HPV，hr-HPV）感染和HS3ST2 mRNA表達(dá)的關(guān)系，以進(jìn)一步認(rèn)識(shí)其作用機(jī)制。

1　材料與方法

1.1研究對(duì)象

所有標(biāo)本來(lái)自2009-2012年期間新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)院，石河子大學(xué)附屬醫(yī)院及克拉瑪依市第二人民醫(yī)院未經(jīng)過(guò)化療和放療的維吾爾族婦女宮頸手術(shù)切除的新鮮組織標(biāo)本和活檢新鮮組織標(biāo)本，所有取材均取得患者同意。

1.2DNA的提取

用SK1252基因組DNA抽提試劑盒（上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司）提取組織DNA。步驟按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3DNA的亞硫酸氫鹽修飾

參照CpGenomeTM DNA Modification Kit S7820試劑盒（美國(guó)Chemicon公司）手冊(cè)說(shuō)明對(duì)DNA進(jìn)行亞硫酸氫鹽處理修飾并純化，修飾后的DNA置-80℃保存。

1.4甲基化特異性PCR

甲基化和非甲基化正向和反向引物序列參照文獻(xiàn)，使用 Bio-Rad 梯度PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，康為世紀(jì)PCR反應(yīng)Mix，反應(yīng)條件：先95℃×5 min，再94℃×1 min，58℃×1 min，72℃×1min，共34個(gè)循環(huán)，最后72℃ 延伸 10 min。最后使用2％的瓊脂糖凝膠電泳分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.5RNA的提取

取出-80℃保存的子宮頸甲基化陽(yáng)性和陰性的組織各10例，每例樣本取30mg，使用液氮在研缽中研成粉末，用Trizol法提取 RNA。

1.6RT-PCR

將提取的 RNA使用reverse transcriptase（Fermentas，Hanover，MD，USA）試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。反應(yīng)條件：95℃×5 min：94℃×30 s：58℃×30 s：72℃×30 s，共34個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸 10 min。GAPDH 用作PCR擴(kuò)增反應(yīng)的內(nèi)對(duì)照。

1.7統(tǒng)計(jì)分析

2　結(jié)果

2.1甲基化特異性PCR結(jié)果和HPV16，HPV18的感染情況

40例正常組織沒(méi)有甲基化，40例宮頸癌組織分別有37例發(fā)生甲基化。相應(yīng)的分別有5例、27例發(fā)生了hr-HPV的感染，兩項(xiàng)指標(biāo)統(tǒng)計(jì)學(xué)均有顯著性差異（P＜0.01）（圖1，表2）

表1　引物信息和PCR反應(yīng)條件

圖1　HS3ST2甲基化特異性PCR和HPV16，HPV18特異性PCR結(jié)果

表2　在子宮頸癌的各階段中，HS3ST2基因啟動(dòng)子甲基化和hr-HPV感染發(fā)生的頻率

2.2半定量RT-PCR結(jié)果

結(jié)果在10例HS3ST2基因啟動(dòng)子甲基化的組織中，HS3ST2基因的mRNA的表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于10例未甲基化的組織，甲基化陰性組織中的平均吸（P＜0.01，n=3）（圖2）。

圖2　10例HS3ST2基因啟動(dòng)子甲基化陽(yáng)性和10例陰性子宮頸組織的mRNA表達(dá)情況

3　討論

宮頸癌的發(fā)生是一種有多個(gè)病理階段，多步驟的過(guò)程，與hr-HPV感染高度相關(guān)，且有隨病變嚴(yán)重程度的增加而明顯上升的趨勢(shì)［6］，使其成為癌癥機(jī)制研究并篩查癌癥早期相關(guān)分子生物標(biāo)志的理想模型。由于HSPG廣泛分布于細(xì)胞表面和細(xì)胞外基質(zhì)，是細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，而且其中的糖胺聚糖是多陰離子化合物，結(jié)合Na+、K+，從而吸收水分，其羥基也有親水性而形成凝膠，從而阻止細(xì)菌通過(guò)，但不影響小分子化合物的擴(kuò)散。HS3ST2作為修飾HSPG的重要酶類(lèi)，其沉默表達(dá)可能導(dǎo)致了修飾錯(cuò)亂和信號(hào)傳導(dǎo)異常。此外，在對(duì)非小細(xì)胞性肺癌及癌周肺組織，腫瘤及非腫瘤的痰液等標(biāo)本進(jìn)行了11個(gè)基因的甲基化分析中HS3ST2基因居第一位，且甲基化水平隨腫瘤的病理分級(jí)升高而升高。顯示出很高的相關(guān)性［7］。

目前，HS3ST2基因在子宮頸癌發(fā)生中的具體分子機(jī)制的研究較少，雖然發(fā)現(xiàn)了其在許多腫瘤中的特異性和敏感性有應(yīng)用于早期診斷的潛力，但是HS3ST2基因啟動(dòng)子甲基化與mRNA的表達(dá)的關(guān)系尚未在子宮頸癌中研究。尤其是，當(dāng)前將甲基化檢測(cè)應(yīng)用于子宮頸癌篩查的主要問(wèn)題不再是抑癌基因啟動(dòng)子甲基化的特異性不高，而是由于需要結(jié)合陰道鏡和細(xì)胞學(xué)來(lái)分析甲基化與腫瘤進(jìn)展的關(guān)系，但是這些分析尚存在分歧［8］，而且，當(dāng)今的早期干預(yù)治療使得甲基化病人的長(zhǎng)期隨訪無(wú)法進(jìn)行，難以統(tǒng)計(jì)分析HS3ST2啟動(dòng)子甲基化是否與子宮頸癌的進(jìn)展惡化直接關(guān)系。對(duì)此，本文檢測(cè)了hr-HPV的感染情況，發(fā)現(xiàn)40例宮頸癌患與40例正常組織相比均出現(xiàn)較高甲基化和hr-HPV感染率（P＜0.01），提示hr-HPV感染與甲基化存在一定關(guān)系，為HS3ST2基因啟動(dòng)子甲基化檢測(cè)應(yīng)用于子宮頸癌的早期診斷的可靠性提供相關(guān)機(jī)制參考和分子水平支持。且甲基化水平高的組織mRNA的表達(dá)水平受到了顯著抑制（P＜0.01），進(jìn)一步提示了甲基化在維吾爾族宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的作用。

由上述分析，HS3ST2基因啟動(dòng)子甲基化與新疆維吾爾族婦女子宮頸癌的發(fā)生發(fā)展高度相關(guān)，在HSIL和子宮頸癌中的高特異性和較高的敏感性使其具有補(bǔ)充和改進(jìn)當(dāng)前以細(xì)胞形態(tài)學(xué)和HPV檢測(cè)為主的早期篩查方法，HS3ST2基因啟動(dòng)子甲基化可能是hr-HPV感染所誘導(dǎo)的早期重要的分子改變，具有子宮頸癌早期大規(guī)模篩查的潛力。

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Relationship Between the Promoter Methylation of HS3ST2 Gene and the Cervical Cancer in Xinjiang Uigur Women

YUAN Xin-rong1，ZUO Qiang-qiang1，F(xiàn)ENG Qin1，PAN Ze-min2Δ
（1.Department of laboratory， The Second People Hospital of Karamay region， Karamay， Xinjiang 834007 P.R.China， 3.Department of biochemistry， School of medicine， Shihezi university， Shihezi， Xinjiang 832002 P.R.China）

Abstract:Objective：To explore the relationship between the gene promoter methylation of HS3ST2 and the cervical cancer tissues of Xinjiang Uigur women and the feasibility of the early detection and analyze the HS3ST2 gene mRNA expression in methylatiion positive and negative tissues.Methods：Methylation specific PCR（MSP）and HPV16，HPV18 specific PCR were used to detect 40 normal cervix and 40 cervical cancer tissues of Xinjiang Uigur women.The relationship between the methylation and infection was also investigated in 40 cervical cancer tissues.RT-PCR was used to analyze HS3ST2 gene mRNA expression in 10 methylation positive and 10 methylation negative cervical tissues.Results：The methylation frequency of HS3ST2 was 37/40 in cervical cancer.However，HS3ST2 gene promoter methylatiion was not found in 40 normal cervix.The corresponding infection frequency of HPV is 27/40 and 5/40.The HS3ST2 gene mRNA expression level was more decreased in the 10 methylation positive cervical tissues than in the 10 methylation negative cervical tissues.Conclusion：The hypermethylated HS3ST2 may be the critical marker for the cervical lesion that will progress to cervical cancer and has the potential for the early cervical cancer screening.

Keywords:HS3ST2 gene；Xinjiang Uigur women；Gene promoter methylation； HPV； Cervical cancer

*基金項(xiàng)目：兵團(tuán)青年科技創(chuàng)新資金項(xiàng)目（2012CB018）

作者簡(jiǎn)介：袁新榮，女，漢族，本科，副主任技師；左強(qiáng)強(qiáng)，男，漢族，山東沂源，碩士生，研究方向：分子遺傳學(xué)

通訊作者：潘澤民