張　濤, 湯永嘉, 徐　亮, 劉克良

(軍事醫(yī)學科學院毒物藥物研究所, 抗毒藥物與毒理學國家重點實驗室, 北京 100850)

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新型可用于熒光標記的α-氰基丙烯酸酯單體的合成及在小鼠活體成像中的應(yīng)用

張濤, 湯永嘉, 徐亮, 劉克良

(軍事醫(yī)學科學院毒物藥物研究所, 抗毒藥物與毒理學國家重點實驗室, 北京 100850)

摘要設(shè)計合成了新型含有熒光基團的α-氰基丙烯酸酯單體, 并與其它α-氰基丙烯酸酯單體共聚, 得到產(chǎn)生熒光的聚氰基丙烯酸酯材料. 將其包埋在小鼠背部肌肉層, 可獲得良好的熒光成像效果. 通過對熒光強度的監(jiān)測, 初步研究了聚氰基丙烯酸酯材料中的側(cè)鏈酯基在小鼠體內(nèi)的降解情況. 單體合成是以蒽合氰基丙烯酸和4,4′-二甲氧基三苯基-氨基己醇為原料, 得到蒽合氰基丙烯酸(4,4′-二甲氧基三苯基-氨基己醇)酯, 脫保護后再將異硫氰酸熒光素以化學鍵合的方式標記在末端氨基上, 脫蒽還原烯雙鍵后, 得到可用于熒光標記的α-氰基丙烯酸(異硫氰酸熒光素-氨基己醇)酯單體. 反應(yīng)中間體及單體結(jié)構(gòu)采用核磁共振氫譜和質(zhì)譜進行表征. 該單體及其高聚物均可在激發(fā)光(488 nm)和發(fā)射光(525 nm)條件下觀察到明顯熒光.

關(guān)鍵詞α-氰基丙烯酸酯; 異硫氰酸熒光素; 活體熒光成像

α-氰基丙烯酸酯類化合物最早是由德國科學家在1949年合成發(fā)現(xiàn)的[1,2], 具有可快速聚合、 黏接強度大、 無溶劑、 單組分等優(yōu)點. 尤其是α-氰基丙烯酸烷基酯在化工及生活等方面有廣泛用途, 也是目前臨床使用的化學類醫(yī)用膠的主要成分, 相關(guān)產(chǎn)品如強生公司開發(fā)的“多抹棒”等[3～5].α-氰基丙烯酸酯單體在常溫下呈液態(tài), 當接觸到機體組織和皮膚表面等陰離子時, 單體中烯雙鍵能快速聚合, 形成高聚物. 由于其單體和高聚物一般呈無色透明性狀, 使得這類材料在使用后尤其是對其進行動物體內(nèi)模型研究時, 其黏接效果和后續(xù)監(jiān)測存在一定困難. 如, 當這類材料用于動物腸道組織黏接時[6,7], 需術(shù)后打開受試動物腹腔, 否則無法有效地觀察膠體在組織上的黏接效果; 并且, 由于使用量小及膠體透明等因素, 難以準確判斷膠體在組織上的殘留情況. 因此, 對這類材料進行熒光標記, 可輔助檢驗黏接效果及后續(xù)監(jiān)測.

異硫氰酸熒光素(FITC)是一種常用的熒光標記試劑, 可以與氨基在室溫條件下快速化學鍵合形成穩(wěn)定的化學鍵, 其量子產(chǎn)率高, 有較好的光穩(wěn)定性和較低的溫度系數(shù), 不會在體內(nèi)環(huán)境下發(fā)生熒光淬滅, 已在藥物和生物材料的熒光標記中得到應(yīng)用[8～11]. 本文設(shè)計合成了新型含有FITC熒光基團的α-氰基丙烯酸酯單體, 并獲得良好的熒光活體成像效果, 適用于小鼠體內(nèi)模型的研究; 并通過對熒光強度的監(jiān)測, 初步探討了聚氰基丙烯酸酯材料結(jié)構(gòu)中的側(cè)鏈酯基在小鼠體內(nèi)的降解情況.

1實驗部分

1.1試劑、 儀器與動物

4,4′-二甲氧基三苯基氯甲烷(DMT-Cl, 吉爾生化上海有限公司);N,N-二異丙基碳二亞胺(DIC, 阿達瑪斯試劑上海有限公司); 4-二甲氨基吡啶(DMAP, 上?；瘜W試劑公司); 異硫氰酸熒光素(FITC, 美國TCI公司); 其它試劑購自國藥集團化學試劑有限公司; 所用試劑均為分析純. Sprague-Dawley遠交群(SD)小鼠, 體重(25±2) g, 雄性, 由軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心提供, 許可證號為SCXK(軍)2012-0004. 實驗動物由軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心的專業(yè)人員進行分籠詞養(yǎng), 手術(shù)過程均在軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心完成, 實驗過程中實驗動物均受到人文關(guān)懷, 無虐待動物行為.

JNM-ECA-400核磁氫譜儀(1H NMR, 日本電子株式會社); API-150EX 液相質(zhì)譜儀(美國AB公司); IVIS@SPECTRUM小動物活體成像儀(英國Perkin Elmer公司); Waters 1515 GPC凝膠色譜系統(tǒng)(GPC, 美國Water公司).

1.2實驗過程

1.2.14,4′-二甲氧基三苯基-氨基己醇(1a)的合成合成路線如Scheme 1所示. 將6-氨基己醇(5 g, 0.043 mol)置于 250 mL三口瓶中, 加入50 mL吡啶, 攪拌溶解, 在冰浴條件下滴加三甲基氯硅烷(13.9 g, 0.128 mol), 反應(yīng)4 h, 加入DMT-Cl(17.3 g, 0.051 mol), 室溫反應(yīng)12 h; 減壓除去吡啶, 調(diào)節(jié)反應(yīng)液pH至中性, 萃取, 有機相分別以100 mL飽和NaHCO3、 100 mL飽和NaCl洗滌2次, 用無水Na2SO4干燥過夜. 以石油醚-乙酸乙酯混合液(體積比4∶1)為洗脫液, 柱層析法純化分離, 減壓除去溶劑, 得淡黃色黏稠狀液體9.71 g, 即為化合物1a, 產(chǎn)率為53.9%.1H NMR(CDCl3, 400 MHz),δ: 1.25～1.62[m, 8H, (CH2)4], 2.72(d, 2H, CH2CH2NH), 3.80(s, 6H, Ph-OCH3), 4.22(s, 1H, CH2OH), 6.83～7.48(m, 13H, Ph-H), 8.29(s, 1H, CH2NH). MS,m/z: 420[M-H+].

1.2.2蒽合氰基丙烯酸-(4,4′-二甲氧基三苯基-氨基己醇)酯(3b)的合成合成路線如Scheme 2所示. 化合物2a參考文獻[12～14]方法, 由α-氰基丙烯酸乙酯與蒽的加成反應(yīng)得到蒽合氰基丙烯酸乙酯, 再在堿性溶液條件下水解得到. 將化合物2a(12.7 g, 0.046 mol)加入到50 mL二氯甲烷中, 依次加入DMAP(0.56 g, 4.60 mmol)和DIC(5.8 g, 0.046 mol), 室溫下攪拌至完全溶解, 然后加入化合物1a(19.3 g, 0.046 mol), 于室溫條件下反應(yīng)6 h; 過濾, 濾液以飽和NaHCO3溶液和飽和NaCl溶液分別洗滌3次, 用無水Na2SO4干燥; 以石油醚-乙酸乙酯-三乙胺混合液(體積比5∶1∶0.2)為洗脫液, 柱層析法純化分離, 減壓除去溶劑, 得黃色油狀液體21 g, 即為化合物3b, 產(chǎn)率為67.5%.1H NMR(CDCl3, 400 MHz),δ: 1.25～1.62[m, 8H, (CH2)4], 2.20(dd, 2H, CCH2CH), 2.72(d, 2H, CH2CH2NH), 2.77(dd, 2H, CCH2CH), 3.80(s, 6H, Ph-OCH3), 4.05(t, 2H, COOCH2), 4.43(t, 1H, Ph-CH-Ph), 4.86(s, 1H, CCH-Ph), 6.83～7.48(m, 21H, Ph-H), 8.29(s, 1H, CH2NH). MS,m/z: 677.5[M-H+], 698.9[M-Na+].

1.2.3蒽合氰基丙烯酸-6-氨基己醇酯(4c)的合成合成路線如Scheme 2所示. 將化合物3b(0.1 g, 0.14 mmol)用2 mL二氯甲烷溶解, 加入10 μL醋酸, 室溫攪拌. 用20 μL三乙胺調(diào)反應(yīng)液pH至中性, 用飽和NaCl溶液洗滌3次, 無水Na2SO4干燥, 減壓除去溶劑即可得到淡黃色油狀液體43.6 mg, 即為化合物4c, 產(chǎn)率為83.3%.1H NMR(CDCl3, 400 MHz),δ: 1.25～1.62[m, 8H, (CH2)4], 1.77(s, 2H, CH2NH2), 2.20(dd, 2H, CCH2CH), 2.77(dd, 2H, CCH2CH), 3.32(t, 2H, CH2CH2NH2), 4.05(t, 2H, COOCH2), 4.43(t, 1 H, Ph-CH-Ph), 4.86(s, 1H, CCH-Ph), 7.20～7.49(m, 8H, Ph-H). MS,m/z: 375.3[M-H+].

1.2.5α-氰基丙烯酸(FITC-氨基己醇)酯(6e)的合成合成路線如Scheme 2所示. 將化合物5d(0.19 g, 0.2 mmol)、 馬來酸酐(0.08 g, 0.8 mmol)、 2 mL二甲苯和1 mL無水乙醇加入反應(yīng)瓶中, 室溫攪拌5 h后, 加熱至50 ℃反應(yīng)2 h, 減壓除去二甲苯, 得黃綠色液體61.0 mg, 即為化合物6e, 產(chǎn)率為61.7%, 液體在接觸到皮膚和組織時能產(chǎn)生黏接力, 避光保存.1H NMR(CDCl3, 400 MHz),δ: 1.25～1.62[m, 8H, (CH2)4], 3.20(t, 2H, CH2CH2NH), 4.05(t, 2H, COOCH2), 4.41(d, 2H, OCH2CH), 4.86(s, 1H, CCH-Ph), 6.01(s, 1H, CH2NH), 6.03(s, 1H, CH2CCN), 7.06(s, 1H, CH2CCN), 7.02～7.32(m, 9H, Ph-H).

1.3FITC標記的α-氰基丙烯酸酯的體外熒光顯色實驗

分別取30 μL上述方法得到的α-氰基丙烯酸(FITC-氨基己醇)酯, 及其與α-氰基丙烯酸正丁酯按質(zhì)量比1∶5共混得到的配伍膠, 設(shè)為實驗組A和B, 分別置于96孔板中; 取30 μL氰基丙烯酸正丁酯同樣置于96孔板中, 設(shè)為對照組, 置于熒光成像系統(tǒng)下觀察膠體有無熒光. 將實驗組和對照組在潮濕環(huán)境下聚合后, 再次觀察膠體聚合物有無熒光.

1.4小鼠活體成像實驗

取5只Sprague-Dawley遠交群(SD)小鼠, 以10%(質(zhì)量分數(shù))水合氯醛溶液麻醉后, 脫去背部毛. 用手術(shù)刀分別在小鼠背部兩側(cè)開一長1 cm深至肌肉層的口子, 在SD小鼠背部皮膚左側(cè)包埋事先聚合好的聚氰基丙烯酸正丁酯材料(膠塊平面大小約為0.25 cm2,α-氰基丙烯酸正丁酯用量約為30 mg), 設(shè)為對照組; 在其皮膚右側(cè)包埋FITC熒光標記的聚氰基丙烯酸酯[α-氰基丙烯酸(FITC-氨基己醇)酯與α-氰基丙烯酸正丁酯按質(zhì)量比1∶5 得到的配伍膠, 膠塊平面大小約為0.25 cm2, 配伍膠重量約為30 mg], 設(shè)為實驗組. 以α-氰基丙烯酸正丁酯將傷口黏合后避光正常飼養(yǎng), 利用熒光成像系統(tǒng)IVIS@SPECTRUM在不同時間點(0, 7和14 d), 對實驗小鼠進行活體成像觀察.

1.5聚合物體內(nèi)降解及分子量變化

將包埋有聚合物材料的SD小鼠在14 d時處死, 對小鼠背部右側(cè)部位進行解剖, 觀察右側(cè)皮膚包埋有熒光標記聚氰基丙烯酸酯的降解情況. 取出殘余固體, 真空干燥過夜, 取25 mg溶于1 mL四氫呋喃中, 利用Waters 1515 GPC凝膠色譜系統(tǒng), 對殘余固體分子量進行分析.

2結(jié)果與討論

2.1單體合成

通過1.2節(jié)的合成方法, 得到重要中間體2a, 3b, 4c和5d及新型含有熒光基團的α-氰基丙烯酸酯單體6e, 通過核磁氫譜和質(zhì)譜驗證了其結(jié)構(gòu)正確性. 由于氨基能夠快速與FITC進行反應(yīng), 也能夠引發(fā)α-氰基丙烯酸酯結(jié)構(gòu)中的烯雙鍵聚合, 因此, 在合成路線的設(shè)計上, 先對氰基丙烯酸酯中的烯雙鍵用蒽進行保護, 脫去酯基后, 獲得起始反應(yīng)物2a. 氨基采用酸敏感的DMT基團進行保護, 目的是其脫除條件溫和且不影響化合物3b中的酯基. 雖然單體6e結(jié)構(gòu)中有仲氨結(jié)構(gòu), 但單體在儲存條件下可穩(wěn)定存在, 說明采用的FITC熒光基團的引入方式, 以及FITC本身的結(jié)構(gòu)均不會引發(fā)α-氰基丙烯酸酯中烯雙鍵的聚合. 這一合成方法具有一定的通用性, 還可將氨基己醇替換為氨基丁醇和氨基辛醇等, 從而獲得不同酯基長度的單體結(jié)構(gòu); 也可將FITC替換為其它熒光標記基團.

2.2FITC標記的α-氰基丙烯酸酯的體外熒光顯色

在激發(fā)光488 nm、 發(fā)射光為525 nm條件下可觀察到, 含有α-氰基丙烯酸(FITC-氨基己醇)酯單體的2個孔中均有明顯的熒光. 實驗組A, 即α-氰基丙烯酸(FITC-氨基己醇)酯單體的熒光強度為1.440×1010Photon·s-1·cm-2·sr-1; 實驗組B, 即α-氰基丙烯酸(FITC-氨基己醇)酯與α-氰基丙烯酸正丁酯按質(zhì)量比1∶5得到的配伍膠的熒光強度為3.740×109Photon·s-1·cm-2·sr-1; 而對照組α-氰基丙烯酸正丁酯則幾乎觀察不到熒光, 結(jié)果表明新型α-氰基丙烯酸(FITC-氨基己醇)酯單體可獲得良好的熒光成像效果, 且熒光強度大小可通過FITC標記單體的含量進行調(diào)節(jié).

實驗組和對照組在潮濕環(huán)境下聚合后, 同樣, 在激發(fā)光488 nm、 發(fā)射光為525 nm條件下觀察到含有聚氰基丙烯酸(FITC-氨基己醇)酯的2個孔中均有明顯的熒光, 如圖1所示, 實驗組A即聚氰基丙烯酸(FITC-氨基己醇)酯的熒光強度為1.219×1010Photon·s-1·cm-2·sr-1; 實驗組B, 即FITC熒光標記的聚氰基丙烯酸酯類材料[α-氰基丙烯酸(FITC-氨基己醇酯)與α-氰基丙烯酸正丁酯的質(zhì)量比為1∶5]的熒光強度為3.360×109Photon·s-1·cm-2·sr-1; 而對照組聚氰基丙烯酸正丁酯幾乎看不到熒光. 說明α-氰基丙烯酸(FITC-氨基己醇)酯單體在聚合后仍然具有明顯熒光, 且熒光強度未發(fā)生明顯變化, 說明單體結(jié)構(gòu)中烯雙鍵聚合與否, 不會對FITC熒光標記的氰基丙烯酸酯材料的熒光強度產(chǎn)生顯著影響.

2.3小鼠活體成像實驗結(jié)果

在對SD小鼠進行背部膠塊包埋手術(shù)后, 迅速利用熒光成像系統(tǒng)IVIS@SPECTRUM進行觀察, 結(jié)果如圖2所示. 在激發(fā)光488 nm及發(fā)射光為525 nm條件下可觀察到包埋有FITC熒光標記的聚氰基丙烯酸酯[α-氰基丙烯酸(FITC-氨基己醇)酯與α-氰基丙烯酸正丁酯按質(zhì)量比1∶5得到的配伍膠]小鼠右側(cè)部位有明顯的熒光產(chǎn)生, 熒光強度為1.188×1010Photon·s-1·cm-2·sr-1; 左側(cè)對照組部位以及小鼠其它部位在相同條件下無熒光產(chǎn)生, 說明制備的α-氰基丙烯酸(FITC-氨基己醇)酯單體適用于小鼠體內(nèi)模型的研究, 可獲得良好的熒光成像效果, 小鼠本身不會對熒光觀察產(chǎn)生干擾.

2.4 FITC熒光標記的α-氰基丙烯酸酯在動物體內(nèi)的降解

圖3(A)是在0, 7和14 d時監(jiān)測到的小鼠熒光強度照片, 圖3(B)是其對應(yīng)的數(shù)值和以0 d為100%參比時的熒光殘留百分比. 可以看出, 將聚氰基丙烯酸材料包埋在小鼠肌肉層以下部位后, 隨著時間的推移, 熒光強度隨著時間延長而減小, 在7 d時, 熒光強度約為初始強度的(30.0±10.2)%, 在14 d時, 熒光強度約為初始強度的(14.0±9.0)%. 與此同時, FITC熒光標記的聚氰基丙烯酸酯[α-氰基丙烯酸(FITC-氨基己醇)酯與α-氰基丙烯酸正丁酯按質(zhì)量比1∶5得到的配伍膠]在體外條件下(避光、 干燥), 相同時間內(nèi)其熒光強度幾乎不變.

14 d時SD小鼠解剖情況如圖4所示. 可見小鼠背部右側(cè)部位包埋有FITC熒光標記的聚氰基丙烯酸酯[α-氰基丙烯酸(FITC-氨基己醇)酯與α-氰基丙烯酸正丁酯按質(zhì)量比1∶5得到的配伍膠]仍存在明顯的膠塊, 未觀察到體積明顯縮小的現(xiàn)象. 進一步, 利用分子排阻色譜(GPC)對取出的降解殘余固體進行分子量分析, 結(jié)果如圖5所示. 熒光標記的聚氰基丙烯酸酯[α-氰基丙烯酸(FITC-氨基己醇)酯與α-氰基丙烯酸正丁酯按質(zhì)量比1∶5得到的配伍膠]降解前的分子量為283345; 在SD小鼠體內(nèi)降解14 d后其殘余固體的分子量為243689.

實驗中觀察到熒光標記的聚氰基丙烯酸酯的熒光強度降低且在動物體內(nèi)其它部位并未出現(xiàn)熒光的明顯蓄積, 說明了含有FITC結(jié)構(gòu)的碎片分子從聚合物結(jié)構(gòu)中被逐漸降解, 并且被快速排出動物體外. 但在動物解剖中, 發(fā)現(xiàn)膠體仍殘留在植入部位, 體積未出現(xiàn)等同于熒光降低程度的明顯減小. 考慮到在生理條件下, 聚氰基丙烯酸酯結(jié)構(gòu)中側(cè)鏈酯鍵更易水解[15～17]; 同時, 通過核磁氫譜測定的殘余固體中側(cè)鏈酯基部位氫峰與聚合物主鏈―CH2―峰積分比例變小, 可推測聚合物發(fā)生的主要是側(cè)鏈酯基部分的降解, 而聚合物的碳碳主鏈, 即殘留的大部分聚氰基丙烯酸結(jié)構(gòu)仍然未能被有效降解. 進一步結(jié)合GPC中觀察到的聚合物分子量變化, 可進一步印證這一過程, 即分子量減少主要是由于酯基部分的降解. 目前市售α-氰基丙烯酸酯醫(yī)用膠聚合后形成線型主鏈的高聚物分子, 其聚合物側(cè)鏈酯基的水解不涉及碳碳主鏈部分. 本文通過熒光檢測的方法, 為闡明該類聚合物材料在體內(nèi)條件下的降解和代謝模式, 提供了輔助的證據(jù). 結(jié)果顯示, 熒光標記的聚氰基丙烯酸酯在體內(nèi)條件下, 首先發(fā)生的是酯鍵的逐漸斷裂和酯基部分的代謝(14 d在80%以上), 但其殘留的(聚氰基丙烯酸+聚氰基丙烯酸酯)混合物的結(jié)構(gòu), 由于分子量巨大, 難以在短期內(nèi)被組織有效吸收, 并且, 由于分子量巨大且遠遠超過了腎小球濾過的范圍, 還存在可能無法代謝出體外的問題, 因此, 這類物質(zhì)能否在體內(nèi)安全應(yīng)用值得引起關(guān)注.

3結(jié)論

合成了新型可用于熒光標記α-氰基丙烯酸酯單體, 其體外及體內(nèi)熒光顯色實驗結(jié)果顯示, 該單體及其聚合物可作為熒光探針應(yīng)用于小動物皮下部位活體成像. 初步研究了聚氰基丙烯酸酯材料結(jié)構(gòu)中的側(cè)鏈酯基在小鼠體內(nèi)的降解情況, 為探討這類材料在體內(nèi)條件下的結(jié)構(gòu)和分子量變化規(guī)律提供了輔助證據(jù), 即, 聚氰基丙烯酸酯類材料的側(cè)鏈酯鍵雖然可以斷裂, 但其聚合物主鏈仍然不能在短期內(nèi)被有效降解. 需要指出的是, 本文中僅研究了材料在小鼠的淺表組織的熒光活體成像, 其在動物深層組織和臟器(如腸道組織)是否仍能獲得良好的熒光活體成像效果, 仍需進一步實驗驗證. 采用本文的合成方法, 可標記穿透力更強的近紅外入射和發(fā)射光染料, 如Cy5等. 此外, 考慮到聚氰基丙烯酸酯納米微球是近年來研究較多的一類藥物遞送載體材料[17～19], 本文提供的熒光標記方法, 還可以進一步運用到這類研究中, 對材料進入動物體內(nèi)后的代謝情況進行輔助的觀測.

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(Ed.: D, Z)

? Supported by the Natural Science Foundation of China(No.81573345) and the National Science and Technology Major Projects of China(No.2012ZX09301003).

Synthesis of a New Cyanoacrylate Monomer and Its Application in Fluorescence Imaginginvivo?

ZHANG Tao, TANG Yongjia, XU Liang*, LIU Keliang*

(BeijingInstituteofPharmacologyandToxicology,StateKeyLaboratoryofToxicologyandMedicalCountermeasures,Beijing100850,China)

KeywordsCyanoacrylate; Fluorescein isothiocyanate(FITC); Fluorescence imaginginvivo

AbstractA new cyanoacrylate monomer with fluorescein isothiocyanate(FITC) labeling was synthesized. It could copolymerize with any other cyanoacrylate monomers and result in copolymer being able to produce fluorescence. Well fluorescence imaging could be got when the copolymer was embedded in subcutaneous tissue of Sprague-Dawley(SD) mice. We also discussed the degradation pattern of polycyanoacrylate by monitoring the fluorescence intensity with time. The synthesis was started with anthracene /cyanoacrylate acid adduct and 6-(4,4′-dimethoxytriphenylmethyl)-amino-1-hexanol. After deprotection of 4,4′-dimethoxytriphenylmethyl group from intermediate anthracene/6-(4,4′-dimethoxytriphenylmethyl)-amino-1-hexanol cyanoacrylate adduct, FITC was labeled onto the amino group. The target product was finally got by reduction of the ethylenic bond. Structure of intermediates and target compound were identified by1H NMR and MS spectroscopy. Both the monomer and polymer could be observed fluorescence around 525 nm wavelength by an exciting light at 488 nm.

收稿日期:2016-01-30. 網(wǎng)絡(luò)出版日期: 2016-05-26.

基金項目:國家自然科學基金(批準號: 81573345)和國家科學和技術(shù)重大專項(批準號: 2012ZX09301003)資助.

中圖分類號O632.1

文獻標志碼A

聯(lián)系人簡介: 劉克良, 男, 博士, 研究員, 博士生導(dǎo)師, 主要從事多肽藥物、 核酸化學和醫(yī)藥用高分子材料的研究.

E-mail: keliangliu55@126.com

徐亮, 男, 博士, 副研究員, 主要從事核酸化學和醫(yī)藥用高分子材料的研究. E-mail: wj24998@163.com