趙　強(qiáng)，王廷璞

(天水師范學(xué)院 生物工程與技術(shù)學(xué)院，甘肅 天水 741000)

紅茂草中黃酮類提取工藝優(yōu)化及體外抑菌研究

趙強(qiáng)，王廷璞

(天水師范學(xué)院 生物工程與技術(shù)學(xué)院，甘肅 天水 741000)

摘要：以紅茂草為研究對(duì)象，在單因素水平篩選測定的基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面法優(yōu)化其提取工藝。提取物采用Diamonsil C18(4.6 mm×150 mm，1.8 μm)色譜柱為固定相，甲醇-0.2%磷酸(65∶35，v/v)為流動(dòng)相，流速1.0 mL/min，檢測波長280 nm；并對(duì)提取物進(jìn)行抑菌活性測定，以大腸埃希氏桿菌和金黃色葡萄球菌為供試菌，進(jìn)行體外抑菌活性研究和透射電鏡觀察。結(jié)果顯示，紅茂草中黃酮類化合物最佳提取工藝條件為：液料比15 mL/g、超聲時(shí)間35 min、回流時(shí)間2.5 h、乙醇體積分?jǐn)?shù)65%，在此工藝下紅茂草中黃酮類化合物含量為2.60%，HPLC檢測重現(xiàn)性好；其提取物對(duì)大腸埃希氏桿菌和金黃色葡萄球菌的MIC為0.28 g/mL和0.20 g/mL，MBC為0.26 g/mL和0.10 g/mL，IC50為0.2162 g/mL和0.1805g/mL，在透射電鏡下觀察抑菌效果顯著。研究表明，響應(yīng)面法對(duì)紅茂草中黃酮類化合物提取工藝的優(yōu)化比較合理。

關(guān)鍵詞：響應(yīng)面法；紅茂草；黃酮類化合物

紅茂草[Dicranostigma leptodum(maxim.)Fedde,DLF]俗名禿瘡花、禿子花、勒馬回，屬罌粟科禿瘡花屬兩年或多年生草本植物。生長于海拔1 000～2 400 m的草坡、丘陵、路邊、農(nóng)田埂、墻上、屋頂?shù)忍?，具有耐旱、耐瘠薄等生活?xí)性。在我國主要分布在青海、甘肅、陜西等省。味苦、澀、性涼，有毒，民間全草入藥，能清熱解毒、消腫止痛、殺蟲、治療扁桃腺炎、咽喉痛、淋巴結(jié)核、禿疤、疥癬等癥。

黃酮類化合物是植物次生代謝的產(chǎn)物，廣泛存在于自然植物中，以游離態(tài)或與糖結(jié)合為苷的形式存在。該類化合物結(jié)構(gòu)復(fù)雜，種類很多；研究發(fā)現(xiàn)其具有顯著的生理及藥理活性，不僅有抗癌、抗腫瘤、抗氧化、抗炎抑菌、降血糖、抗輻射以及增強(qiáng)免疫能力等藥理作用，還具有改善記憶、抗焦慮、抗抑郁、中樞抑制和神經(jīng)保護(hù)等功能，能夠防治心腦血管系統(tǒng)和呼吸系統(tǒng)的疾病。

為了科學(xué)、充分的利用紅茂草中的黃酮類化合物資源，很有必要對(duì)其黃酮類化合物的提取條件進(jìn)行優(yōu)化。本次實(shí)驗(yàn)選擇紅茂草干粉為原料，采用單因素實(shí)驗(yàn)篩選，利用響應(yīng)面分析法對(duì)其提取工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，得到紅茂草黃酮類化合物最佳提取工藝條件，并通過HPLC對(duì)提取物成份及純度進(jìn)行檢測，為紅茂草藥物的深層次研究提供了一定的理論參考。

1材料與方法

1.1材料與儀器

紅茂草干粉,天水師范學(xué)院生物園規(guī)范化種植，自然風(fēng)干，粉碎、過篩、備用。試劑 蘆丁對(duì)照品(國藥集團(tuán)，批號(hào)：F20051222)、NaOH、95%乙醇、NaNO2、Al(NO3)3甲醇、磷酸、戊二醛等，其余試劑均為國產(chǎn)或進(jìn)口分析純。培養(yǎng)基 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，提前配制，滅菌備用。菌種,大腸埃希氏桿菌(Escherichia coli，ATCC 12453)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，ATCC 26113)，均為天水師范學(xué)院生物工程實(shí)驗(yàn)室保存標(biāo)準(zhǔn)菌。

KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器,昆山市超聲儀器有限公司產(chǎn)品；722可見分光光度計(jì),上海欣茂儀器有限公司；Alliance 高效液相色譜儀,美國安捷倫；AB104-S精密電子分析天平:瑞士梅特勤公司產(chǎn)品；JY系列電子天平,上海方瑞儀器有限公司；RE52-99 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器,上海亞榮生化儀器廠產(chǎn)品；JEM-1230 型透射電子顯微鏡,瑞利儀器分析有限公司產(chǎn)品；索氏提取器等。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1標(biāo)準(zhǔn)溶液配制與標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制精密稱取0.0625 g的蘆丁對(duì)照品，加75% 50 mL乙醇溶解，定容至250 mL的容量瓶中，搖勻作為蘆丁對(duì)照品溶液(0.25 mg/mL)。準(zhǔn)確移取0.25 mg/mL蘆丁溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0、13.0、14.0、15.0 mL 于15只50 mL容量瓶中，另取蒸餾水作為空白對(duì)照，分別各加入10 mL蒸餾水，加入5% 的NaNO2溶液2 mL，搖勻，靜置6 min，加1% 的Al(NO3)3溶液6 mL，搖勻，靜置6 min，加4% 的NaOH溶液20 mL，搖勻后靜置15 min，加蒸餾水至刻度，在510 nm的波長處測定其吸光度，每個(gè)樣品設(shè)置三個(gè)平行樣。

1.2.2紅茂草中黃銅類化合物的鹽酸-鎂粉反應(yīng)檢測采用鹽酸-鎂粉反應(yīng)法對(duì)紅茂草中黃銅類化合物進(jìn)行定性檢測，以標(biāo)準(zhǔn)品蘆丁為陽性對(duì)照品。準(zhǔn)確移取5.00 mL紅茂草中黃銅類化合物濃縮液和0.005 g/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液各兩份，分別置于50 mL的燒杯中，并向每只燒杯里加入5.00mL的甲醇溶液。將6只燒杯分組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，具體分組如表1所示。各試劑添加完畢后，充分振搖，觀察顏色變化。實(shí)驗(yàn)組重復(fù)3次操作。

表1　試驗(yàn)分組與試劑添加

注：試驗(yàn)組重復(fù)3次操作。

1.2.3提取試驗(yàn)設(shè)計(jì)稱取紅茂草干草粉末6份，每份10.0 g。固定液料比14 mL/g、浸泡時(shí)間18 h、索氏提取回流時(shí)間2.5 h、超聲時(shí)間25 min、浸提液pH=5，考察乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%,55%,60%,65%,70%,75%,80%時(shí)對(duì)提取效果的影響。然后將優(yōu)選的最佳乙醇體積分?jǐn)?shù)做為固定數(shù)值，依次選取考察液料比為12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1 mL/g，回流時(shí)間為1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 h，超聲時(shí)間為10、15、20、25、30、35、40 min，浸泡時(shí)間為0、4、8、12、16、20、24h，調(diào)節(jié)浸提液pH為2、3、4、5、6、7、8時(shí)對(duì)提取效果的影響。將每次優(yōu)選后的最佳條件固定，再逐次篩選其余最佳條件。根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)行極差分析，最終優(yōu)選出4個(gè)主要影響因素，按照響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案進(jìn)行黃酮提取。再將提取液轉(zhuǎn)入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，35～40 ℃下減壓蒸至無醇味，轉(zhuǎn)入100 mL錐形瓶，封口靜置。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，使用Box-Behnken中心設(shè)計(jì)，通過響應(yīng)面法進(jìn)行紅茂草中黃酮類化合物提取條件的優(yōu)化。

采用極差分析對(duì)6組單因素水平進(jìn)行篩選，最終確定液料比X1(mL/g)、超聲時(shí)間X2(min)、回流時(shí)間X3(h)、乙醇體積分?jǐn)?shù)X4(min)四個(gè)因素作為自變量進(jìn)行響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)。使用Design-Expert 7.0軟件，以紅茂草中黃酮類化合物(蘆丁)含量為指標(biāo)，設(shè)計(jì)4因素3水平(共29個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)，5個(gè)中心點(diǎn))的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，其因素水平表見表2所示。

表2　響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素水平

1.2.4紅茂草中黃酮類化合物含量的測定將25個(gè)50 mL容量瓶中的提取液稀釋后測定其吸光值，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出提取液中黃酮類化合物的濃度，最后計(jì)算出紅茂草中黃酮類化合物提取得率。

C為提取物中蘆丁含量(mg/mL)；V為體積(mL)；B為稀釋倍數(shù)；m為紅茂草的質(zhì)量(g)。

1.2.5HPLC檢測色譜柱：Diamonsil C18(4.6 mm×150 mm，1.8 μm)；流動(dòng)相：甲醇-0.2%磷酸溶液(65:35)；流速：1.0 mL/min；檢測波長：280 nm；溫度30(±1)℃；進(jìn)樣量：5.0μL 。

準(zhǔn)確配制濃度為0.0250 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液，依次配成0.1875、0.3750、0.7500、1.5000、3.0000μg/mL濃度梯度的溶液，進(jìn)行HPLC檢測。

1.2.6體外抑菌(1)菌液制備,將所選供試菌事先接種于無菌平板上，37 ℃培養(yǎng)1 d后，選取典型菌落，轉(zhuǎn)移接種在液體培養(yǎng)基中，經(jīng)37 ℃培養(yǎng)1 d后，再用無菌生理鹽水稀釋，使其為菌量106～107CFU /mL的菌懸液，備用。(2)MIC、MBC和IC50的測定,將紅茂草黃酮類提取物用無菌蒸餾水倍比稀釋，制備所需系列濃度的稀釋液。然后將稀釋液分別定量轉(zhuǎn)移至無菌培養(yǎng)皿中，與定量倒入的培養(yǎng)基充分混勻，室溫冷卻、凝固，制成含藥液的平板。再按培養(yǎng)皿所需的計(jì)量，分別移取定量被試菌液，涂于平板上，置于恒溫箱中37 ℃培養(yǎng)1～2 d，檢查菌落生長情況，以平板菌落計(jì)數(shù)法計(jì)算菌落數(shù)，另取各含藥液1：5濃度無菌陰性和無藥陽性作為對(duì)照。以肉眼計(jì)數(shù)，完全沒有菌落生長時(shí)的最低藥物濃度，為該藥物的最小抑菌濃度(Minimal Inhibitory Concentration, MIC)。取上述MIC及以上各濃度未見細(xì)菌生長的個(gè)試管培養(yǎng)物，分別移取0.1 mL接種至不含藥物的培養(yǎng)基上，涂勻平板，置于恒溫箱37 ℃培養(yǎng)1 d，查看有無菌落生長，計(jì)數(shù)少于5個(gè)菌落者，為該藥物的最低殺菌濃度(Minimal Bactericidal Concentration, MBC)。37 ℃培養(yǎng)觀察菌落生長情況，以培養(yǎng)皿中長菌或不長菌為準(zhǔn)，按Reed-Muench法計(jì)算其半數(shù)抑菌濃度(Half Inhibitory Concentration, IC50)。以上試驗(yàn)均重復(fù)3次。(3)透射電子顯微鏡觀察,選取典型供試菌作為研究對(duì)象，將其接種在已制得的瓊脂蛋白胨培養(yǎng)基上，恒溫箱37 ℃培養(yǎng)1 d后，用pH=6.0的5 mmol/L磷酸緩沖液洗脫細(xì)菌，使其含量保持在108 CFU /mL左右。移取500 μL菌懸液，加到濃度為0.2%的紅茂草黃酮類提取物中(溶于1% HAc)，使紅茂草黃酮類提取物最終濃度稀釋為0.1%。將其置于1.5 mL離心管中，37 ℃搖床(120 r/min)培養(yǎng)1 d，離心后取出細(xì)菌沉渣。將離心后的細(xì)菌團(tuán)，加3%戊二醛，在4 ℃時(shí)固定5 h，用5 mol/L磷酸鹽緩沖液漂洗3次，每次10 min，再用1%的OsO44 ℃后固定1 h，最后用5 mol/L磷酸鹽緩沖液漂洗3次。使用40%、60%、80%、100%乙醇，4 ℃下脫水10 min，再用純丙酮脫水2次，每次10 min。加入環(huán)氧樹脂Epon-812(1∶1)與純丙酮，室溫靜置3 h，用環(huán)氧樹脂Epon-812包埋后，分別在30、40、60 ℃下，分別聚合4、12、24 h，制成超薄切片，使用枸椽酸鉛和醋酸雙氧鈾雙染色，在JEM-1230型透射電鏡下觀察其抑菌效果。

2結(jié)果與分析

2.1蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

根據(jù)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品系列質(zhì)量濃度梯度在510 nm處測定吸光值，得回歸方程：Y=0.0166X+0.0216，R2=0.9989，線性關(guān)系良好。

2.2紅茂草中黃銅類化合物的定性檢測

通過鹽酸-鎂粉反應(yīng)法對(duì)紅茂草中黃銅類化合物進(jìn)行定性檢測。結(jié)果顯示，試驗(yàn)組燒杯中，在反應(yīng)生成的泡沫處，溶液呈現(xiàn)橙紅色，均呈明顯的陽性反應(yīng)，陽性對(duì)照組同樣呈現(xiàn)橙紅色，而空白對(duì)照組溶液無明顯的顏色變化，這表明本試驗(yàn)所提取的紅茂草提取物里含有黃酮類化合物，這與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道一致。

2.3單因素提取實(shí)驗(yàn)

將單因素的實(shí)驗(yàn)結(jié)果繪制成表格，見表3所示。以蘆丁含量為指標(biāo)，選出每個(gè)因素的最優(yōu)水平，即對(duì)應(yīng)的黃酮類化合物含量也最高。

表3　單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

注：*表示最優(yōu)水平。

2.4響應(yīng)面法模型建立

2.4.1響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)及結(jié)果以X1(液料比)、X2(超聲時(shí)間)、X3(回流時(shí)間)、X4(乙醇體積分?jǐn)?shù))為自變量，紅茂草中黃酮類化合物含為響應(yīng)值(Y)，進(jìn)行響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)，共有29個(gè)實(shí)驗(yàn)，其中24個(gè)為析因?qū)嶒?yàn)，5個(gè)為中心實(shí)驗(yàn)，用以估計(jì)誤差。其結(jié)果見表4所示，模型方差分析結(jié)果見表5所示。

表4　響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果

續(xù)表4

實(shí)驗(yàn)號(hào)X1X2X3X4液料比(mL/g)超聲時(shí)間(min)回流時(shí)間(h)乙醇體積分?jǐn)?shù)(%)Y黃酮含量(%)1915302.0601.28352014202.5651.19312115303.0702.03812216302.5601.28582316202.5651.03352416302.5701.50822515202.5701.18252616402.5652.02932715403.0652.32702814303.0651.78582915303.0601.3623

表5　響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)方差分析

注：* 表示差異顯著，** 表示差異極顯著。

通過Design-Expert 7.0軟件對(duì)表3中的數(shù)據(jù)得到以上四個(gè)因素與紅茂草中黃酮類化合物得率Y(%)之間的模擬方程為：

Y=2.8382+0.0429X1+0.3114X2+0.0297X3+0.2359X4+0.2120X1X2-0.1345X1X3+0.0331X1X4+0.2956X2X3+0.1588X2X4-0.0429X3X4-0.7531X12-0.7490X22-0.4867X32-0.7109X42

該回歸模型F檢驗(yàn)為極顯著(P<0.01)，純誤差項(xiàng)不顯著，其決定系數(shù)r2=0.8752，說明該擬合方程與實(shí)際情況相符，且誤差較小，能充分反映出各因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系，其影響不是呈簡單的線性關(guān)系。通過該方程發(fā)現(xiàn)，各種因素之間存在著一定的交互作用，其中X2、X12、X22、X32、X42均呈極顯著影響(P<0.01)，X4、X2X3呈顯著影響(P<0.05)，X1、X3、X1X2、X1X3、X1X4、X2X4、X3X4均呈不顯著。

從單因素水平觀察，可以得出其影響順序?yàn)椋篨2(超聲時(shí)間)>X4(乙醇體積分?jǐn)?shù))>X1(液料比)>X3(回流時(shí)間)。在有交互作用存在下，對(duì)紅茂草中黃酮類化合物含量的影響順序?yàn)椋篨2X3>X1X2>X2X4>X1X3>X3X4>X1X4。

2.4.3黃酮類化合物得率的響應(yīng)曲面分析與優(yōu)化各影響因素之間兩兩相互關(guān)系對(duì)紅茂草中黃酮類化合物含量影響的響應(yīng)面圖，見圖1所示。

圖1各因素之間的等高線圖和響應(yīng)面圖

從各因素之間兩兩相互作用的響應(yīng)面圖形觀察，發(fā)現(xiàn)其中曲線走勢越陡，其影響越顯著；曲線走勢越平滑，其影響越小。超聲時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)和液料比的圖形曲線走勢較陡，說明其影響顯著。由Design-Expert 7.0軟件進(jìn)行系統(tǒng)分析，得出影響紅茂草中黃酮類化合物含量的最佳提取工藝條件為：液料比15.70 mL/g、超聲時(shí)間33.36 min、回流時(shí)間2.51 h、乙醇體積分?jǐn)?shù)66.09%、黃酮類化合物含量為2.60%，結(jié)合實(shí)際操作過程中的局限性，最終確定修正后的工藝條件為：液料比15 mL/g、超聲時(shí)間35 min、回流時(shí)間2.5 h、乙醇體積分?jǐn)?shù)65%，在此工藝下紅茂草中黃酮類化合物為2.60%。按照優(yōu)化條件進(jìn)行平行三組提取實(shí)驗(yàn)，取平均值為2.59%，與理論值相差0.39%，說明采用響應(yīng)面法優(yōu)化的提取條件可靠。使用響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，克服了正交設(shè)計(jì)只能處理離散的水平值，而無法找出整個(gè)區(qū)域上因素的最佳組合和響應(yīng)值的最優(yōu)值的缺陷，并能減少實(shí)驗(yàn)次數(shù)，分析幾種因素間的交互作用，以達(dá)到較全面地反映各因素水平的效果。

2.4.4HPLC檢測結(jié)果將蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品和在響應(yīng)面優(yōu)化條件下提取濃縮至無醇味的紅茂草提取物進(jìn)行HPLC檢測，見圖2所示。

圖2　HPLC檢測結(jié)果

在選定波長為280 nm處，將蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品與響應(yīng)面優(yōu)化條件下提取的紅茂草樣品分別進(jìn)行HPLC檢測。由上圖可知，將蘆丁標(biāo)準(zhǔn)系列得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線為色譜峰面積Y，得歸一化方程為：Y=70.289X-8.7089(R2=0.9995)，0.352～24 μg/mL；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間tR=9.658 min，范圍為9.326～11.015 min。優(yōu)化條件下提取的紅茂草中提取的黃酮類化合物在9.457 min時(shí)出峰，峰形對(duì)稱，與標(biāo)樣接近。平均回收率為99.78%、RSD為2.4%，表明精密度良好、重現(xiàn)性好。

2.5 抑菌結(jié)果

由表6可知，紅茂草黃酮類提取物對(duì)大腸埃希氏桿菌和金黃色葡萄球菌的MIC為：0.28和0.20 g/mL，MBC為：0.26和0.10 g/mL，IC50為：0.2162和0.1805 g/mL。

表6　紅茂草黃酮類提取物抑菌效果

注：表中數(shù)據(jù)為3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值。(“+”表示有菌生長；“++”表示細(xì)菌生長較茂盛；“+++”表示細(xì)菌生長茂盛；“-”表示無菌生長。)

2.6超微結(jié)構(gòu)觀察

以紅茂草黃酮類提取物對(duì)大腸埃希氏桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制作用結(jié)果50 000倍電鏡圖。

2.6.1E. coli抑制效果加入紅茂草黃酮類提取物前后，大腸埃希氏桿菌變化電鏡照片如圖3所示。

(A)E. coli　　　　　　　　　　　　　(B)藥液處理后的E.coli

圖3紅茂草黃酮類提取物加入前后E. coli的透射電鏡圖(×50000)

對(duì)照組(圖3A)的切面呈桿狀，菌細(xì)胞大小基本一致，排列整齊，細(xì)胞壁、細(xì)胞膜完整，胞質(zhì)均勻，內(nèi)緣與細(xì)胞膜間無空隙。紅茂草黃酮類提取物加入后E.coli(圖3B)形態(tài)多樣，排列不整齊，多以球形體為主，并可見不規(guī)則形，細(xì)胞壁變薄不完整，或者已經(jīng)破裂，有些菌體的細(xì)胞壁部分或全部脫落消失，細(xì)菌輪廓模糊，外觀呈毛刺狀，結(jié)構(gòu)不清且發(fā)生不同程度的凹陷變形，細(xì)胞外有溶出物溢出。

2.6.2S.aureus抑制效果加入紅茂草黃酮類提取物前后，金黃色葡萄球菌變化照片如圖4所示。

(A)S.aureus　　　　　　　　　　　　　　 (B)藥液處理后的S.aureus

圖4紅茂草黃酮類提取物加入前后S.aureus的透射電鏡圖(×50000)

對(duì)照組(圖4A)的菌細(xì)胞切面呈葡萄球狀，表面光滑圓潤，菌細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整、清晰，細(xì)胞壁邊緣整齊、細(xì)胞膜完整；紅茂草黃酮類提取物加入后S.aureus的形態(tài)發(fā)生變化(圖4B)，菌細(xì)胞結(jié)構(gòu)、層次不清，外圍有液體溢出的痕跡，細(xì)胞壁局部似乎比對(duì)照組更厚，還可觀察到有缺乏任何細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)的細(xì)菌碎片。

3結(jié)論

本試驗(yàn)以藥用植物紅茂草中黃酮類化合物(蘆丁)的含量為標(biāo)準(zhǔn)，首先考察了乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、回流時(shí)間、超聲時(shí)間、浸泡時(shí)間、浸提液pH等6組單因素水平對(duì)紅茂草中黃酮類化合物的影響，最終篩出4組主要因素進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，確定其最佳提取工藝條件為：液料比15 mL/g、超聲時(shí)間35 min、回流時(shí)間2.5 h、乙醇體積分?jǐn)?shù)65%，在此工藝下黃酮類化合物含量為2.60%。HPLC檢測進(jìn)一步驗(yàn)證響應(yīng)面法提取工藝的可靠性，為紅茂草中黃酮類化合物含量做了進(jìn)一步準(zhǔn)確測定。通過抑菌實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：紅茂草黃酮類提取物對(duì)對(duì)大腸埃希氏桿菌和金黃色葡萄球菌的MIC為：0.28和0.20 g/mL，MBC為：0.26和0.10 g/mL，IC50為：0.2162和0.1805 g/mL。對(duì)供試細(xì)菌進(jìn)行50 000倍透射電鏡觀察，表明其抑菌效果顯著，進(jìn)一步說明了紅茂草黃酮類提取物的抑菌性能較強(qiáng)。

紅茂草在甘肅省天水地區(qū)分布廣泛，有清熱、消腫、解毒等功效。通過對(duì)紅茂草中黃酮類化合物的響應(yīng)面提取工藝及抑菌活性研究，為該藥物資源的進(jìn)一步深層次開發(fā)提供了基礎(chǔ)。

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Optimization of Extracting Technology of Flavonoid from Dicranostigma Leptopodum (maxim.)Fedde and Study on its Antibacterial Activity in Vitro

ZHAO Qiang, WANG Ting-pu

(CollegeofBioengineeringandTechnology,TianshuiNormalUniversity,TianshuiGansu741000)

Abstract:On the basis of single factor level determination of screening, the extraction technology of flavonoid from Dicranostigma leptopodum(maxim.)Fedde (DLF) was optimized by using the response surface analysis. Extractive was used by Diamonsil C18 (4.6mm×150mm,1.8μm). The stationary phase was chromatographic column, mobile phase was methanol-0.2% phosphoric acid(65:35，v/v), the flow rate was 1.0 mL/min, and detection wavelength was 254 nm. Antibacterial activities of the extracts were measured. Providing E. coli and S.aureus as the tested strains, antibacterial activity in vitro was researched and transmission electron microscope images were observed. The results demonstrated that the optimum condition of extraction technology of flavonoids from DLF as follow: liquid to solid ratio was 15 mL/g, ultrasound time was 35 min, refluxing time was 2.5h, and alcohol was 65%. In these conditions, the content of flavonold from DLF was 2.60% and HPLC detection had good reproducibility. The MIC of flavonoids on E.coli and S.aureus were 0.28 and 0.20 g/mL, respectively. The MBC were 0.26 and 0.10 g/mL, respectively. The IC50 were 0.2162 and 0.1805g/mL, respectively.Observed under transmission electron microscopy, the effects of antibacterial activity were significant. The results showed that the response surface analysis to optimization of extraction process of flavonoid from DLF was quite reasonable.

Key words:response surface analysis; Dicranostigma leptopodum(maxim.)Fedde; flavonoid

[收稿日期]2015-09-14

[基金項(xiàng)目]2013年國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31360603)。

[作者簡介]趙強(qiáng)(1982-)，男，甘肅天水人，博士，高級(jí)工程師。研究方向?yàn)槲鞅碧厣鷳B(tài)經(jīng)濟(jì)動(dòng)植物資源開發(fā)與利用。

[中圖分類號(hào)]S 859.7999

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1004-6704(2016)01-0004-09