高鵬，丁健，張?jiān)S，趙玥，張猛，高敏杰，吳劍榮，詹曉北

江南大學(xué) 生物工程學(xué)院 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122

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乙醇脅迫抑制畢赤酵母表達(dá)外源蛋白的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析

高鵬，丁健，張?jiān)S，趙玥，張猛，高敏杰，吳劍榮，詹曉北

江南大學(xué) 生物工程學(xué)院 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122

高鵬，丁健，張?jiān)S, 等. 乙醇脅迫抑制畢赤酵母表達(dá)外源蛋白的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析. 生物工程學(xué)報(bào), 2016, 32(5): 584–598.

Gao P, Ding J, Zhang X, et al. Transcriptome analysis of Pichia pastoris in response to ethanol stress. Chin J Biotech, 2016, 32(5): 584–598.

摘 要:在5 L發(fā)酵罐中進(jìn)行畢赤酵母發(fā)酵表達(dá)豬a干擾素的實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)甘油培養(yǎng)末期乙醇的積累會抑制外源蛋白的表達(dá)。從轉(zhuǎn)錄組學(xué)角度系統(tǒng)分析不同濃度乙醇脅迫條件下，畢赤酵母甘油培養(yǎng)期和甲醇誘導(dǎo)期細(xì)胞的生理狀態(tài)變化。研究結(jié)果表明，在甘油培養(yǎng)期，乙醇脅迫使得畢赤酵母細(xì)胞中的545個基因發(fā)生了顯著差異表達(dá)(265個基因表達(dá)上調(diào)，280個基因表達(dá)下調(diào))，這些差異表達(dá)基因的功能主要涉及蛋白質(zhì)合成、能量代謝、細(xì)胞周期和過氧化物酶代謝。乙醇脅迫增加了蛋白質(zhì)錯誤折疊的情況，降低了核糖體和線粒體的結(jié)構(gòu)完整性，使得甘油培養(yǎng)末期無法得到大量具有健全功能的酵母細(xì)胞。在甲醇誘導(dǎo)期，與甲醇代謝、蛋白質(zhì)加工合成、氨基酸代謝等途徑相關(guān)的294個基因發(fā)生了顯著差異表達(dá) (171個基因表達(dá)上調(diào)，123個基因表達(dá)下調(diào))，導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫不能被及時解除，破壞了細(xì)胞內(nèi)的氨基酸正常代謝。

關(guān)鍵詞:畢赤酵母，外源蛋白，乙醇脅迫，轉(zhuǎn)錄組學(xué)

Received: September 30, 2015; Accepted: December 21, 2015

Supported by: National Natural Science Foundation of China (No. 31301408), Natural Science Foundation of Jiangsu Province (No. BK20130122), China Postdoctoral Science Foundation (No. 2014M551501).

國家自然科學(xué)基金 (No. 31301408)，江蘇省自然科學(xué)基金 (No. BK20130122)，中國博士后科學(xué)基金 (No. 2014M551501) 資助。

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2016-01-05 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20160105.1432.001.html

甲醇營養(yǎng)型重組畢赤酵母 (Methylotrophic Pichia pastoris) 表達(dá)系統(tǒng)是20世紀(jì)80年代初開發(fā)和研制的一種新型酵母表達(dá)系統(tǒng)，近年來已成為極受青睞、應(yīng)用廣泛的外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)[1]。畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的廣泛應(yīng)用促使科學(xué)工作者對其生理狀態(tài)、發(fā)酵特性和過程控制策略進(jìn)行深入研究。目前通用的外源蛋白表達(dá)控制方法分成兩個階段：1) 甘油流加培養(yǎng)獲得高細(xì)胞密度；2) 甲醇流加誘導(dǎo)外源蛋白表達(dá)。

近年來，大量研究主要集中在第二階段 (誘導(dǎo)期) 甲醇濃度、甲醇流加方式和外部環(huán)境條件(溫度、溶解氧、pH、滲透壓等) 對細(xì)胞生理狀態(tài)和外源蛋白表達(dá)的影響等方面[2-4]。Zhu等[5]從轉(zhuǎn)錄水平分析了共混流加山梨醇和甲醇對外源蛋白表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)參與中心代謝的關(guān)鍵基因和參與蛋白折疊的兩個基因轉(zhuǎn)錄水平均有所提高，而目的基因和參與甲醛異化途徑的基因轉(zhuǎn)錄水平卻顯著下降。Baumann等[6]利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)等方法研究了畢赤酵母適應(yīng)低氧環(huán)境的分子機(jī)理，發(fā)現(xiàn)胞內(nèi)一些代謝途徑的基因表達(dá)機(jī)制不僅容易受到低氧環(huán)境的影響，而且對蛋白分泌也具有促進(jìn)作用。目前有研究表明：在第一階段的甘油培養(yǎng)期，如何大量獲取功能健全的細(xì)胞體也是外源蛋白高效表達(dá)的關(guān)鍵因素[7]。Wei等[8]采用指數(shù)流加的方式生產(chǎn)重組花鱸生長激素，將細(xì)胞比生長速率從0.05/h提高到0.16/h，并結(jié)合混合流加誘導(dǎo)策略，最終目的蛋白產(chǎn)量提高了69%，達(dá)到0.59 mg/g。本課題組提出了一種ANNPR-Ctrl甘油流加控制策略，將細(xì)胞濃度提高到了120 g/L，在甲醇單獨(dú)誘導(dǎo)條件下，最終外源蛋白豬a干擾素的濃度提高了50%，達(dá)到1.43 g/L[7]。

釀酒酵母中乙醇耐受性研究表明，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)的乙醇由于滲透壓的緣故無法分泌到胞外時，過高的乙醇濃度會對細(xì)胞結(jié)構(gòu)、線粒體中的酶活性和細(xì)胞質(zhì)膜的組分產(chǎn)生影響，最終抑制細(xì)胞的生長甚至引起細(xì)胞死亡[9]。在畢赤酵母發(fā)酵過程中，相關(guān)研究表明副產(chǎn)物乙醇的積累會抑制醇氧化酶啟動子的誘導(dǎo)啟動和外源蛋白的表達(dá)，但一般認(rèn)為只要在誘導(dǎo)前采用“饑餓”培養(yǎng)的方法耗盡乙醇，后續(xù)的誘導(dǎo)過程就可以正常進(jìn)行[10]。長時間、高濃度的乙醇脅迫會不會對畢赤酵母細(xì)胞結(jié)構(gòu)和生理狀態(tài)造成不可逆轉(zhuǎn)的影響還不明確，相關(guān)文獻(xiàn)也未見報(bào)道。

本文以1株產(chǎn)豬a干擾素的畢赤酵母Pichia pastoris KM71H為研究對象，發(fā)現(xiàn)只要乙醇的積累曾經(jīng)達(dá)到高濃度 (>4 g/L)，并維持一段時間，即使誘導(dǎo)期前乙醇完全耗盡，誘導(dǎo)過程也不能正常進(jìn)行。進(jìn)一步從轉(zhuǎn)錄組學(xué)角度系統(tǒng)分析了乙醇脅迫抑制畢赤酵母表達(dá)外源蛋白的分子機(jī)制，為發(fā)酵過程控制提供了重要的理論依據(jù)，豐富了微生物細(xì)胞脅迫響應(yīng)的研究體系。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株

由上海農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)所重點(diǎn)研究室構(gòu)建的重組巴斯德畢赤酵母Pichia pastoris，KM71和MutS菌株。表達(dá)載體和外源基因分別為pPICZaA和IFNa cDNA。

1.1.2培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基 (g/L)：酵母粉10，葡萄糖20，蛋白胨20。

發(fā)酵罐初始培養(yǎng)基 (g/L)：甘油20 mL/L，K2SO41，MgSO41，CaSO40.1，(NH4)2SO45，PTM110 mL/L，H3PO42% (V/V)，pH 6.0。

甘油流加培養(yǎng)基 (g/L)：甘油500 mL/L，(NH4)2SO40.5，MgSO40.03，PTM110 mL/L，KH2PO40.5，pH 6.0。

誘導(dǎo)流加培養(yǎng)基 (g/L)：甲醇500 mL/L，(NH4)2SO40.5，MgSO40.03，PTM110 mL/L，KH2PO40.5，pH 5.5。

山梨醇流加培養(yǎng)基 (g/L)：山梨醇500。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與豬a干擾素的誘導(dǎo)表達(dá)方法

發(fā)酵實(shí)驗(yàn)在5 L發(fā)酵罐內(nèi)進(jìn)行，接種量為20%，初始體積為1.5 L。畢赤酵母發(fā)酵生產(chǎn)豬a干擾素的過程主要由甘油培養(yǎng)階段和誘導(dǎo)表達(dá)階段組成。甘油培養(yǎng)階段采用ANNPR-Ctrl流加策略控制甘油培養(yǎng)基的流加，培養(yǎng)溫度為30 ℃，pH 為6.0，直至細(xì)胞密度增至120–130 g DCW/L時，停止流加。經(jīng)過1–2 h的饑餓培養(yǎng)，待甘油以及其他可以充當(dāng)替代碳源的中間代謝物耗盡后開始流加甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)基，進(jìn)入誘導(dǎo)階段。在誘導(dǎo)階段，根據(jù)甲醇電極讀數(shù)人工調(diào)節(jié)蠕動泵轉(zhuǎn)速，將發(fā)酵液中的甲醇濃度控制于5 g/L，同時按照一定體積比 (甲醇流加培養(yǎng)基∶山梨醇流加培養(yǎng)基=1∶1) 添加山梨醇流加培養(yǎng)基。使用壓縮空氣供氧，始終維持最大的攪拌轉(zhuǎn)速，溫度和pH值分別控制在30 ℃和5.5。

1.2.2乙醇和甲醇濃度測定

商用的膜滲透型甲醇電極 (上海蘇泊公司，F(xiàn)C2002) 可以對乙醇和甲醇這一類揮發(fā)性的小分子有機(jī)物產(chǎn)生響應(yīng)，其響應(yīng)電壓與有機(jī)物濃度存在二次曲線型的數(shù)量關(guān)系。利用不同濃度的甲醇和乙醇標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別擬合出描述電極輸出電壓與乙醇/甲醇濃度之間數(shù)量關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線。在細(xì)胞培養(yǎng)階段和誘導(dǎo)階段，根據(jù)電極的輸出電壓，分別利用各自的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到乙醇和甲醇的濃度。

1.2.3甘油流加控制策略

控制方法與參考文獻(xiàn)[7]相同。

1.2.4菌濃度測定

測量方法與參考文獻(xiàn)[11]相同。

1.2.5豬a干擾素濃度測定

SDS-PAGE蛋白電泳：使用6%的濃縮膠和12%的分離膠。使用G:Box生物成像系統(tǒng)拍照后，利用QuantityOne軟件掃描電泳條帶，定量分析豬a干擾素濃度。

1.2.6總蛋白濃度測定

采用考馬斯亮藍(lán)法測定發(fā)酵液中的總蛋白濃度，操作步驟與參考文獻(xiàn)[4]相同。

1.2.7乙醇和甲醇濃度的離線測定

乙醇和甲醇濃度使用氣相色譜儀測定，色譜條件與參考文獻(xiàn)[12]相同。

1.2.8畢赤酵母乙醇脅迫條件下基因表達(dá)差異的研究

在畢赤酵母細(xì)胞甘油培養(yǎng)27 h及誘導(dǎo)培養(yǎng)12 h后分別8 000 r/min 離心收集菌體，用無菌水洗滌1 次，在液氮中速凍10 min 以上，?80 ℃保存?zhèn)溆?。采用酵母基因芯?(8×15 K，Agilent Technologies) 測定基因表達(dá)的差異，RNA 抽提、芯片雜交、掃描以及數(shù)據(jù)分析與參考文獻(xiàn)[13]相同。所有芯片的表達(dá)數(shù)據(jù)均為處于高濃度乙醇 (4–8 g/L) 積累條件下與低濃度乙醇(0–2 g/L)積累條件下的兩個樣品的比值，如果Fold change≥1.5，并且P-value≤0.05的基因認(rèn)為是差異表達(dá)基因。

1.2.9甲醇代謝關(guān)鍵酶基因轉(zhuǎn)錄水平的測定

甲醇代謝途徑中的關(guān)鍵酶包括醇氧化酶(Aox)、甲醛脫氫酶 (Fld)、二羥基丙酮酸合成酶 (Dhas) 和H2O2酶 (Cat)，分別由aox2、fld1、das2以及cat1基因編碼，基因轉(zhuǎn)錄水平的測定方法與文獻(xiàn)報(bào)道[12]相同。

2　結(jié)果與分析

2.1乙醇脅迫對畢赤酵母表達(dá)豬a干擾素的影響

在5 L發(fā)酵罐中進(jìn)行畢赤酵母表達(dá)豬a干擾素實(shí)驗(yàn)，甘油培養(yǎng)期采用ANNPR-Ctrl控制策略流加甘油，甲醇誘導(dǎo)期使用甲醇/山梨醇共混流加策略 (甲醇/山梨醇培養(yǎng)基流加體積比1∶1)進(jìn)行誘導(dǎo)。發(fā)酵批次1到3在細(xì)胞密度達(dá)到130 g DCW/L左右時開始誘導(dǎo)，批次4則在細(xì)胞密度達(dá)到100 g DCW/L左右時開始誘導(dǎo)，圖1顯示了4個發(fā)酵批次的總蛋白表達(dá)量及甘油培養(yǎng)期乙醇濃度分別隨時間變化的情況。其中批次1、2和4在誘導(dǎo)70 h后結(jié)束發(fā)酵，而批次3由于細(xì)胞失去代謝活性，DO始終居高不下、耗氧速度OUR?0、甲醇基本不消耗，發(fā)酵被迫在誘導(dǎo)13 h終止。

如圖1A所示，批次1到4的最高總蛋白表達(dá)量分別達(dá)到30.85、15.31、9.38和17 mg/g DCW的水平。與之相對應(yīng)的，批次1到4中的豬a干擾素表達(dá)量分別為16.54、10.38、0.85和12.6 mg/g DCW的水平。批次1的總蛋白和豬a干擾素表達(dá)量均高于批次4，表明在甘油培養(yǎng)期結(jié)束時獲得極高的細(xì)胞密度的確有助于畢赤酵母表達(dá)外源蛋白。批次1、2和3相比較，雖然三者在甘油培養(yǎng)期結(jié)束時的細(xì)胞密度相同，但總蛋白和豬a干擾素表達(dá)量存在顯著差別，表明極高細(xì)胞密度下的發(fā)酵穩(wěn)定性較差。因?yàn)榕?到批次3的甲醇誘導(dǎo)條件完全相同，所以甘油流加培養(yǎng)階段的差異是造成3個批次發(fā)酵性能存在差異的主要原因。

圖1　不同發(fā)酵批次下總蛋白表達(dá)量和乙醇濃度的變化情況Fig. 1 Total protein expressions and ethanol concentrations during cultivation phase under different fermentation batches. (A) Total protein expressions during induction phase. (B) Ethanol concentrations during cultivation phase.

對4個批次的甘油流加速率、流加數(shù)量以及流加培養(yǎng)末期的乙醇積累情況進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)三者在不同批次中均存在差別，尤其是甘油培養(yǎng)末期的乙醇積累情況差異顯著。如圖1B所示，4個批次的流加培養(yǎng)末期均伴隨有乙醇的生成積累。在批次4中，乙醇幾乎不積累，最大乙醇濃度只有1.2 g/L；在批次1中，乙醇從誘導(dǎo)開始前6 h開始積累，最大乙醇濃度為4.29 g/L；在批次3中，乙醇開始積累的時間較早，誘導(dǎo)前7.5 h其濃度既已達(dá)到4.77 g/L，誘導(dǎo)前3.5 h更是高達(dá)6.95 g/L，且在高乙醇濃度環(huán)境下維持了較長時間。所有4個批次積累的乙醇均可以作為替代碳源，在“饑餓培養(yǎng)”期得到完全消耗，誘導(dǎo)開始時其濃度均降低到0水平。

分析乙醇積累的原因，可能是由于細(xì)胞培養(yǎng)階段的甘油流加速度不適宜，發(fā)酵液中積累了過量的碳源，DO水平在大部分時間間隔內(nèi)處于接近0的水平，培養(yǎng)體系處于厭氧狀態(tài)，結(jié)果導(dǎo)致有害代謝副產(chǎn)物乙醇的積累。乙醇長時間、高濃度的積累，可能對畢赤酵母的功能性細(xì)胞骨架/結(jié)構(gòu)的形成產(chǎn)生了不可逆轉(zhuǎn)的破壞作用，最終影響后續(xù)外源蛋白的表達(dá)。

為進(jìn)一步驗(yàn)證乙醇脅迫影響了畢赤酵母發(fā)酵穩(wěn)定性的結(jié)論，我們在誘導(dǎo)前8 h刻意添加乙醇，將發(fā)酵液內(nèi)的乙醇濃度瞬間提高至6 g/L，然后維持乙醇濃度在4 g/L以上至少4 h，最后使用與發(fā)酵批次1到3相同的甲醇/山梨醇共混流加策略進(jìn)行誘導(dǎo)。結(jié)果顯示，進(jìn)入誘導(dǎo)階段后，DO始終維持在高水平，OUR以及甲醇消耗速率極低，誘導(dǎo)20 h后細(xì)胞活性仍無法恢復(fù)，發(fā)酵被迫結(jié)束。該實(shí)驗(yàn)批次的最大總蛋白表達(dá)量為5.92 mg/g DCW，最大豬a干擾素表達(dá)量只有2.46 mg/g DCW，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與批次3類似。該結(jié)果進(jìn)一步證明了乙醇脅迫抑制畢赤酵母表達(dá)外源蛋白，影響發(fā)酵穩(wěn)定性的結(jié)論。目前，乙醇脅迫抑制畢赤酵母表達(dá)外源蛋白的分子機(jī)制還不得而知。因此，本課題組從轉(zhuǎn)錄組學(xué)角度對該分子機(jī)制進(jìn)行了系統(tǒng)分析，為外部環(huán)境控制提供重要的理論依據(jù)。

作為四大文明古國之一，公元前2500年有了印度河文明，前1500年亞利安人進(jìn)入南亞次大陸，征服古印度人，確立了種姓制度，它的荼毒至今仍深刻的影響著印度社會，前4世紀(jì)，孔雀王朝統(tǒng)一印度，推行佛教，公元1600年英國入侵莫臥兒帝國，在1947年實(shí)行印巴分治。在經(jīng)歷了羅摩衍那的輝煌到近代殖民的傷痕，起起落落導(dǎo)致一段時間與世界的斷檔使得我們談起印度，只知道最大的貧民窟在孟買，食物只知道咖喱。

2.2乙醇脅迫條件下的基因表達(dá)差異

為研究不同濃度乙醇脅迫條件下畢赤酵母細(xì)胞中的基因表達(dá)差異，解析畢赤酵母代謝表達(dá)差異的原因，提取畢赤酵母在誘導(dǎo)開始前4 h(即甘油培養(yǎng)期27 h左右) 及誘導(dǎo)開始后12 h的酵母胞內(nèi)RNA作轉(zhuǎn)錄組分析，共得到4組RNA樣品。G1和G2樣品分別來自于誘導(dǎo)開始前4 h的發(fā)酵批次1和3，M1和M2號樣品分別來自于誘導(dǎo)開始后12 h的發(fā)酵批次1和3 (表1)。

基因芯片比較結(jié)果顯示，在甘油培養(yǎng)末期的G1和G2樣品間，差異表達(dá)基因數(shù)量為545 個 (上調(diào)表達(dá)的265個，下調(diào)表達(dá)的280個)；在處于甲醇誘導(dǎo)期的M1和M2樣品間，差異表達(dá)基因數(shù)量為294個 (上調(diào)表達(dá)的171個，下調(diào)表達(dá)的123個)。

對G1和G2兩個樣本間的差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG Pathway功能差異富集分析，符合P-value≤0.05則被定義為顯著性差異富集的信號代謝通路，結(jié)果如表2所示。由表2可知，大量的蛋白質(zhì)加工合成相關(guān)基因、酵母細(xì)胞周期相關(guān)基因和能量代謝相關(guān)基因參與了畢赤酵母乙醇脅迫的響應(yīng)調(diào)控，它們調(diào)節(jié)著畢赤酵母細(xì)胞的增殖、蛋白的合成以及能量的供應(yīng)，對提高畢赤酵母乙醇耐受性具有重要意義。

表1　樣品編號及乙醇濃度范圍Table 1 Sample codes and ethanol concentration ranges

表2　甘油培養(yǎng)期樣品間KEGG Pathway功能差異富集分析Table 2 KEGG pathway enrichment analysis between two samples during glycerol cultivation phase

表3　甲醇誘導(dǎo)期樣品間KEGG Pathway功能差異富集分析Table 3 KEGG pathway enrichment analysis between two samples during induction phase

對M1和M2兩個樣本間的差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG Pathway功能差異富集分析，符合P-value≤0.05則被定義為顯著性差異富集的信號代謝通路，結(jié)果如表3所示。富集結(jié)果與甘油培養(yǎng)期類似，表明蛋白質(zhì)加工合成相關(guān)基因和能量代謝相關(guān)基因不僅參與了畢赤酵母細(xì)胞乙醇脅迫的響應(yīng)調(diào)控，也對畢赤酵母表達(dá)外源蛋白具有重要作用。因此，對這些代謝通路展開深入的研究對于揭示乙醇脅迫抑制畢赤酵母表達(dá)外源蛋白的分子機(jī)理具有重要意義。

2.3基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的甘油培養(yǎng)期乙醇脅迫分子機(jī)制

2.3.1蛋白質(zhì)生物合成代謝途徑

蛋白質(zhì)是生物活性物質(zhì)中最重要的大分子成分，作為生物功能的載體，酵母細(xì)胞內(nèi)重要的生理活動都是由蛋白質(zhì)來完成的。通過分析甘油培養(yǎng)期的G1和G2兩個樣品的差異表達(dá)基因，我們發(fā)現(xiàn)在乙醇脅迫下，畢赤酵母細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)生物合成途徑受到了明顯影響。與蛋白質(zhì)生物合成相關(guān)的差異表達(dá)基因共有27個(表4)，這些基因主要參與核糖體、核糖體生物合成以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工3個代謝途徑。

核糖體是真核生物細(xì)胞的重要細(xì)胞器，由40S亞基、60S亞基和4種RNA組成，執(zhí)行蛋白質(zhì)合成的功能。由表4可知，與核糖體有關(guān)的差異基因在乙醇脅迫下均下調(diào)。核糖體蛋白是核糖體的重要組成成分。研究發(fā)現(xiàn)核糖體蛋白除了參與蛋白質(zhì)的合成外，還參與細(xì)胞分化、細(xì)胞發(fā)育調(diào)控、DNA修復(fù)等過程，在真核生物的生長發(fā)育過程中起到了至關(guān)重要的作用[14]。核糖體相關(guān)基因的顯著下調(diào)表明乙醇脅迫阻礙了畢赤酵母細(xì)胞內(nèi)核糖體的正常合成，破壞了核糖體的結(jié)構(gòu)。重要核糖體蛋白的缺失，使得細(xì)胞內(nèi)核糖體的數(shù)量和質(zhì)量都顯著下降，酵母細(xì)胞增殖減緩并且更易死亡，這些是導(dǎo)致甲醇誘導(dǎo)期外源蛋白低產(chǎn)量的重要原因。

與核糖體生物合成有關(guān)的差異基因在乙醇脅迫下也是下調(diào)的，并且這些基因的功能都與核糖體內(nèi)行使功能的主體RNA有關(guān)。其中，afg2參與水解ATP和降解異常的mRNA，它的下調(diào)會降低細(xì)胞正確折疊蛋白的能力，并提高核糖體翻譯錯誤多肽鏈的情況[15]。rnt1具有核糖核酸酶活性，在前體RNA加工過程中不可或缺[9]；utp5是具有加工前體rRNA活性的復(fù)合物的組成部分，參與核仁內(nèi)18S rRNA的合成以及核糖體小亞基的裝配過程[16]。rnt1和utp5這兩種基因表達(dá)量的不足，會阻礙前體rRNA的加工，抑制多肽鏈的合成。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是酵母細(xì)胞的重要細(xì)胞器。與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白質(zhì)加工過程有關(guān)的差異基因在乙醇脅迫下都上調(diào)，其中hsp26基因上調(diào)較為顯著。hsp26和hsp82編碼熱激蛋白，該蛋白在蛋白質(zhì)的組裝和運(yùn)輸中起著非常重要的作用[17]。ssa3、ssa4和sse2屬于熱激蛋白中的HSP70家族，該家族的基因參與非折疊蛋白應(yīng)答 (UPR) 過程，在細(xì)胞內(nèi)起著抗凋亡的作用[18]。hsp26等基因的上調(diào)說明乙醇脅迫使得畢赤酵母細(xì)胞蛋白的正確折疊能力下降，不正常折疊情況增多，大量不具有正常功能的錯誤蛋白形成了聚集，抑制了畢赤酵母的正常生長及代謝。如果乙醇脅迫持續(xù)存在或是比較嚴(yán)重，那么UPR過程也不能修復(fù)細(xì)胞的正常功能，這就會誘發(fā)細(xì)胞的凋亡[19]。結(jié)果使得我們在甘油培養(yǎng)末期得不到大量的具有健全功能的酵母細(xì)胞，導(dǎo)致甲醇誘導(dǎo)期外源蛋白產(chǎn)生低產(chǎn)量的情況。

2.3.2能量代謝途徑

表4　甘油培養(yǎng)期與蛋白質(zhì)生物合成相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平分析Table 4 Transcriptional analysis of genes related to protein synthesis during glycerol cultivation phase

酵母細(xì)胞的生長、發(fā)育，包括核酸、蛋白質(zhì)的合成，生物膜的傳遞以及運(yùn)輸功能等，都需要消耗能量。在乙醇脅迫下，一些與能量代謝相關(guān)的基因表達(dá)量產(chǎn)生了顯著差異 (表5)，這些基因主要與線粒體降解、磷酸戊糖途徑有關(guān)，其轉(zhuǎn)錄水平均上調(diào)。其中，yil165c具有水解酶活性，突變體表現(xiàn)為線粒體自噬缺陷。yor019w參與線粒體自噬過程，在線粒體質(zhì)量控制方面具有重要作用[20]。yil165c和yor019w的顯著上調(diào)說明乙醇脅迫與線粒體的質(zhì)量下降有關(guān)。乙醇脅迫導(dǎo)致線粒體內(nèi)活性氧大量積累，線粒體的結(jié)構(gòu)功能受到損害，激活了線粒體的自噬過程。磷酸戊糖途徑具有為細(xì)胞的各種合成反應(yīng)提供還原劑、防止膜脂過氧化、為細(xì)胞組分的合成提供原料等功能。該途徑對于細(xì)胞抵抗氧化等微生物生理脅迫具有重要的保護(hù)作用[21-22]。gdb1、ima3、gnd2、nqm1和sol4基因的上調(diào)表明乙醇脅迫下，磷酸戊糖途徑對畢赤酵母細(xì)胞同樣具有重要的保護(hù)作用。

2.3.3細(xì)胞周期代謝途徑

許多與細(xì)胞周期相關(guān)的基因表達(dá)量也具有顯著差異，如表6所示。當(dāng)受到乙醇脅迫時，與酵母分裂密切相關(guān)的cyr1和mnd2基因上調(diào)，cdh1等7個與酵母細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)量均下調(diào)。研究表明，在cyr1突變后酵母的時序壽命增加，相應(yīng)的對抗H2O2和熱能力加強(qiáng)；但在乙醇培養(yǎng)基中生長緩慢，熒光標(biāo)記實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)與野生菌相比，cyr1突變菌的線粒體膜有更好的完整性。mnd2基因上調(diào)說明乙醇脅迫減弱了細(xì)胞內(nèi)姐妹染色單體凝聚力，而cyr1基因上調(diào)應(yīng)該就與細(xì)胞消耗乙醇有關(guān)。但是在消耗乙醇的同時，卻降低了自身對H2O2和熱的抵抗能力；細(xì)胞的時序壽命也大為減少，酵母細(xì)胞的生存時間縮短。細(xì)胞周期是指從親代細(xì)胞分裂結(jié)束到其子細(xì)胞分裂結(jié)束之間的時間間隔，即細(xì)胞完成一個循環(huán)的過程。酵母細(xì)胞分裂的正常進(jìn)行依賴細(xì)胞周期各個進(jìn)程的基因產(chǎn)物功能的正常發(fā)揮。cdh1等基因所編碼的細(xì)胞周期蛋白等產(chǎn)物在細(xì)胞周期的各個進(jìn)程中起著關(guān)鍵的作用，這些基因表達(dá)量的下調(diào)表明乙醇脅迫抑制了酵母細(xì)胞周期的順利進(jìn)行。

2.3.4過氧化物酶代謝途徑

表5　甘油培養(yǎng)期與能量代謝相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平分析Table 5 Transcriptional analysis of genes related to energy metabolism during glycerol cultivation phase

乙醇脅迫下，一些與過氧化物酶相關(guān)的基因表達(dá)量也具有顯著差異。過氧化物酶與降低氧氣對機(jī)體的毒害作用有直接聯(lián)系，并在細(xì)胞膜磷脂合成和降解中發(fā)揮重要作用[23]。如表7所示，當(dāng)受到乙醇脅迫時，這些基因均上調(diào)。其中cta1表達(dá)量提高了幾乎2倍，這可能是因?yàn)橐掖济{迫引起了細(xì)胞內(nèi)H2O2的過量積累。而H2O2如果不能及時被清除，一方面由H2O2生成的羥基自由基對細(xì)胞會造成毒害；另一方面，H2O2積累也會導(dǎo)致機(jī)體不能有效控制細(xì)胞膜磷脂合成，結(jié)果酵母細(xì)胞對乙醇產(chǎn)生敏感性。研究發(fā)現(xiàn)敲除與過氧化物酶的功能有關(guān)的基因，包括pex12、pex14和pex15等，都會導(dǎo)致釀酒酵母乙醇敏感性的增加[24-25]。因此，cta1等基因表達(dá)量的上調(diào)有助于降低畢赤酵母對乙醇的敏感性。過氧化物酶體是真核細(xì)胞中重要的細(xì)胞器，pex13和pxa1的上調(diào)說明過氧化物酶體生物合成與酵母細(xì)胞響應(yīng)乙醇脅迫有關(guān)。當(dāng)細(xì)胞處于依賴乙醇生存的壓力條件下時，sym1編碼的蛋白在維持細(xì)胞內(nèi)氧化磷酸化過程、糖原貯存、線粒體形態(tài)以及mtDNA穩(wěn)定上具有關(guān)鍵作用，該基因上調(diào)說明細(xì)胞為了緩解乙醇脅迫的壓力，開始消耗乙醇作為碳源維持自身的生長。

表6　甘油培養(yǎng)期與細(xì)胞周期相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平分析Table 6 Transcriptional analysis of genes related to cell cycle during glycerol cultivation phase

表7　甘油培養(yǎng)期與過氧化物酶相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平分析Table 7 Transcriptional analysis of genes related to peroxisome during glycerol cultivation phase

2.4基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的甲醇誘導(dǎo)期乙醇脅迫分子機(jī)制

2.4.1甲醇代謝途徑

在甲醇誘導(dǎo)期，M1和M2樣品間甲醇代謝途徑中各關(guān)鍵酶 (Aox、Fld、Cat以及Dhas) 的編碼基因轉(zhuǎn)錄水平存在顯著差異，結(jié)果如表8所示。上述各關(guān)鍵酶在甲醇代謝途徑中的作用如圖2所示。結(jié)果表明，甘油培養(yǎng)期的乙醇脅迫會對aox2基因的轉(zhuǎn)錄造成不可逆的抑制作用，該抑制作用是細(xì)胞培養(yǎng)階段乙醇積累降低pIFN-α發(fā)酵穩(wěn)定性的主要原因。M2號樣品中aox2基因的轉(zhuǎn)錄水平僅達(dá)到M1樣品的22%，而fld1、cat1和das2的轉(zhuǎn)錄水平卻可以達(dá)到M1樣品的40%左右。由此可見，相對于aox2基因，乙醇對fld1、cat1和das2轉(zhuǎn)錄造成的影響較小。

表8　甲醇誘導(dǎo)期與甲醇代謝相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平分析Table 8 Transcriptional analysis of genes related to methanol metabolism during methanol induction phase

圖2　甲醇代謝中關(guān)鍵酶作用示意簡圖Fig. 2 Simplified methanol metabolism map indicating the functions of key enzymes.

2.4.2蛋白質(zhì)生物合成代謝途徑

如前所述，蛋白質(zhì)是生物活性物質(zhì)中最重要的大分子成分，是生物功能的載體。甲醇誘導(dǎo)期外源蛋白的高表達(dá)取決于畢赤酵母細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成加工的高效有序進(jìn)行。雖然畢赤酵母細(xì)胞在甲醇誘導(dǎo)期沒有直接受到乙醇的脅迫，但是許多與蛋白質(zhì)加工合成有關(guān)的基因，特別是蛋白質(zhì)折疊、降解有關(guān)的基因表達(dá)量依然產(chǎn)生了顯著差異 (表9)。hsp26、hsp82、ssa1、ssa2和ssa4與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白質(zhì)加工過程有關(guān)，這些基因基本呈下調(diào)趨勢。比較甲醇誘導(dǎo)期和甘油培養(yǎng)期的差異基因表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)兩者的基因類別相差不大，但是基因的調(diào)控水平卻正好相反。誘導(dǎo)期這些相關(guān)基因的低表達(dá)量會抑制非折疊蛋白應(yīng)答過程，使得內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的未折疊蛋白持續(xù)積累而不能被及時清除，細(xì)胞更易遭受多種因子誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性，這些結(jié)果應(yīng)該是導(dǎo)致甲醇誘導(dǎo)期外源蛋白產(chǎn)量顯著下降的直接原因。

泛素是一種存在于大多數(shù)真核細(xì)胞中的小蛋白，它的主要功能是標(biāo)記需要分解掉的蛋白質(zhì)，使其被水解[26]。泛素蛋白酶體系統(tǒng)是降解細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的主要途徑。細(xì)胞中的蛋白質(zhì)處于不斷地降解與更新的過程中，保持細(xì)胞正常的蛋白質(zhì)代謝對于生命的正常功能至關(guān)重要。與泛素介導(dǎo)的蛋白水解有關(guān)的差異基因包括apc9、uba3、ubc12和ubc8等，如表9所示。其中，apc9編碼后期促進(jìn)因子 (APC) 的重要組成部分。uba3編碼Nedd8激活蛋白。ubc12編碼Nedd8綴合蛋白。ubc8編碼E2泛素結(jié)合蛋白。在所有真核細(xì)胞中細(xì)胞的增殖均嚴(yán)格依賴于泛素連接酶 (E3) 有絲分裂后期促進(jìn)因子的活性，沒有APC的存在，細(xì)胞就不能分離姐妹染色單體，細(xì)胞增殖會被阻礙[27]。apc9的下調(diào)說明甲醇誘導(dǎo)期細(xì)胞的增殖被嚴(yán)重阻礙了。Nedd8是一種能夠?qū)Φ孜锏鞍走M(jìn)行修飾的類泛素蛋白。目前已知，Nedd8主要通過修飾Cullin蛋白而調(diào)控Cullin-RING E3連接酶的活性，進(jìn)而參與到細(xì)胞周期調(diào)控、轉(zhuǎn)錄與信號傳導(dǎo)等生物學(xué)過程[28]。uba3和ubc12的下調(diào)減少了Nedd8蛋白的合成，進(jìn)而給細(xì)胞周期、轉(zhuǎn)錄等生理過程帶來不利影響。ubc8直接參與泛素蛋白酶體系統(tǒng)，它的下調(diào)會抑制細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的降解。細(xì)胞中蛋白質(zhì)代謝緩慢會直接損害機(jī)體的正常功能。

表9　甲醇誘導(dǎo)期與蛋白質(zhì)生物合成相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平分析Table 9 Transcriptional analysis of genes related to protein synthesis during methanol induction phase

2.4.3 能量代謝途徑

在甲醇誘導(dǎo)期，一些與能量代謝相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄水平也產(chǎn)生了顯著差異，這些基因主要與糖酵解/葡萄糖異生作用有關(guān)，如表10所示。由表10中各基因的功能可以看出，adh5等相關(guān)基因在糖酵解/葡萄糖異生過程中起著重要的作用，這些基因的下調(diào)說明甲醇誘導(dǎo)期的糖酵解途徑被顯著抑制了。

2.4.4氨基酸代謝途徑

gcv2、hom2、ald3、gad1、adh5、dug1和gpx2等基因與氨基酸代謝密切相關(guān)，在甲醇誘導(dǎo)期這些基因的轉(zhuǎn)錄水平產(chǎn)生了顯著差異 (表11)。除了與谷胱甘肽代謝相關(guān)的基因上調(diào)之外，其他基因均下調(diào)。谷胱甘肽所含的谷氨酰胺鍵能維持分子的穩(wěn)定性并參與轉(zhuǎn)運(yùn)氨基酸[29]。因此，dug1和gpx2的上調(diào)對維持酵母細(xì)胞正常生理代謝包括表達(dá)外源蛋白具有積極的作用。氨基酸是構(gòu)成細(xì)胞內(nèi)各種蛋白質(zhì)的基本單位，某些氨基酸還參與一些特殊的代謝反應(yīng)，具有重要的特性。gcv2等基因的下調(diào)會破壞畢赤酵母細(xì)胞內(nèi)氨基酸的正常代謝，從而抑制外源蛋白的高效表達(dá)。

表10　甲醇誘導(dǎo)期與能量代謝相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平分析Table 10 Transcriptional analysis of genes related to energy metabolism during methanol induction phase

表11　甲醇誘導(dǎo)期與氨基酸代謝相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平分析Table 11 Transcriptional analysis of genes related to amino acid metabolism during methanol induction phase

3　討論

在利用畢赤酵母表達(dá)豬a干擾素的過程中，當(dāng)甘油培養(yǎng)期畢赤酵母細(xì)胞達(dá)到極高密度(130 g DCW/L) 時，外源蛋白豬a干擾素表達(dá)量最高達(dá)到16.54 mg/g DCW，但發(fā)酵過程穩(wěn)定性較差。如果甘油流加速度不適宜，或者培養(yǎng)體系長期處于厭氧狀態(tài)，代謝副產(chǎn)物乙醇就可能會大量積累。乙醇脅迫會顯著影響甲醇誘導(dǎo)過程的啟動效率，導(dǎo)致外源蛋白表達(dá)量下降，甚至誘導(dǎo)失敗。

進(jìn)一步采用轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)分析不同批次(高濃度乙醇積累和低濃度乙醇積累) 誘導(dǎo)效率出現(xiàn)顯著差異的原因。結(jié)果表明在甘油培養(yǎng)期，乙醇脅迫影響了畢赤酵母細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)加工合成、能量代謝等途徑的相關(guān)基因的表達(dá)，導(dǎo)致了細(xì)胞內(nèi)錯誤折疊蛋白增多，核糖體、線粒體結(jié)構(gòu)完整性下降，細(xì)胞更易死亡等問題，使得在甘油培養(yǎng)末期無法得到大量具有健全功能的細(xì)胞，影響了畢赤酵母在誘導(dǎo)期表達(dá)外源蛋白的穩(wěn)定性。在甲醇誘導(dǎo)期，細(xì)胞雖然沒有直接受到乙醇的脅迫，但是與甲醇代謝、蛋白質(zhì)加工合成、氨基酸代謝等途徑相關(guān)基因的表達(dá)量依然發(fā)生了顯著變化，導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫不能被及時解除，多種氨基酸不能正常代謝，直接導(dǎo)致外源蛋白表達(dá)的不穩(wěn)定。

本研究結(jié)果對于深入理解高細(xì)胞密度下的外源蛋白誘導(dǎo)啟動機(jī)制，建立高效穩(wěn)定的發(fā)酵過程在線控制系統(tǒng)具有重要意義。同時豐富了微生物細(xì)胞脅迫響應(yīng)的研究體系，有助于從系統(tǒng)生物工程的角度提升傳統(tǒng)發(fā)酵控制策略的內(nèi)涵。

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(本文責(zé)編 郝麗芳)

海洋生物技術(shù)

Transcriptome analysis of Pichia pastoris in response to ethanol stress

Peng Gao, Jian Ding, Xu Zhang, Yue Zhao, Meng Zhang, Minjie Gao, Jianrong Wu, and Xiaobei Zhan
Key Laboratory of Industrial Biotechnology of Ministry of Education, School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu, China

Abstract:Effective expression of pIFN-α in recombinant Pichia pastoris was conducted in a 5 L fermentor. Ethanol accumulation during the late glycerol feeding period inhibited heterologous protein expression. Comparative transcriptome analysis was thus performed to compare the gene transcription profiles of Pichia pastoris KM71H in high and low ethanol concentration environments. The results showed that during the glycerol cultivation stage, 545 genes (265 up-regulated and 280 down-regulated) were differentially expressed with ethanol stress. These genes were mainly involved in protein synthesis, energy metabolism, cell cycle and peroxisome metabolism. During the methanol induction stage, 294 genes (171 up-regulated and 123 down-regulated) were differentially expressed, which were mainly related to methanol metabolism, amino acid metabolism and protein synthesis. Ethanol stress increased protein misfolding and reduced structural integrity of ribosome and mitochondria during cultivation stage, and led to the failure of endoplasmic reticulum stress removal and damaged amino acid metabolism during induction stage in Pichia pastoris.

Keywords:Pichia pastoris, heterologous protein, ethanol stress, transcriptome

Corresponding authors: Jianrong Wu. Tel: +86-510-85197383; Fax: +86-510-85918299; E-mail: kinowu@jiangnan.edu.cn Minjie Gao. Tel: +86-510-85197383; Fax: +86-510-85918299; E-mail: jmgao@jiangnan.edu.cn