曾哲，任曉丹，楊晟

中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院 植物生理生態(tài)研究所 中國科學(xué)院合成生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上?！?00032

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基于基因組編輯技術(shù)的大片段克隆新策略

曾哲，任曉丹，楊晟

中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院 植物生理生態(tài)研究所 中國科學(xué)院合成生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海200032

曾哲, 任曉丹, 楊晟. 基于基因組編輯技術(shù)的大片段克隆新策略. 生物工程學(xué)報(bào), 2016, 32(4): 401–408.

Zeng Z, Ren XD, Yang S. New methods for cloning large gene clusters based on CRISPR/cas9. Chin J Biotech, 2016, 32(4): 401–408.

摘要:基因組大片段克隆技術(shù)是合成生物學(xué)研究領(lǐng)域關(guān)鍵的使能技術(shù)。傳統(tǒng)的大片段克隆技術(shù)獲取目的大片段的手段存在各種缺陷，比如隨機(jī)建庫克隆需要依靠高通量篩選；PCR難以擴(kuò)增10 kb以上片段，從小片段拼裝費(fèi)時(shí)費(fèi)力且突變率高；基于限制性酶切連接難以找到片段兩端適宜的限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)。最近全基因組合成等前沿研究創(chuàng)造了全新的高性能大片段克隆方法，比如CRISPR/cas9系統(tǒng)中cas9可識(shí)別并切割20 bp核酸序列解決了識(shí)別位點(diǎn)設(shè)計(jì)難題，可用來獲取任意目的基因片段；組合Gibson或者酵母偶聯(lián)重組技術(shù)組裝技術(shù)，可高效克隆大片段基因。本文將分類介紹基因組大片段克隆技術(shù)，并提出適用不同尺度大小基因克隆的技術(shù)選擇參考標(biāo)準(zhǔn)。

關(guān)鍵詞:大片段克隆，合成生物學(xué)，基因組編輯，Gibson組裝

Received: November 19, 2015; Accepted: January 22, 2016

Supported by: National Natural Science Foundation of China (No. 31170102).

國家自然科學(xué)基金 (No. 31170102) 資助。

1　應(yīng)用價(jià)值及意義

基因組大片段克隆是一項(xiàng)重要的合成生物學(xué)技術(shù)，在構(gòu)建高價(jià)值產(chǎn)物的工程菌株中更是不可或缺[1-3]?；蚪M大片段克隆技術(shù)已被廣泛運(yùn)用于抗菌藥物、生物燃料和高價(jià)值次級(jí)代謝產(chǎn)物等方面[4-7]；如在大腸桿菌中異源克隆表達(dá)生產(chǎn)青蒿酸[2]、在天藍(lán)鏈霉菌中克隆表達(dá)異源沉默基因獲得新型抗生素[8]、在產(chǎn)黃青霉菌Penicillium chrysogenum中克隆表達(dá)青霉素合成基因簇完成工業(yè)產(chǎn)量提升[9-10]等。表1列舉大片段克隆的成功實(shí)例。

表1　大片段基因克隆技術(shù)的應(yīng)用實(shí)例Table 1　Examples of large gene clusters cloning methods

基因克隆技術(shù)雖然經(jīng)過四十多年的發(fā)展，但這項(xiàng)技術(shù)仍存在一些局限，特別是對(duì)于大片段基因克隆[1,5]。大片段基因克隆主要包括目的基因片段的切割獲得或PCR擴(kuò)增獲得和目的基因片段的組裝及體內(nèi)克隆。其中目的大片段的組裝及體內(nèi)克隆已有Gibson組裝[20]和TAR酵母轉(zhuǎn)化偶聯(lián)重組[21]等多項(xiàng)有效技術(shù)手段；而目的大片段的獲得卻受限于傳統(tǒng)的限制性內(nèi)切酶切割獲得或者PCR擴(kuò)增等，這也是實(shí)現(xiàn)大片段基因克隆的“攔路虎”。

值得慶幸的是近年熱門的CRISPR-cas9系統(tǒng)中，“分子剪刀”cas9可特異性識(shí)別20個(gè)堿基并實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)切割[22-23]。因此，cas9已被成功開發(fā)用于切割獲取目的基因片段，并且組合了Gibson組裝或者TAR酵母轉(zhuǎn)化偶聯(lián)重組等技術(shù)[18-19,24]，這必將促進(jìn)基因組大片段克隆技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展。本文將區(qū)別于國內(nèi)現(xiàn)有CRISPR綜述，主要論述基于基因組編輯技術(shù)而發(fā)展的大片段克隆新策略。

2　分類介紹及評(píng)價(jià)

基因克隆技術(shù)經(jīng)過40多年的發(fā)展，早已形成多套技術(shù)手段。根據(jù)目的基因片段的獲得方式，可分為隨機(jī)建庫克隆、PCR擴(kuò)增和定點(diǎn)酶切3類 (圖1)；根據(jù)目的基因片段的組裝方式，可分為連接和重組兩類 (圖1)。以下將對(duì)此展開介紹克隆技術(shù)。

圖1　大片段克隆技術(shù)的分類介紹Fig. 1　The classification of cloning technology for large gene clusters. Cloning large clustersshould include the two steps, obtaining gene fragments and assembling them. Using Cas9 to cut genome and get an objective gene fragment is a new method for cloning large gene clusters.

隨機(jī)建庫克隆通過部分限制性內(nèi)切酶切割或者機(jī)械剪切力使基因組斷裂成合適大小的基因片段，再利用裝載質(zhì)粒組裝全部基因片段，最后導(dǎo)入至克隆宿主中大量復(fù)制[25]。因此，隨機(jī)建庫耗費(fèi)大量勞力，更是必須依賴高通量篩選方法將含有目的片段轉(zhuǎn)化子挑選出來，同時(shí)基因片段的完整性不確定[2]。

PCR擴(kuò)增需要依靠部分序列信息設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物，這是體外克隆基因的最簡便方法[25]。但是，PCR很難擴(kuò)增獲得10 kb以上片段，因?yàn)镈NA聚合酶體外擴(kuò)增活性受限于擴(kuò)增長度和擴(kuò)增片段的GC含量等。同時(shí)，PCR擴(kuò)增容易引入核苷酸點(diǎn)突變造成基因片段失真。利用PCR分級(jí)擴(kuò)增小片段再組裝獲得完整大片段的方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，并不是一種高效的克隆技術(shù)[1,26]。表2筆者羅列比較現(xiàn)有常見基因克隆技術(shù)的優(yōu)劣。

限制性內(nèi)切酶切割獲取目的片段很難在片段兩端選擇到合適的酶切位點(diǎn)。因?yàn)橄拗菩詢?nèi)切酶只識(shí)別6?8個(gè)堿基位點(diǎn)，在龐大的基因組上必然存在多個(gè)酶切位點(diǎn) (統(tǒng)計(jì)意義上，一個(gè)具有8 bp識(shí)別位點(diǎn)的限制性內(nèi)切酶在含有65 536個(gè)堿基的隨機(jī)序列內(nèi)將至少含有兩個(gè)識(shí)別位點(diǎn))，即我們很難在所需克隆的大片段兩端選取到合適的限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)[24,27]。

因此，我們希望有一項(xiàng)技術(shù)可以從基因組特異切割獲得目的片段。而近年來熱門的CRISPR/cas9系統(tǒng)中，來自化膿性鏈球菌的cas9核酸酶可與引導(dǎo)RNA (gRNA) 形成復(fù)合體識(shí)別20個(gè)核酸序列進(jìn)行切割，最終形成雙鏈DNA斷裂 (DSB)?？梢奵as9具有定點(diǎn)識(shí)別序列進(jìn)行切割的功能。cas9通過與gRNA形成復(fù)合體，早已被證實(shí)可具有體外切割活性；cas9復(fù)合物識(shí)別20個(gè)核酸序列，具有極強(qiáng)的位點(diǎn)識(shí)別特異性，遠(yuǎn)勝于限制性內(nèi)切酶的位點(diǎn)識(shí)別特異性。因此，cas9已被開發(fā)用于切割獲取目的基因片段，并且組合Gibson組裝或者TAR酵母轉(zhuǎn)化偶聯(lián)重組等技術(shù)，形成完整的大片段基因克隆技術(shù)。下文將對(duì)CRISPR/cas9組合TAR和CRISPR/cas9組合Gibson技術(shù)展開介紹。

表2　常見基因克隆技術(shù)的優(yōu)劣對(duì)比Table 2　Evaluation of common gene cloning techniques

3　優(yōu)化思路及策略

基于組合優(yōu)化的思路，科研人員通過在目的大片段的獲得和目的大片段的組裝兩個(gè)方面進(jìn)行技術(shù)組合優(yōu)化，已形成以下3種組合策略(圖2)：1) 限制性酶切組合同源質(zhì)粒骨架PCR；2) CRISPR/cas9組合TAR；3) CRISPR/cas9組合Gibson。

3.1限制性酶切組合同源質(zhì)粒骨架PCR

該項(xiàng)組合策略由清華大學(xué)陳國強(qiáng)課題組于2012年開發(fā)，即單鏈重復(fù)配對(duì)退火擴(kuò)增(Single-strand overlapping annealing, SSOA)[28]，該策略中的同源重組連接得益于張友明等2000年所開發(fā)的Red/ET同源重組系統(tǒng)[29]。同源重組連接需要依賴目的片段和用于克隆線性化質(zhì)粒骨架兩端的同源臂匹配；一般采用固定的克隆線性化質(zhì)粒骨架和通過大片段兩端PCR擴(kuò)增引物帶入少于50 bp的同源臂。但由于大片段很難通過PCR擴(kuò)增獲得，SSOA采用直接限制性內(nèi)切酶切割獲得片段，同時(shí)以大片段兩端為引物擴(kuò)增獲得與大片段同源匹配的克隆線性化質(zhì)粒骨架。簡單地說，原來同源重組連接難以通過PCR在大片段兩端加上同源臂，SSOA逆向通過PCR擴(kuò)增在質(zhì)粒骨架上加上大片段的同源臂。該方法操作流程詳見圖4。

該方法把原來大片段兩端難以擴(kuò)增加入質(zhì)粒骨架同源臂的難題轉(zhuǎn)化為可實(shí)行的擴(kuò)增質(zhì)粒骨架加入大片段兩端同源臂。SSOA可實(shí)現(xiàn)在大腸桿菌中完成小于28 kb的基因克隆。當(dāng)然該方法仍無法克服限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)特異性差的難題。

圖2　大片段基因克隆技術(shù)優(yōu)化策略操作示意[18-19,28]Fig. 2　Workflow of the optimized cloning strategies for large gene clusters[18-19,28].

3.2CRISPR/cas9+TAR

2015年初報(bào)道的CRISPR/cas9組合TAR的大片段克隆方法通過cas9復(fù)合體過夜體外切割基因組獲得特異性高的目的片段，然后直接將cas9切割產(chǎn)物和兩端帶有300 bp同源臂的細(xì)菌人工染色體 (BAC) 導(dǎo)入酵母，利用酵母較高的同源重組能力，最終完成將目的大片段與BAC連接[18]。帶有目的大片段的BAC通過篩選轉(zhuǎn)化子獲得。該方法利用cas9獲得特異性高的目的片段，減少假陽性轉(zhuǎn)化子，將原來TAR轉(zhuǎn)化子陽性率由2%提高至32%；實(shí)驗(yàn)耗時(shí)也壓縮至4 d。

3.3CRISPR/cas9+Gibson

2015年9月清華大學(xué)朱聽和中國科學(xué)院微生物研究所婁春波等聯(lián)合開發(fā)CRISPR/cas9組合Gibson的大片段克隆策略[19]。該方法通過將菌體固定在低熔點(diǎn)瓊脂糖膠內(nèi)，經(jīng)過裂解菌體和緩沖液清洗使菌體基因組存于低熔點(diǎn)膠內(nèi)。在低熔點(diǎn)膠環(huán)境下，cas9復(fù)合體體外過夜切割基因組獲得特異性高的目的片段，然后利用Gibson同源重組與PCR克隆獲得的質(zhì)粒骨架連接 (30 bp overlap)，導(dǎo)入大腸桿菌后可獲得轉(zhuǎn)化子。該方法成功克隆最大150 kb的目的片段，實(shí)驗(yàn)耗時(shí)也只需2 d。當(dāng)然cas9復(fù)合物切割獲得大片段基因也可在水溶液中操作，2015年4月發(fā)表于BioTechniques上的文章采用cas9在水溶液中切割并基于Gibson組裝，最終只能實(shí)現(xiàn)最大22 kb的基因克隆[24]。從大片段克隆尺度上看，cas9在水溶液中切割基因組明顯劣于低熔點(diǎn)膠內(nèi)切割基因組，低熔點(diǎn)膠制備基因組有助于保持基因組的完整性。

4　技術(shù)選擇參考標(biāo)準(zhǔn)

上文介紹多種大片段基因克隆技術(shù)，那么對(duì)于不同基因尺度，我們應(yīng)該如何選用以上技術(shù)呢？基于對(duì)以上技術(shù)的效率對(duì)比和筆者實(shí)驗(yàn)室的大片段克隆經(jīng)驗(yàn)[30]，我們提出以下選擇參考標(biāo)準(zhǔn) (圖3)。

圖3　基因組大片段克隆技術(shù)選擇參考標(biāo)準(zhǔn)Fig. 3　The choice criteria of cloning strategies for large gene clusters.

當(dāng)所需克隆基因簇小于15 kb時(shí)，首選PCR擴(kuò)增分段獲得小于5 kb的小片段，再利用同源重組連接將小片段拼裝成完整的目的片段。在放線菌屬等高GC含量的物種中，利用基因組模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，可加入5%的二甲基亞砜以降低PCR退火溫度。

當(dāng)所需克隆基因簇大于15 kb且小于25 kb時(shí)，可利用PCR分級(jí)擴(kuò)增獲得小片段，再利用Gibson逐級(jí)組裝[30]。在設(shè)計(jì)Gibson組裝兩端連接區(qū)時(shí)，應(yīng)該盡量選擇GC含量低的區(qū)域，以減少克隆載體自連的情況。

當(dāng)所需克隆基因簇大于25 kb時(shí)，應(yīng)當(dāng)選用CRISPR/cas9切割基因組獲得目的片段。而目的片段與克隆載體的連接及組裝可選擇Gibson或者TAR；其中Gibson組裝需要大于100 ng的目的片段且純度要求高，TAR組裝對(duì)目的片段的含量和純度沒有較高要求但轉(zhuǎn)化子陽性率較低。

因此，在進(jìn)行大片段基因克隆時(shí)，我們應(yīng)當(dāng)根據(jù)所需克隆基因片段的大小、GC含量和所獲得片段情況等選擇恰當(dāng)?shù)幕蚩寺〖夹g(shù)。

致謝：感謝中國科學(xué)院微生物研究所婁春波研究員在論文寫作中的寶貴意見及建議。

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(本文責(zé)編 陳宏宇)

New methods for cloning large gene clusters based on CRISPR/cas9

Zhe Zeng, Xiaodan Ren, and Sheng Yang
CAS Key Laboratory of Synthetic Biology, Institute of Plant Physiology and Ecology, Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences (CAS), Shanghai 200032, China

Abstract:Cloning of large genomic sequences is an enabling technology in synthetic biology. To obtain large gene fragments, traditional cloning methods are faced with various defects, for instance, random library cloning relies always on high-throughput screening. It is difficult to get gene fragments more than 10 kb by PCR amplification. Assembly of small fragments is labor intensive with high mutation rates. It is difficult to find suitable cleavage sites on the fragment ends byrestriction endonuclease. Recently genome-wide editing creates a new high-performance large fragments cloning methods. For example, CRISPR/cas9 system can identify and cut 20 bp nucleic acid sequences recognition sites used to obtain any desired gene fragments; if combined with Gibson or transformation associated recombination (TAR) assembly technology, these methods can efficiently clone large fragments. This article introduces large fragments cloning technology by classification, then proposes the choice criteria of methods for cloning gene fragments of different sizes.

Keywords:cloning large gene cluster, synthetic biology, CRISPR/cas9, Gibson assembly

DOI:10.13345/j.cjb.150491

Corresponding author:Sheng Yang. Tel/Fax: +86-21-54924175; E-mail: syang@sibs.ac.cn