遲艷紅, 陳華增, 楊翠華, 孫玉苗, 齊繼光, 劉光興, 王 瑋(. 青島海產(chǎn)博物館, 山東 青島 6600; . 中國(guó)科學(xué)院海洋研究所, 山東 青島 6607; . 中國(guó)海洋大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院, 山東 青島 6600)

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桃花水母的核糖體RNA基因ITS區(qū)序列分析及物種鑒定

遲艷紅1, 陳華增1, 楊翠華1, 孫玉苗2, 齊繼光1, 劉光興3, 王 瑋1
(1. 青島海產(chǎn)博物館, 山東 青島 266003; 2. 中國(guó)科學(xué)院海洋研究所, 山東 青島 266071; 3. 中國(guó)海洋大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院, 山東 青島 266100)

利用PCR擴(kuò)增和DNA測(cè)序技術(shù), 獲得了青島野外采集到的桃花水母(Craspedacusta) 核糖體RNA基因ITS區(qū)序列。序列比對(duì)以及系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示, 在青島采集到的桃花水母與索氏桃花水母(Craspedacusta sowerbyi)的ITS區(qū)序列相似度最高, 同源性在93%以上; 同時(shí), 在系統(tǒng)發(fā)育樹中也與索氏桃花水母聚為一支。研究結(jié)果表明, 青島采集到的桃花水母為索氏桃花水母, 這也是青島地區(qū)桃花水母的新記錄。

桃花水母(Craspedacusta); 核糖體RNA基因ITS區(qū); 基因克隆; 序列分析

[Foundation: Special Foundation of Science and Technology Basic Research (2012FY112200)]

桃花水母(Craspedacusta)是一類原始的無(wú)脊椎動(dòng)物, 隸屬于刺胞動(dòng)物門(Cnidaria)水螅綱(Hydrozoa)淡水水母目(Limnomedusae)笠水母科(Olindiidae) 桃花水母屬(Craspedacusta)。桃花水母不僅具有極高的觀賞價(jià)值, 且其作為生物進(jìn)化歷程中的關(guān)鍵物種,具有重要的研究?jī)r(jià)值。目前國(guó)內(nèi)外共記述桃花水母11種, 除最早發(fā)現(xiàn)于英國(guó)的索氏桃花水母(Craspedacusta sowerbyi, 1880)[1]和日本的伊氏桃花水母(Craspedacusta iseanum, 1922)[2]外, 其余9種均發(fā)現(xiàn)于中國(guó), 分別為宜昌桃花水母(Craspedacusta kawaii, 1907)[3]、中華桃花水母(Craspedacusta sinensis, 1939)[4]、樂山桃花水母(Craspedacusta kiatingi, 1939)[5]、杭州桃花水母(Craspedacusta hangzhouensis, 1980)[6]、信陽(yáng)桃花水母(Craspedacusta xinyangensis, 1980)[6-7]、四川桃花水母(Craspedacusta sichuanensis, 1984)[8]、秭歸桃花水母(Craspedacusta ziguiensis, 1985)[9]、楚雄桃花水母(Craspedacusta chuxionggensis, 2000)[10]和短手桃花水母(Craspedacusta brevinema, 2002)[11]。目前, 國(guó)內(nèi)專家主要通過依據(jù)桃花水母的外部形態(tài)特征對(duì)其進(jìn)行分類, 但由于桃花水母的形態(tài)會(huì)因發(fā)育時(shí)期、生活環(huán)境差異等因素而發(fā)生變化, 且對(duì)一些重要分類依據(jù)如觸手?jǐn)?shù)目、著生方式、刺絲囊排列方式、生殖腺形狀和顏色等特征缺乏明確的規(guī)范性描述, 從而給桃花水母的分類工作帶來了困難[12]。分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展為生物物種分類提供了高、精、準(zhǔn)的方法, 其中將聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction, PCR)技術(shù)和DNA測(cè)序分析技術(shù)結(jié)合應(yīng)用到生物分類中, 具有不受發(fā)育時(shí)期及環(huán)境差異的影響、準(zhǔn)確度高、多態(tài)性強(qiáng)等特點(diǎn),目前已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于生物物種的分類學(xué)研究領(lǐng)域當(dāng)中[13-14]。將生物的形態(tài)特征和DNA序列有效結(jié)合起來, 能夠達(dá)到更加精準(zhǔn)地鑒定生物物種的目的。

核糖體RNA基因(ribosomal RNA gene, 簡(jiǎn)稱rDNA)作為生物體重要遺傳物質(zhì), 其結(jié)構(gòu)由一個(gè)個(gè)串聯(lián)重復(fù)序列組成。序列自5′至3′依次為: 非轉(zhuǎn)錄區(qū)(non-transcribed sequence, NTS)、外部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(external transcribed spacer, ETS)、18S rDNA、內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)1 ( internal transcribed spacer, ITS1 )、5. 8S rDNA、內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)2( ITS2)和28S rDNA。核糖體RNA基因中的18S、5. 8S和28S序列在大部分生物中均具有較高的保守性, 而作為非編碼區(qū)的ITS區(qū), 其所承受的條件選擇壓力較小, 因此進(jìn)化速率較快, 核苷酸替換率較高, 能夠提供較為豐富的生物學(xué)變異信息, 該區(qū)域堿基的序列特征在不同物種當(dāng)中存在著較顯著的差異[15-17]。同時(shí), ITS區(qū)位于高度保守的18S、5. 8S和28S rDNA序列之間, 便于進(jìn)行引物的設(shè)計(jì)以完成對(duì)ITS區(qū)序列的PCR擴(kuò)增和DNA測(cè)序, 因此利用ITS區(qū)序列分析能夠方便有效地進(jìn)行物種分類鑒定。目前ITS區(qū)序列分析已普遍應(yīng)用于刺胞動(dòng)物物種的分類鑒定當(dāng)中[18-20]。本研究對(duì)在青島采集的桃花水母ITS區(qū)序列進(jìn)行了基因克隆和DNA測(cè)序, 并對(duì)所獲得的序列進(jìn)行相關(guān)生物信息學(xué)分析, 結(jié)合采集水母外部形態(tài)特征, 進(jìn)而完成桃花水母的物種分類鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)所用標(biāo)本是2013年8月采自青島市海爾工業(yè)園人工湖的水母, 保存于80%乙醇中。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 采集水母的外部形態(tài)特征觀察

利用體式顯微鏡對(duì)所采集水母首先進(jìn)行外部形態(tài)特征觀察, 如傘體形態(tài)、有無(wú)胃柄、觸手類型、輻管數(shù)目和位置、平衡囊類型、生殖腺形狀和位置、刺胞分布等, 初步確定采集水母的分類地位。

1.2.2 桃花水母總DNA的提取

從80%乙醇保存的水母樣本中隨機(jī)取出10只,經(jīng)酒精梯度過渡, ddH2O清洗數(shù)遍, 用無(wú)菌濾紙將水分充分吸干, 置于1.5 mL 高溫滅菌的離心管中。加入100 μL TE 緩沖液后, 用研磨棒將樣品充分研磨破碎, 再加入2% SDS和2.5 μL蛋白酶K, 置于65 ℃恒溫水浴鍋中2 h進(jìn)行完全消化。再經(jīng)酚-氯仿抽提兩次后利用無(wú)水乙醇進(jìn)行沉淀, 用70%乙醇漂洗2次后置于室溫下充分晾干, 最后加入TE緩沖液溶解DNA。所獲得的總DNA利用NanoDrop分光光度計(jì)進(jìn)行定量檢測(cè)分析, 再經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳, 確認(rèn)DNA完整無(wú)降解后, 置于–20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 引物的合成和PCR擴(kuò)增

根據(jù)GenBank 中已有的桃花水母ITS區(qū)序列,結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)確定擴(kuò)增目的基因序列的特異性引物,其正向引物為ITSC-F1(5′-GTCGTAACAAGGTTTC CGTAGG-3′), 反向引物為ITSC-R1(5′-GGTAGTCT TGCCTGATCTGAGG-3′)[21], 并由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。通過PCR擴(kuò)增獲得rDNA-ITS區(qū)序列目的片段。PCR反應(yīng)體系如下: l μL DNA模板, 1×reaction緩沖液, 1.5 mmol/L MgCl2, 0.2 mmol/L dNTP, 2 mmol/L正向引物, 2 mmol/L反向引物以及1.25 U Taq DNA聚合酶(TaKaRa), ddH2O補(bǔ)足到25 μL。PCR擴(kuò)增條件: 94 ℃變性4 min, 1個(gè)循環(huán); 94 ℃變性50 s, 55 ℃退火50 s, 72 ℃延伸90 s, 35個(gè)循環(huán); 72 ℃延伸10 min, 1個(gè)循環(huán)。

1.2.4 PCR產(chǎn)物的回收純化, 目的基因的克隆及鑒定

PCR產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳, 使用凝膠成像系統(tǒng)(VDS)觀察照相后, 切下特異性目的條帶, 并利用DNA膠回收試劑盒(上海生工公司)對(duì)目的片段進(jìn)行回收, 然后克隆到pMD19-T載體(大連寶生物公司)。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌TOP10菌株,產(chǎn)生的陽(yáng)性克隆經(jīng)PCR驗(yàn)證后進(jìn)行測(cè)序。

1.2.5 生物信息學(xué)分析

所獲得的DNA序列利用Vector軟件進(jìn)行基因組成分析, 并使用NCBI BLAST程序(http: //www.ncbi. nlm.nih.gov) 進(jìn)行序列同源性比對(duì)以及相似性分析,采用Clustal W軟件對(duì)不同種, 不同來源的桃花水母核糖體RNA基因ITS區(qū)序列進(jìn)行多序列比對(duì)分析,并以淡水水母亞綱微水螅屬的Microhydrula limopsicola作為外類群, 利用MEGA 4.0軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)生和進(jìn)化的分析, 系統(tǒng)樹采用Neighbor-joining方法構(gòu)建。

2 結(jié)果

2.1 采集水母的主要形態(tài)特征描述

所采集水母體具有桃花水母主要形態(tài)特征: 有很發(fā)達(dá)傘緣刺胞環(huán); 無(wú)胃柄; 4條簡(jiǎn)單輻管; 無(wú)向心管; 生殖腺囊狀, 僅懸在輻管上; 緣觸手只有1種,均勻分布于傘緣上; 關(guān)閉型的平衡囊位于緣膜內(nèi),形成向心管狀。而桃花水母種間的重要分類依據(jù)如觸手?jǐn)?shù)目、刺絲囊疣形狀、生殖腺形狀和顏色等因個(gè)體大小或發(fā)育時(shí)期不同, 在所采集的桃花水母的不同個(gè)體之間均存在部分差異, 從而無(wú)法將其準(zhǔn)確定義到種。

2.2 桃花水母ITS區(qū)基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果

以所提取的桃花水母DNA為模板, 以ITSC-F1/ITSC-R1特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè), 結(jié)果顯示: 此次PCR擴(kuò)增獲得了長(zhǎng)750 bp左右的目的產(chǎn)物(圖1)。測(cè)序結(jié)果顯示: 該次PCR擴(kuò)增所得的目的基因片段共771 bp。Vector軟件分析顯示: 該目的基因包括18S rDNA的部分片段44 bp、 235 bp的ITS1、161 bp 的5.8S rDNA、304 bp的ITS2以及28S rDNA的部分片段27 bp。

2.3 桃花水母ITS區(qū)基因同源序列比對(duì)分析

同源基因多序列比對(duì)顯示, ITS區(qū)序列在不同種類的桃花水母中具有較高的保守性。BLAST比對(duì)結(jié)果顯示, 本次采集的桃花水母ITS區(qū)序列與各地的索氏桃花水母(C. sowerbyi)ITS區(qū)堿基序列具有很高的相似度, 同源性均在93%以上, 如與香山采集的索氏桃花水母(AY513629.1)ITS區(qū)序列有100%相似度, 與濮陽(yáng)采集的索氏桃花水母(AY513628.1) ITS區(qū)序列存在99%相似度, 與株洲采集的索氏桃花水母 (AY513634.1) ITS區(qū)序列有98%的相似度, 與橫溪采集的索氏桃花水母 (AY513625.1) ITS區(qū)序列相似度為97%, 與平陽(yáng)采集的索氏桃花水母(JN874928.1)ITS區(qū)序列同源性為93%; 而與其他種類的桃花水母同源性在70%~80%之間, 與四川桃花水母(C. sichuanensis)(AY513620.1)和樂山桃花水母(C. kiatingi)(AY513619.1)的ITS區(qū)序列相似度均為77%,與秭歸桃花水母(C. ziguiensis)(AY513637.1)ITS區(qū)序列相似度為80%, 與中華桃花水母(C. sinensis) (AY730677.1)和短手桃花水母(C. brevinema) (AY513614.1)相似度均為76%。作者利用MEGA 4.0軟件, 將來自23個(gè)不同地區(qū)的桃花水母ITS區(qū)序列進(jìn)行系統(tǒng)學(xué)分析, 構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹(圖4)。分析結(jié)果表明, 不同種類的桃花水母親緣關(guān)系遠(yuǎn)近不同,相同種類不同地區(qū)的桃花水母在分子水平上也存在一定差異, 系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果顯示本次實(shí)驗(yàn)采集的桃花水母與各地索氏桃花水母聚為一支。綜合以上結(jié)果推斷, 在青島采集到的桃花水母應(yīng)是索氏桃花水母(C. sowerbyi)。

圖1 桃花水母ITS區(qū)基因目的片段的檢測(cè)Fig. 1 The target fragment of the ITS region in Craspedacusta collected in Qingdao

圖2 桃花水母核糖體RNA基因ITS區(qū)序列Fig. 2 The sequence of the ITS region of Craspedacusta from Qingdao

圖3 桃花水母核糖體RNA基因ITS區(qū)序列保守結(jié)構(gòu)域Fig. 3 The conserved domains of the ITS region of Craspedacusta from Qingdao

圖4 青島采集桃花水母ITS區(qū)序列與其他桃花水母ITS區(qū)序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 4 A phylogenetic tree based on the sequences of the ITS region from different Craspedacusta species

3 討論

桃花水母作為一類珍稀的淡水水母, 在生態(tài)學(xué)和生物學(xué)研究中具有重要意義。目前對(duì)桃花水母的相關(guān)研究主要集中于物種分類、生活史、地理分布及生態(tài)學(xué)影響等方面。桃花水母的分類鑒定工作在生物和生態(tài)學(xué)研究中起著較為重要的作用。目前對(duì)桃花水母的物種分類主要依據(jù)其外部形態(tài)特征, 如平衡囊的數(shù)目和形狀、觸手的數(shù)目和著生方式、生殖腺的顏色和形狀、刺絲囊疣的形狀及排列方式等[22]。而相關(guān)研究表明, 桃花水母在不同發(fā)育時(shí)期其外部形態(tài)特征具有較大的差異, 不同的生活環(huán)境也有可能帶來形態(tài)特征的變化; 此外, 作為桃花水母重要分類依據(jù)的部分形態(tài)特征尚缺乏規(guī)范的描述, 個(gè)人主觀因素的存在對(duì)外部形態(tài)的理解有可能造成分類偏差等等。上述情況的存在, 均為分類工作帶來了一定的困難。DNA作為生物遺傳信息的載體, 在不同發(fā)育時(shí)期和環(huán)境中變異幾率微小, 具有遺傳性、保守性、穩(wěn)定性及差異性等特點(diǎn)。因此, 利用DNA分子技術(shù)進(jìn)行桃花水母物種鑒定可以較好地彌補(bǔ)形態(tài)學(xué)分類的不足。目前, 分子生物技術(shù)已被國(guó)內(nèi)外的學(xué)者們廣泛應(yīng)用于桃花水母的物種分類鑒定當(dāng)中, 如通過對(duì)18S rRNA基因、核糖體RNA基因ITS區(qū)序列、COI等基因序列分析進(jìn)行了不同地區(qū)桃花水母的物種鑒定[21, 23]。

核糖體RNA基因中的18S rDNA、5.8S rDNA 和28S rDNA序列高度保守, 變異信息主要積累于作為非編碼區(qū)ITS區(qū), 從而使其具有種間區(qū)分的特異性, 因此研究中常利用ITS區(qū)序列分析進(jìn)行生物屬種間以及亞種層次上的物種鑒定工作。本研究成功獲得了桃花水母核糖體RNA基因ITS區(qū)序列, 并且多物種同源基因比對(duì)顯示, ITS區(qū)在不同種類的桃花水母中具有較高的保守性。本次實(shí)驗(yàn)采集的桃花水母ITS區(qū)序列與各地的索氏桃花水母ITS區(qū)序列具有最高的相似度, 同源性均在93%以上, 而與其他種類的桃花水母同源性為70%~80%。通過系統(tǒng)發(fā)育樹分析也能明顯看出桃花水母與索氏桃花水母聚為一類。綜合以上分析結(jié)果可以得出, 此次采集到的桃花水母即是索氏桃花水母。

目前, 我國(guó)關(guān)于桃花水母的分類研究主要依據(jù)外部形態(tài)特征。由于傳統(tǒng)分類技術(shù)手段的局限以及知識(shí)認(rèn)知上的差異, 國(guó)外研究學(xué)者對(duì)我國(guó)國(guó)內(nèi)報(bào)道的一些桃花水母屬的物種分類存在爭(zhēng)議。為了精益求精, 科研工作者們繼續(xù)通過改進(jìn)形態(tài)學(xué)特征研究和分子標(biāo)記的探索以達(dá)到更加精準(zhǔn)地進(jìn)行分類鑒定的目的。中國(guó)科學(xué)院水生生物所通過建立形態(tài)度量學(xué)參數(shù): 觸手密集度和平衡囊密集度, 對(duì)桃花水母進(jìn)行分類比較分析所得結(jié)果認(rèn)為短手桃花水母與中華桃花水母為同一物種[24]。本研究通過系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示, 短手桃花水母與中華桃花水母同源性非常高, 達(dá)99%, 且在系統(tǒng)進(jìn)化樹上中聚為一支。通過以上形態(tài)學(xué)特征和分子生物學(xué)的綜合分析, 認(rèn)為該兩種水母有可能為同一個(gè)物種。同理, 四川桃花水母與樂山桃花水母ITS區(qū)序列相似度也非常高, 為99%,在系統(tǒng)學(xué)樹中聚為一支, 因此認(rèn)為這兩種水母有同為一個(gè)物種的可能, 但具體是否為同一物種還需進(jìn)一步分析定論。目前分子生物學(xué)技術(shù)逐漸應(yīng)用于桃花水母的生物生態(tài)學(xué)研究當(dāng)中[25], 日趨完善的生物信息學(xué)平臺(tái), 如索氏桃花水母cDNA文庫(kù)的建立[26]、索氏桃花水母線粒體DNA基因組的確定[27]以及各地各種桃花水母分子標(biāo)記的獲得等, 為以后桃花水母的生長(zhǎng)發(fā)育、系統(tǒng)進(jìn)化分析以及分類鑒定等研究奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。對(duì)于目前國(guó)內(nèi)存在的桃花水母同物異名現(xiàn)象[12, 28], 還有待于結(jié)合形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)做進(jìn)一步地研究, 使桃花水母的分類鑒定工作更加準(zhǔn)確而有效。

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(本文編輯: 康亦兼)

Sequence analysis of the ribosomal RNA gene internal transcribed spacer region and species identification of Craspedacusta

CHI Yan-hong1, CHEN Hua-zeng1, YANG Cui-hua1, SUN Yu-miao2, Qi Ji-guang1, LIU Guang-xing3, WANG Wei1
(1. Qingdao Marine Product Museum, Qingdao 266003, China; 2. Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China; 3. College of Environmental Science and Engineering, Ocean University of China, Qingdao 266100, China)

Mar., 5, 2015

Craspedacusta; ITS region; Gene cloning; Sequence analysis

The ribosomal RNA gene internal transcribed spacer (ITS) region of Craspedacusta from Qingdao was isolated using the polymerase chain reaction followed by sequencing. Homology and phylogenetic analyses revealed that the ITS region of Craspedacusta showed a high similarity with Craspedacusta sowerbyi (>93%). Simultaneously, our results showed that this region is closely related to C. sowerbyi using a phylogenetic tree. The present data suggest that the Craspedacusta from Qingdao are closely related to C. sowerbyi. This is a new study about Craspedacusta in Qingdao.

Q78

A

1000-3096(2016)02-0035-06

10.11759/hykx20150305001

2015-03-05;

2015-07-08

科技基礎(chǔ)性工作專項(xiàng)項(xiàng)目(2012FY112200)

遲艷紅(1987-), 女, 山東濰坊人, 助理工程師, 碩士, 主要從事生物分類鑒定, 電話: 0532-82864949, E-mail: chiyanhonglucky@163.com