劉錦林 潘彥舒 李海燕 程曉娜 王東輝 牟天龍 劉元

摘要：目的 觀察黃芩苷對腦缺血雌性大鼠血清孕酮及其相關激素水平的影響，探討其是否通過調控孕酮水平發(fā)揮對腦缺血大鼠神經功能的保護作用。方法 應用陰道涂片方法選取成年動情期雌性大鼠，隨機分為正常組、正常+黃芩苷組和造模組。造模組制作左側大腦半球永久性大腦中動脈栓塞模型，成模后隨機分為模型組、黃芩苷組、孕酮組和孕酮抑制劑組。正常+黃芩苷組和黃芩苷組腹腔注射黃芩苷溶液，正常組和模型組腹腔注射等量生理鹽水，孕酮組給予黃體酮注射液肌注，孕酮抑制劑組給予黃芩苷溶液腹腔注射和米非司酮溶液灌胃。分別于造模后不同時間點抓力測定儀檢測各組大鼠前肢抓力，并進行神經功能行為評分；ELISA檢測血清孕酮及其相關激素的水平。結果 與正常組比較，造模各組大鼠神經功能發(fā)生損傷，各時間點神經功能行為評分均極顯著升高（P<0.001），各時間點前肢抓力均極顯著降低（P<0.001）。治療5 d，黃芩苷組顯示出對神經功能改善的趨勢（P>0.05），并可顯著提高前肢抓力（P<0.01）；治療10 d，黃芩苷組顯著改善神經功能行為評分（P<0.05），并極顯著提高大鼠前肢抓力大?。≒<0.001）；與黃芩苷組比較，孕酮抑制劑組第10日對神經功能恢復有顯著的抑制作用（P<0.05），第5、10日對抓力恢復亦有較顯著的抑制作用（P<0.05）。同時，與模型組比較，黃芩苷組孕酮水平顯著升高（P<0.05），促卵泡激素和促黃體生成素水平有所下降（P>0.05）。結論 應用米非司酮對孕酮進行阻斷后，黃芩苷的神經功能保護作用顯著受到抑制，提示黃芩苷可能通過上調血清孕酮水平而發(fā)揮腦保護作用。

關鍵字：黃芩苷；腦缺血；血清孕酮；神經功能；大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.07.017

中圖分類號：R285.5 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2016）07-0065-05

Regulation of Baicalin for Serum Progesterone Level and Its Effects on Neural Functions after Cerebral Ischemia in Rats LIU Jin-lin1， PAN Yan-shu1， LI Hai-yan1， CHENG Xiao-na1， WANG Dong-hui1， MU Tian-long2， LIU Yuan3 （1. College of Preclinical Medicine， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100029， China； 2. Dongfang Hospital Affiliated to Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100078， China； 3. 302 Military Hospital of China， Beijing 100039， China）

Abstract： Objective To investigate the effects of baicalin on serum progesterone and related hormones in female normal and cerebral ischemia rats； To explore whether baicalin plays a role in cerebral protection of neurological functions by regulating progesterone levels. Methods With vaginal smear method， the adult estrus female SD rats were selected and divided into normal group， baicalin normal group， and molding groups. The left side of the middle cerebral artery of rats in the molding groups was blocked to establish the permanent middle cerebral artery occlusion （pMCAO）. After modeling， the rats were randomly divided into model group， baicalin treatment group， progesterone treatment group and progesterone inhibitor group. The baicalin normal group and baicalin treatment group were given intraperitoneal injection of baicalin solution； the normal group and model group were given normal saline of the same quantity； progesterone treatment group was given intramuscular injection of progesterone； progesterone inhibitor group was given intraperitoneal injection of baicalin solution and intragastric administration of mifepristone solution.

基金項目：國家重點基礎研究發(fā)展計劃（2012CB518602）；國家自然科學基金青年基金（81202832）

通訊作者：潘彥舒，E-mail：13911209998@163.com

The neurological function deficit scores were evaluated and rat forelimb holding power was detected by Grip Strength Meter respectively at different time points. Serum was taken from the rats and the progesterone and related hormones levels in the serum of every group were measured by ELISA. Results Compared with normal group， neurological functions of rats in molding groups were damaged， and neural functional behavior scores of different time points were the most strongly increased （P<0.001）， and rat forelimb holding power was the most strongly reduced （P<0.001）. 5 days after treating， baicalin showed the trend of improvement of neurological functions （P>0.05） and more significant improvement of the forelimb holding power （P<0.01）； 10 days after modeling， baicalin treatment group significantly increased neural functional behavior scorce （P<0.001） and the most significantly improved the forelimb holding power （P<0.001）. Compared with baicalin treatment group， the progesterone inhibitor group had a significant inhibitory effect on neural functional recovery （P<0.05） 10 days after modeling， and the group also had a significant inhibitory effect on the recovery of holding power （P<0.05） 5 days and 10 days after treating. At the same time， compared with the model group， progesterone level in baicalin treatment group increased significantly （P<0.05）， and FSH and LH decreased （P>0.05）. Conclusion After applying mifepristone to block progesterone， baicalin neurologic protection is significantly inhibited. The results demonstrated that baicalin may play a role in cerebral protection via up-regulating serum progesterone level.

Key words： baicalin； cerebral ischemia； serum progesterone； neurologic function； rats

腦血管疾病是當今社會嚴重危害人類健康的常見病和多發(fā)病，亦是導致死亡和殘障的主要原因之一，缺血性腦卒中是最常見的腦卒中類型，占全部腦卒中的80%左右[1]。目前國內外有關孕酮在腦缺血治療方面的基礎研究較為成熟，并已經明確了其對腦缺血或者腦外傷的神經保護作用[2]。然而，由于孕酮的不良反應阻礙了其在臨床上的廣泛應用，因此尋找孕酮的天然替代藥物治療腦缺血損傷具有較好前景。

黃芩具有清熱燥濕、瀉火解毒、止血、安胎等功效，其主要成分黃芩苷對腦缺血具有良好的治療效果，在清開靈注射液的相關研究中也得到證實[3-4]；同時有研究表明，黃芩苷可調節(jié)體內孕激素的水平[5]。本實驗采用大鼠大腦中動脈栓塞（MCAO）模型，觀察黃芩苷對血清孕酮（P）、促卵泡激素（FSH）和促黃體生成素（LH）水平以及腦缺血損傷大鼠神經功能的影響，初步推測黃芩苷是否通過調節(jié)P水平發(fā)揮對腦缺血的治療作用，為后續(xù)的研發(fā)工作奠定基礎。

1 實驗材料

1.1 動物

雌性健康SPF級SD大鼠46只，12周齡，體質量（220±20）g，北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號SCXK（京）2012-0001。飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學實驗動物中心，室溫24 ℃、濕度50%，明暗交替12 h/12 h，室內風速控制在0.1～0.2 m/s。適應性飼養(yǎng)1周，術前禁食12 h，保留水供應。

1.2 藥物及制備

黃芩苷，成都曼斯特生物科技有限公司，批號MUST-15062716，純度98.59%；黃體酮注射液，浙江仙琚制藥股份有限公司，規(guī)格20 mg，批號20150124；米非司酮，湖北葛店人福藥業(yè)有限責任公司，規(guī)格25 mg，批號150301。黃芩苷溶液配制：將黃芩苷粉末用磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.0）配制成7.5 mg/mL黃芩苷溶液，用2倍生理鹽水稀釋；米非司酮溶液配制：將米非司酮片碾成粉末狀，溶于純芝麻油，配制成1.302 mg/mL米非司酮溶液。

1.3 主要試劑與儀器

大鼠P、FSH和LH ELISA試劑盒，北京華英技術研究所，批號均為20151215；PBS，Solarbio，批號20150626；美藍，國藥集團化學試劑有限公司，批號20141104。4.5 g電子分析天平（AE160 型，瑞士Mettler公司），手術顯微鏡（SXP-1B，上海醫(yī)用光學儀器廠），高頻小電刀（1411型，上海醫(yī)療器械技術公司），低溫高速離心機（xiangyi L-550，Sigma公司），光學顯微鏡（CH型，日本Olympus公司），抓力測定儀（47200型，Ugo Basile公司）。

2 實驗方法

2.1 動情周期檢測

2.1.1 性周期判定標準 參照文獻[6]大鼠性周期陰道涂片細胞變化特點劃分大鼠性周期的各階段：①動情前期：持續(xù)時間17～21 h，涂片可見大量有核上皮細胞、少量角化上皮細胞；②動情期：持續(xù)時間9～15 h，涂片可見滿視野角化上皮細胞、少量有核上皮細胞；③動情后期：持續(xù)時間10～14 h，涂片可見角化上皮細胞及白細胞；④動情間期：持續(xù)時間為60～70 h，涂片可見大量白細胞及少量黏液。

2.1.2 大鼠陰道涂片方法 參照文獻[7]于每日8：00進行檢測，連續(xù)4～5 d。將消毒細棉簽用生理鹽水濕潤，輕輕插入大鼠陰道內，慢慢轉動兩下取出，把帶有陰道黏液的棉簽在載玻片上均勻轉動做成涂片，酒精燈烘干后，用堿性美藍溶液染色5 min，用蒸餾水沖去多余染液，顯微鏡觀察，并根據大鼠陰道涂片細胞變化明確大鼠所處的性周期階段。將動情周期規(guī)律的大鼠列為實驗對象。

2.2 造模

繼續(xù)觀察列為實驗對象大鼠的動情周期，每只大鼠均在其處于動情期時造模。參照文獻[5]方法制作大鼠左側大腦半球永久性MCAO模型。10%水合氯醛溶液大鼠腹腔注射麻醉，常規(guī)消毒，頸部正中切口，結扎左側頸外動脈（ECA）遠心端，電斷ECA，由ECA殘端剪口插入栓線，阻斷大腦中動脈，用縫合線結扎ECA殘端，剪斷多余栓線，術區(qū)使用青霉素粉少許，逐層縫合手術切口。

2.3 分組及給藥

按Bederson等[8]神經功能評分法將造模后的大鼠隨機分為模型組（6只）、黃芩苷組（10只）、孕酮組（8只）和孕酮抑制劑組（簡稱抑制劑組，10只），另將處在動情期的正常大鼠分為正常組（6只）和正常+黃芩苷組（6只）。黃芩苷組和正常+黃芩苷組大鼠腹腔注射15 mg/kg黃芩苷溶液，正常組和模型組腹腔注射等量生理鹽水，孕酮組肌肉注射8 mg/kg黃體酮，抑制劑組腹腔注射15 mg/kg黃芩苷溶液并予2.604 mg/kg米非司酮溶液灌胃。各組均于術后24 h給藥，此后每日同一時間點給藥。

2.4 檢測方法及觀察指標

2.4.1 神經功能行為評分 參照文獻[8]方法，總分為10分。①提起鼠尾，觀察右前肢表現。1分：內收，但不貼身；2分：內收，貼于身體；3分：內收貼于身體并踡縮；4分：大鼠軀體向右側旋轉。②將動物置一金屬網上，向后輕提鼠尾，觀察兩側前肢肌張力。0分：兩側前肢緊拉金屬網肌力無明顯差異；1分：右前肢拉金屬網但肌力明顯弱于左側；2分：右前肢不能拉金屬網。③將動物置光滑平面上，觀察側向推擋阻力。0分：雙側推擋阻力無明顯差異；1分：右側推擋阻力明顯弱于左側；2分：右推大鼠時其向右側傾倒。④大鼠左眼上瞼下垂，左眼分泌物增多者評2分。以上4項評分相加為最后神經功能評分。

2.4.2 抓力測定 分別于術后6 h和1、5、10 d，采用抓力測定儀檢測各組大鼠的抓力。大鼠放置光滑平臺上，前肢抓扶于抓竿上，大鼠在被牽拉尾部向后移動時會本能地抓住任何物體以阻止后退，直到拉力超過其抓力。大鼠失去抓力后，與其相連接的主儀器自動記錄抓力的最大值，重復測量3次，記錄大鼠前肢最大抓力。大鼠造模前對其進行第1次抓力測定，以造模前抓力值為基值，計算造模后不同時間點自體抓力變化。抓力變化=造模后抓力值÷造模前抓力值。

2.4.3 大鼠血清孕酮、促黃體生成素和促卵泡激素含量測定 造模后第10日，按照0.35 mL/100 g體質量大鼠腹腔注射10%水合氯醛溶液麻醉，自腹主動脈采血，靜置2 h后，3000 r/min離心15 min，取血清凍存?zhèn)溆?。ELISA檢測血清P、LH和FSH含量，嚴格按照試劑盒說明操作。

3 統計學方法

采用SPSS21.0統計軟件進行分析。實驗數據以—x±s表示，數據資料經正態(tài)性分布檢驗及方差齊性檢驗后，采用方差分析或非參數檢驗比較組間差異。P<0.05表示差異有統計學意義。

4 結果

4.1 黃芩苷對模型大鼠神經功能行為評分的影響

與正常組比較，造模后大鼠存在神經功能缺損，各時間點差異均有統計學意義（P<0.001）；各組術后1 d大鼠神經功能缺損均有所加重，與模型組比較，術后5 d黃芩苷組大鼠神經功能出現恢復的趨勢（P>0.05），術后10 d顯著恢復（P<0.05）；術后5 d孕酮組大鼠神經功能出現恢復的趨勢（P>0.05），術后10 d顯著恢復（P<0.05）；黃芩苷組和孕酮組比較差異無統計學意義（P>0.05）；與黃芩苷組比較，術后10 d抑制劑組療效受到顯著抑制（P<0.05）。結果見表1。

組比較，△P<0.05

4.2 黃芩苷對模型大鼠前肢抓力變化的影響

與正常組比較，造模后大鼠前肢抓力降低，各時間點差異均有統計學意義（P<0.001）；與模型組比較，術后5 d黃芩苷組大鼠前肢抓力開始顯著恢復（P<0.01），術后10 d極顯著恢復（P<0.001）；術后5 d孕酮組大鼠前肢抓力開始顯著恢復（P<0.01），術后10 d極顯著恢復（P<0.001）；黃芩苷組與孕酮組比較差異無統計學意義（P>0.05）；與黃芩苷組比較，術后5、10 d抑制劑組抓力恢復均受到較顯著的抑制（P<0.05）。結果見表2。

比較，△P<0.05

4.3 黃芩苷對模型大鼠血清孕酮、促黃體生成素和促卵泡激素水平的影響

與正常組比較，正常+黃芩苷組P水平有增加的趨勢，LH水平有所下降，FSH水平亦略有下降，差異均無統計學意義（P>0.05）；與模型組比較，黃芩苷組P水平顯著升高（P<0.05），LH水平有所下降，FSH水平亦略有下降，差異無統計學意義（P>0.05）。結果見表3。

5 討論

P為脂溶性甾體激素，是在神經系統中合成的神經活性甾體，除可在外周內分泌腺（腎上腺和性腺等）合成，也存在于人腦中?，F已證實，在急性中樞神經系統損傷、創(chuàng)傷性腦外傷、脊髓損傷、腦卒中等大鼠模型中，P可減輕腦水腫、減少炎癥級聯反應，P產生的代謝物能減少促凋亡酶和增加抗凋亡酶、加速神經髓鞘修復等[9-11]。盡管P治療腦缺血疾病的療效肯定，而且在基礎研究和Ⅰ期、Ⅱ期臨床研究均比較成熟，然而其不良反應也日益顯現，因此進入Ⅲ期臨床研究面臨困難，尚未在臨床上展開應用。

在很多中藥單體研究中，黃芩主要有效成分之一的黃芩苷藥理作用研究取得了較大進展，主要包括抗氧化、抗菌抗病毒、抗炎、抗癌、抗過敏、抗心律失常、降壓和鎮(zhèn)靜作用及對免疫消化神經等系統的保護作用[12-16]。預實驗結果顯示，與模型組比較，腦缺血第7日黃芩苷組大鼠神經功能評分、前肢抓力及死亡率等改善最為顯著（P<0.01）。同時考慮到雌性大鼠的動情周期為5 d左右，因此選擇在第3個動情期即第10日取材檢測。本研究結果顯示，腦缺血10 d時黃芩苷能顯著改善大鼠神經功能評分，極顯著恢復大鼠前肢抓力。

本實驗選用雌性大鼠在動情期進行造模和取材，是考慮到激素水平在動情周期內的動情期孕激素水平較低，以減小自身激素水平引起的誤差。研究結果顯示，黃芩苷能增加正常大鼠和腦缺血大鼠血清P水平；對其負反饋調節(jié)的2種相關激素LH和FSH均略有下調，尤其是對LH的影響，這點與生理的反饋調節(jié)是相對應的。但受實驗大鼠只數所限，這種差異趨勢并不顯著。

P在大鼠動情周期中有明顯的周期性變化。這一變化與動情周期中黃體細胞的產生和消退密切相關。LH和FSH均為垂體前葉嗜堿性細胞分泌的糖蛋白激素，前者是促進卵巢的卵泡發(fā)育和成熟，后者主要是促使排卵，2種激素協同作用，形成黃體并分泌孕激素。卵巢性激素對下丘腦促性腺激素釋放激素和垂體促性腺激素（包括LH和FSH）的合成和分泌具有反饋作用。排卵后，血液中雌激素和孕激素水平明顯升高，兩者聯合作用，FSH和LH的合成和分泌又受抑制。其中P的分泌與LH的關系最密切。有研究表明，LH峰的出現可激活卵泡膜中腺苷酸環(huán)化酶，導致腺苷酸環(huán)化酶增加，腺苷酸環(huán)化酶引起顆粒細胞黃體化，使卵泡內的P含量增加，從而抑制促進LH分泌的雌激素正反饋作用[17]。

米非司酮為受體水平抗孕激素藥物，具有終止早孕、抗著床、誘導月經及促進宮頸成熟等作用，與P競爭受體而達到拮抗P的作用。應用米非司酮對P進行阻斷后，黃芩苷的神經功能保護作用顯著受到抑制。提示黃芩苷可能是通過上調血清P水平而發(fā)揮腦保護作用的。

綜上，本實驗結果顯示，黃芩苷對雌性大鼠局灶性腦缺血具有保護作用，其作用機制可能與上調血清P水平有關。黃芩苷已經應用于臨床其他疾病的治療，鮮有應用于腦缺血治療的臨床報道，本課題的研究意義在于解決P的臨床推廣難題，為尋求P的天然替代藥物奠定基礎。

參考文獻：

[1] 段云霞，陳小玉，張梓倩，等.缺血性腦卒中治療藥物研究進展[J].中央民族大學學報：自然科學版，2012，21（2）：65-70.

[2] STEIN D G， WRIGHT D W， KELLERMANN A L. Does progesterone have neuroprotective properties？[J]. Annals of Emergency Medicine， 2008，51（2）：164-172.

[3] 朱曉磊.精制清開靈抗實驗性腦缺血的血管保護機制研究[D].北京：北京中醫(yī)藥大學，2006.

[4] 鐘相根，李澎濤，王永炎，等.清開靈有效組分對大鼠缺血腦組織星形膠質細胞活化的影響[J].中國醫(yī)藥學報，2004，19（6）：338-340.

[5] 陳婷.黃芩苷對小鼠子宮組織經典Wnt通路相關物質表達的影響[D]. 武漢：華中農業(yè)大學，2013.

[6] 鄒移海，徐志偉，蘇鋼強.實驗動物學[M].北京：科學出版社，2004：84.

[7] 王秋玲.散結乳癖膏對卵巢囊腫大鼠血清中雌激素、孕激素含量影響的研究[D].哈爾濱：黑龍江中醫(yī)藥大學，2013.

[8] LONGA E Z， WEINSTEIN P R， CARLSONS S， et al. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J]. Stroke， 1989，20（20）：84-91.

[9] SCHUMACHER M， GUENNOUN R， STEIN D G， et al. Progesterone：therapeutic opportunities for neuroprotection and myelin repair[J]. Pharmacology & Therapeutics，2007，116（1）：77-106.

[10] VANLANDINGHAM J W， CEKIC M， CUTLER S， et al. Neurosteroids reduce inflammation after TBI through CD55 induction[J]. Neuroscience Letters，2007，425（2）：94-98.

[11] DJEBAILI M， HOFFMAN S W， STEIN D G. Allopregnanolone and progesterone decrease cell death and cognitive deficits after a contusion of the rat pre-frontal cortex[J]. Neuroscience， 2004， 123（2）：349-359.

[12] 李湘瀲.靶向禽流感H5N1包膜蛋白進入抑制劑的篩選及機制研究[D].廣州：南方醫(yī)科大學，2013.

[13] 康輝，李強，王麗.黃芩提取物、黃芩苷抗氧化和保肝作用研究[J]. 中醫(yī)研究，2010，23（4）：27-30.

[14] 韓寶瑞.黃芩苷結構修飾及抗氧化構效關系[J].食品科學，2011， 32（1）：49-51.

[15] 王娜.黃芩苷對肝癌細胞Cx26及Cx43表達的影響[D].石家莊：河北醫(yī)科大學，2012.

[16] GLIONKE W， HAUSMANN E， BERGMANN L. Downregulation of STAT3 signaling induces apoptosis but also promotes anti-apoptotic gene expression in human pancreatic cancer cell lines[J]. Tumor Biology，32（3）：493-500.

[17] 鄭月慧，況海斌，鐘志勝，等.大鼠動情周期及妊娠期卵巢c-myb表達的變化[J].基礎醫(yī)學與臨床，2001，21（5）：424-427.

（收稿日期：2016-01-25）

（修回日期：2016-02-14；編輯：華強）