楊夢祺，劉盼盼，黃蓬

(中山大學(xué)腫瘤防治中心 華南腫瘤學(xué)國家重點實驗室，廣東 廣州 510060)

腫瘤氧化還原代謝與干預(yù)

楊夢祺，劉盼盼，黃蓬Δ

(中山大學(xué)腫瘤防治中心 華南腫瘤學(xué)國家重點實驗室，廣東 廣州 510060)

受腫瘤相關(guān)基因信號通路和代謝改變的影響，腫瘤細胞的氧化還原狀態(tài)經(jīng)常處于失衡狀態(tài)，表現(xiàn)為活性氧(reactive oxygen species，ROS)水平異常增高及氧化脅迫(oxidative stress)。很多與腫瘤發(fā)生相關(guān)的信號通路都可直接或間接調(diào)節(jié)活性氧的代謝。異常升高的ROS在腫瘤細胞中的作用至今仍然備受爭議，ROS一方面可促進細胞生長和腫瘤耐藥，另一方面也能引起細胞的損傷甚至死亡。腫瘤細胞為適應(yīng)高氧化應(yīng)激而上調(diào)自身抗氧化能力，最終適應(yīng)并維持存活。氧化應(yīng)激的調(diào)節(jié)在腫瘤發(fā)生發(fā)展和對治療的應(yīng)答上都起著重要的作用。越來越多的研究提示通過靶向氧化還原調(diào)節(jié)機制的干預(yù)策略可以抑制腫瘤生長和消除腫瘤的耐藥性。本文將闡述腫瘤細胞氧化還原代謝的改變和氧化應(yīng)激及其調(diào)控機制，并討論利用腫瘤這一生物化學(xué)特性進行干預(yù)的潛在治療策略。

活性氧；腫瘤細胞；氧化應(yīng)激；氧化還原適應(yīng)

利用腫瘤細胞的生物學(xué)特征設(shè)計高效和高選擇性藥物及治療策略一直是腫瘤研究的主要目標之一。近年來分子靶向藥物的出現(xiàn)為提高腫瘤療效和特異性帶來了新希望，特異性針對正常細胞和腫瘤細胞之間基因差異的靶向治療不僅能有效殺滅腫瘤細胞，而且對正常細胞的毒性也較小[1-2]。然而，獲得性耐藥和基因組的不穩(wěn)定性使靶向治療面臨新的挑戰(zhàn)[3-4]。腫瘤細胞內(nèi)常有多個基因的改變，因此聯(lián)合應(yīng)用多種有針對性的特異性藥物才有可能有效殺滅腫瘤細胞。然而，該聯(lián)合策略的成功應(yīng)用有賴于對腫瘤細胞賴以存活的多個關(guān)鍵基因組合的鑒定和認識，目前仍然需要多層次多角度深入的基礎(chǔ)理論研究。由于大多數(shù)腫瘤細胞表現(xiàn)出有氧糖酵解的增加(Warburg效應(yīng))和高氧化應(yīng)激狀態(tài)[5]，靶向這些特征性改變可望成為一種特異針對腫瘤細胞的治療方法。

許多類型的腫瘤細胞都具有較正常細胞高的ROS水平[6]。細胞內(nèi)的ROS主要來源于線粒體，其次是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和過氧化物酶體。另外，ROS也可來自細胞內(nèi)其他涉及電子傳遞的生化反應(yīng)及某些金屬離子所介導(dǎo)的氧化還原反應(yīng)。ROS主要包括兩大類型，一是其外電子層含有不成對電子的自由基(free radical)，另一類是外電子層不含不成對電子但化學(xué)性質(zhì)活躍的非自由基活性氧(non-radical ROS)。ROS在生物機體中具有重要功能，包括氧化還原調(diào)節(jié)和生物信息傳遞等。適度的ROS增加可以促進細胞增殖和分化，但一旦過度升高則導(dǎo)致脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA的損傷[7]。維持ROS動態(tài)平衡是正常細胞存活和增殖的關(guān)鍵。細胞通過自身的活性氧代謝系統(tǒng)維持ROS的產(chǎn)生和清除的平衡而控制其合適的水平。利用基因技術(shù)和藥物手段擾亂細胞的氧化還原平衡可導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。Piskounova等[8]最近研究提示，增高的ROS對于促進和維持腫瘤細胞高轉(zhuǎn)移表型可能具有關(guān)鍵作用。然而高氧化應(yīng)激狀態(tài)的腫瘤細胞更容易受外源性ROS誘導(dǎo)劑的損傷。因此，靶向氧化還原調(diào)節(jié)控制ROS水平可以作為一種有效的方式選擇性的殺死腫瘤細胞[9]。

需要指出的是，腫瘤細胞中氧化還原代謝的改變非常復(fù)雜，應(yīng)激反應(yīng)和氧化還原調(diào)節(jié)機制涉及眾多因素。在持續(xù)的氧化應(yīng)激狀態(tài)下，細胞可通過多種機制調(diào)節(jié)氧化應(yīng)答功能，包括增強細胞內(nèi)抗氧化系統(tǒng)的能力從而適應(yīng)這種氧化脅迫[10]，以及調(diào)節(jié)細胞存活過程中的轉(zhuǎn)錄因子和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的活性和表達[11]。為了提高腫瘤治療療效和克服與氧化還原適應(yīng)相關(guān)的耐藥，必須闡明腫瘤細胞中復(fù)雜的氧化還原改變和潛在的機制。此外，由于腫瘤干細胞在腫瘤耐藥和疾病復(fù)發(fā)中起著重要作用，檢測腫瘤干細胞的活性氧代謝和氧化還原狀態(tài)并制定相應(yīng)的干預(yù)策略對腫瘤的有效治療至關(guān)重要。

1 氧化應(yīng)激在腫瘤中的作用和機制

大部分血液腫瘤和實體腫瘤，如慢性髓細胞白血病、慢性淋巴細胞白血病、腎癌、乳腺癌以及前列腺癌中都可以觀察到ROS水平的明顯升高[12-13]。此外，Valencia等[14]研究顯示腫瘤相關(guān)成纖維細胞中ROS水平較正常成纖維細胞亦明顯增高。雖然導(dǎo)致腫瘤細胞氧化應(yīng)激的確切機制仍不很清楚，但目前認為以下內(nèi)在和外在因素是腫瘤細胞高氧化應(yīng)激的主要原因。

內(nèi)在因素包括：①癌基因激活。早期研究發(fā)現(xiàn)MYC的異位高表達可以導(dǎo)致線粒體基因表達上調(diào)，增加ROS的產(chǎn)生[15]。最近對白血病干細胞的研究提示癌基因BCR-ABL的表達產(chǎn)物可誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生[16]。腫瘤基因RAS的異常表達或突變可通過影響NADPH氧化酶而增加ROS的產(chǎn)生[17]。另一方面，MYC和RAS又可激活抗氧化機制而下調(diào)ROS[18]，使腫瘤細胞達到新的氧化還原平衡；②能量代謝異常。多數(shù)腫瘤細胞具有較高的代謝活性，需要更多的三磷酸腺苷(ATP)作為能量以維持各項細胞活動。這高能量需求導(dǎo)致線粒體呼吸持續(xù)活躍，從而引起過量ROS的產(chǎn)生和累積[6]；③線粒體結(jié)構(gòu)功能異常。線粒體DNA編碼電子傳遞鏈中的13種蛋白質(zhì)，線粒體DNA的突變可導(dǎo)致呼吸鏈功能失調(diào)而造成電子異常滲漏。游離電子與分子氧反應(yīng)產(chǎn)生超氧陰離子自由基(superoxide)，隨后可被轉(zhuǎn)化為其他類型的ROS[19]；④內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能異常。新生蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)中正確折疊才能保證其正常生理功能。錯誤折疊的蛋白質(zhì)將引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和未折疊蛋白質(zhì)應(yīng)答反應(yīng)(unfolded protein response，UPR)，導(dǎo)致ROS的產(chǎn)生和積聚[20]。另外，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的鈣釋放和隨后的線粒體內(nèi)膜去極化亦可刺激線粒體ROS的產(chǎn)生[21]；⑤抑癌基因失活。抑癌基因產(chǎn)物p53在感應(yīng)和清除氧化損傷的核DNA和線粒體DNA，預(yù)防氧化基因突變和遺傳物質(zhì)不穩(wěn)定中具有重要作用[22]。另外，p53作為轉(zhuǎn)錄因子可調(diào)控諸多抗氧化基因的表達[23]。因此，p53的缺失或突變可導(dǎo)致細胞的氧化還原失衡。

外在因素包括：炎性細胞因子、營養(yǎng)不平衡和乏氧環(huán)境[24]。腫瘤細胞增殖快，部分細胞常處于缺氧和營養(yǎng)不足的環(huán)境中，這將刺激線粒體產(chǎn)生ROS，異常增高的ROS又可反過來進一步激活缺氧誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子1(HIF1)。后者可促進血管生成、細胞存活和糖酵解[25]。

已有研究評估了細胞在不同環(huán)境下的ROS水平改變及其生理病理意義，旨在闡明ROS致瘤作用或抑瘤作用的環(huán)境條件。在適度的范圍內(nèi)，ROS可以刺激促有絲分裂原激活蛋白激酶(MAPK)和細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)的磷酸化，細胞周期蛋白cyclin D1的表達和JUN氨基末端激酶(JNK)的活化，這些信號分子都與腫瘤的生長相關(guān)[26]。已有證據(jù)表明腫瘤細胞中一定水平的ROS增高有助于細胞增殖和存活、分化和遷移[27]，并可促進免疫逃逸及耐藥[28]。而當ROS嚴重升高而超過細胞抗氧化機制所能耐受的水平時，則可導(dǎo)致細胞損傷乃至死亡。需要回答的問題是，腫瘤細胞如何通過自身的調(diào)節(jié)機制維持一個比正常細胞高的ROS水平但又不至于影響細胞的各項生理功能，即腫瘤細胞的氧化應(yīng)激適應(yīng)？

2 腫瘤細胞對氧化應(yīng)激的適應(yīng)

早在20年前就有研究顯示低劑量持續(xù)的外源性氧化劑預(yù)處理正常上皮細胞可賦予細胞抵抗后續(xù)高水平氧化應(yīng)激的能力[29]。如圖1所示，腫瘤細胞能夠通過自身調(diào)控機制將ROS控制在合適的范圍內(nèi)。腎腫瘤細胞中磷酸戊糖代謝途徑尤為活躍，以產(chǎn)生更多的還原當量NADPH。另外，多數(shù)腫瘤細胞的谷胱甘肽(GSH)合成能力增強。在惡性腫瘤細胞株和原代腫瘤組織中，活性氧清除酶超氧化物歧化酶(SOD1、SOD2和SOD3)、谷胱甘肽過氧化物酶、過氧化物酶體、硫氧還原蛋白(TRX)的水平均有不同程度的增高，還原型GSH和TRX也明顯增多[30]。腫瘤細胞增強其氧化應(yīng)激的能力主要是通過高表達負責(zé)清除ROS的酶系及產(chǎn)生GSH、NADPH、TRX等一系列的抗氧化分子。最近的研究也表明，某些誘導(dǎo)氧化應(yīng)激的條件也會促進腫瘤細胞的抗氧化機制的激活[10]。

圖1 細胞內(nèi)氧化還原平衡示意圖細胞內(nèi)活性氧主要來源于線粒體電子傳遞鏈，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和NADPH氧化酶(NOX)復(fù)合物等。各種類型的活性氧在圖中用紅色標記出。過高的活性氧可導(dǎo)致蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和DNA氧化損傷。為防止活性氧帶來的損傷，細胞通過平衡活性氧的生成和消除而將ROS維持在一個適度的范圍內(nèi)。由于處于高度氧化應(yīng)激狀態(tài)，腫瘤細胞更加依賴抗氧化系統(tǒng)，包括氧化物酶體、谷胱甘肽過氧化物酶、過氧化氫酶、硫氧還原蛋白和谷氧還原蛋白等以對抗活性氧并減少其氧化損傷。一些藥物如SSZ、BSO和AUR等可通過不同的機制干預(yù)細胞內(nèi)活性氧清除系統(tǒng)Fig.1 Schematic illustration of cellular redox homeostasisCellular reactive oxygen species(ROS) are mainly generated from the mitochondrial electron transport chain, the endoplasmic reticulum(ER) system, and the NADPH oxidase(NOX) complex.Various types of ROS are highlighted in red color.The increases in ROS may lead to oxidative damage of protein, lipid, and DNA.To prevent the harmful effects of ROS, cells regulate ROS at a proper level by maintaining the balance between ROS generation and elimination.Due to high levels of intracellular ROS, cancer cells highly rely on antioxidant systems including peroxiredoxins, glutathione peroxidases, and catalase to counteract oxidative stress and minimize their damage.Several drugs such as sulfasalazine(SSZ), buthioninesulfoximine(BSO), and auranofin(AUR) could disrupt these ROS-scavenging systems

腫瘤細胞的氧化適應(yīng)可能涉及多種信號途徑以激活氧化還原敏感的轉(zhuǎn)錄因子，如NF-κB、NRF2、c-JUN和HIF-1等。這些轉(zhuǎn)錄因子的激活可促進超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、硫氧還蛋白和谷胱甘肽等抗氧化系統(tǒng)的基因表達。例如，轉(zhuǎn)錄因子NRF2可激活多種能夠降低活性氧的應(yīng)激基因表達[31]。NRF2的獲得性功能突變可賦予細胞高氧化應(yīng)激能力和對一些抗腫瘤藥物的抵抗能力，這有助于增強腫瘤細胞對某些化療藥物的抵抗[32]。NRF2還可以促進細胞的谷胱甘肽合成和利用，而谷胱甘肽具有促進烷化劑代謝和解毒的作用，還原型GSH可以逆轉(zhuǎn)3溴丙酮酸(3-BrPA)對腫瘤的抑制作用[33]。因此，異常的藥物代謝和細胞保護機制的激活可共同導(dǎo)致腫瘤細胞耐藥。除了促進細胞的存活，這些氧化還原敏感的轉(zhuǎn)錄因子也可調(diào)節(jié)細胞增殖、細胞永生化、血管生成和腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白質(zhì)的表達[34]。

另外，基因組的不穩(wěn)定性也是腫瘤細胞氧化還原適應(yīng)的重要機制之一?；虻牟环€(wěn)定性使其所編碼蛋白質(zhì)的功能改變或異常表達成為可能，并為細胞適應(yīng)氧化應(yīng)激環(huán)境及其在腫瘤微環(huán)境中獲得生存優(yōu)勢提供了條件。

腫瘤細胞可通過氧化還原適應(yīng)提高內(nèi)源性的抗氧化系統(tǒng)的能力和激活細胞存活通路，從而將ROS維持在一個較穩(wěn)定且可耐受的范圍內(nèi)(見圖2)。上調(diào)的抗氧化系統(tǒng)，如GSH和NADPH等賦予細胞更強的抗氧化能力，增強DNA修復(fù)能力，從而減少了細胞凋亡。關(guān)于不同類型腫瘤細胞的氧化還原狀態(tài)及其生理病理意義，目前尚缺乏系統(tǒng)研究。因此，人們對各種不同類型腫瘤細胞的氧化還原改變?nèi)绾斡绊懠毎硇偷睦斫獠⒉煌暾?。對腫瘤細胞活性氧的代謝調(diào)控的深入研究，將為通過調(diào)控細胞的氧化還原狀態(tài)而影響腫瘤細胞的行為提供潛在的治療策略。

圖2 腫瘤細胞中的氧化還原適應(yīng)在持續(xù)的氧化應(yīng)激下，腫瘤細胞激活氧化還原敏感性轉(zhuǎn)錄因子如NRF2等，導(dǎo)致抗活性氧系統(tǒng)(超氧化物歧化酶和谷胱甘肽等)的增加，存活因子表達升高和細胞死亡因子表達的抑制。這些轉(zhuǎn)錄因子可以調(diào)節(jié)與細胞增殖、衰老逃避、血管生成和腫瘤轉(zhuǎn)移等相關(guān)基因的表達，促進腫瘤的發(fā)展。另一方面，ROS介導(dǎo)的DNA突變或缺失可促進基因組的不穩(wěn)定性，這為異常基因表達提供了條件，有助于氧化應(yīng)激的適應(yīng)。此外，谷胱甘肽在應(yīng)激適應(yīng)過程中的增高能促進腫瘤細胞耐藥。上述各種因素使腫瘤細胞在高氧化應(yīng)激的情況下適應(yīng)并存活Fig.2 Redox adaptation in cancer cellsIn response to persistent ROS stress, activation of redox-sensitive transcription factors, such as Nrf2, leads to an increase in the expression of ROS-scavenging molecules(such as superoxide dismutase and glutathione), elevation of survival factors, and anti-apoptotic factors.As these transcription factors also have roles in regulating the expression of genes that are responsible for proliferation, senescence evasion, angiogenesis and metastasis, these processes may promote cancer development.On the other hand, ROS-mediated DNA mutations promote genomic instability and this in turn contributes to stress adaptation.Furthermore, increased glutathione synthesis during adaptation can promote drug resistance.These together with enhanced cell survival may render cancer cells more resistant to chemotherapy.All these events enable cancer cells to survive with increased ROS and maintain their viability

3 靶向干預(yù)腫瘤細胞的氧化還原平衡狀態(tài)

處于高氧化應(yīng)激狀態(tài)的腫瘤細胞相對于正常細胞更加依賴細胞的抗氧化系統(tǒng)，因此腫瘤細胞可能對活性氧誘導(dǎo)劑或抑制細胞抗氧化系統(tǒng)的化合物高度敏感。這一觀點在二十年前就已經(jīng)被提出，并為后來的研究結(jié)果所支持[35]。如圖3所示，與正常細胞相比，腫瘤細胞可能因增高的ROS基礎(chǔ)產(chǎn)率而對ROS的進一步誘導(dǎo)累積更為敏感。使用ROS誘導(dǎo)劑可使腫瘤細胞內(nèi)ROS的含量升高，超過腫瘤細胞所能承受的閾值時，則導(dǎo)致腫瘤細胞的損傷和死亡。而正常細胞因自身ROS的基礎(chǔ)水平較低，即使使用ROS誘導(dǎo)劑也不足以使其升高到致死閾值。盡管活性氧誘導(dǎo)劑在許多情況能有效殺滅腫瘤細胞，但亦有報道顯示其療效的局限性和腫瘤細胞對活性氧誘導(dǎo)劑的抵抗性[35]。因此，理解不同氧化還原調(diào)控策略的利弊以及腫瘤細胞內(nèi)在的氧化應(yīng)激狀態(tài)和氧化還原適應(yīng)機制對設(shè)計有效的干預(yù)策略十分重要。目前干預(yù)腫瘤細胞氧化還原狀態(tài)主要有以下4種常用策略(見圖4)。

圖3 活性氧介導(dǎo)選擇性治療的生物學(xué)基礎(chǔ)在生理情況下，正常細胞維持較低的基礎(chǔ)活性氧水平并能夠耐受一定程度的氧化應(yīng)激。而腫瘤細胞處于較高的氧化應(yīng)激狀態(tài)但其活性氧水平尚未達到損傷細胞的水平。因此，腫瘤細胞對抗氧化系統(tǒng)更加依賴，對內(nèi)外源性的氧化刺激更加敏感。進一步升高腫瘤細胞的ROS可以使其超過細胞所能承受的閾值并最終導(dǎo)致腫瘤細胞的死亡。而在同等程度的氧化刺激下，正常細胞較低的基礎(chǔ)ROS即使繼續(xù)升高也達不到細胞損傷死亡的閾值。正常細胞與腫瘤細胞之間這一差異可為活性氧介導(dǎo)選擇性抗腫瘤治療提供生化依據(jù)Fig.3 A biological basis for ROS-mediated therapeutic selectivity Under physiological conditions, normal cells maintain a low basal ROS level and can tolerate a certain level of further ROS stress owing to their low ROS output and intact antioxidant capacity, which together prevent the ROS level from reaching the cell-death threshold under ROS stimulation.In contract, cancer cells have higher ROS output just below the threshold level, and would be more dependent on the antioxidant system and more vulnerable to further oxidative stress induced by ROS stimuli.A further increase of ROS stress in cancer cells is likely to cause a severe elevation of ROS above the threshold level, leading to cell death.This might provide a biochemical basis to design selective therapeutic strategies using ROS-mediated mechanisms

圖4 通過活性氧介導(dǎo)機制靶向殺滅腫瘤細胞細胞內(nèi)活性氧水平是由活性氧產(chǎn)生和消除所決定的。適度增加活性氧可以通過氧化還原適應(yīng)機制來調(diào)節(jié)并不對細胞產(chǎn)生毒性作用。然而，顯著增加ROS產(chǎn)生和/或抑制其消除能誘導(dǎo)腫瘤細胞內(nèi)ROS顯著積累，超過細胞的應(yīng)激適應(yīng)能力時將導(dǎo)致氧化損傷和細胞死亡。圖中標出4種能導(dǎo)致活性氧嚴重積累的潛在抗腫瘤策略Fig.4 Targeting cancer cells through ROS-mediated mechanismsCellular ROS level is determined by ROS generation and elimination.A moderate ROS increase can by balanced by redox adaptation mechanisms and thus avoid cytotoxicity.However, a severe increase in ROS generation and/or inhibit ROS elimination can induce significant accumulation of ROS in cancer cells，which cannot be reversed by redox adaptation mechanisms.This will lead oxidative damage and cell death.Four potential intervention strategies to induce severe ROS accumulation as potential therapeutic approaches are indicated in the figure

3.1 促進ROS的產(chǎn)生 盡管腫瘤細胞具有較強的抗氧化系統(tǒng)，其ROS仍然維持在比正常細胞更高的水平。因此，腫瘤細胞可能比正常細胞對ROS的進一步累積更敏感，這就為選擇性殺滅腫瘤細胞提供了一個治療窗。細胞的氧化還原狀態(tài)由活性氧的生成和消除速率的精細調(diào)節(jié)以維持平衡。增加ROS產(chǎn)生或減少ROS清除會破壞氧化還原平衡，導(dǎo)致ROS水平升高，當ROS超過細胞耐受的閾值時就會導(dǎo)致細胞損傷乃至細胞死亡。很多藥物都可以升高ROS水平進而選擇性殺傷腫瘤細胞。治療白血病的有效藥物三氧化二砷可通過干預(yù)呼吸鏈的功能增加ROS的產(chǎn)生[36]。紫杉烷類(紫杉醇和多西他賽)、長春花生物堿(長春新堿和長春堿)和抗代謝物(抗葉酸)能促進細胞色素c從線粒體釋放進而誘導(dǎo)細胞死亡，這一過程也干擾了電子傳遞鏈，造成超氧自由基的產(chǎn)生[37]。鉑類藥物(順鉑、卡鉑和奧沙利鉑)和蒽環(huán)類(阿霉素、表柔比星和柔紅霉素)也通過不同的機制誘導(dǎo)產(chǎn)生大量的ROS[38]。有報道認為，臨床廣泛應(yīng)用的5-氟尿嘧啶(5-FU)可通過p53依賴途徑誘導(dǎo)線粒體活性氧的生成[39]。此外，放射治療可導(dǎo)致ROS的顯著增加[40]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激亦可誘導(dǎo)氧化應(yīng)激而殺傷腫瘤細胞，蛋白酶抑制劑硼替佐米正是通過此機制誘導(dǎo)ROS的異常增高[41]。

3.2 干擾活性氧代謝 細胞內(nèi)ROS的消除依靠多個抗氧化系統(tǒng)，包括還原型谷胱甘肽(GSH)系統(tǒng)，硫氧還原蛋白系統(tǒng)和過氧化氫酶等?？梢酝ㄟ^靶向這些抗氧化系統(tǒng)中的關(guān)鍵酶，進而抑制細胞的抗氧化能力和消除氧化應(yīng)答所造成的抗藥性。目前作用于細胞內(nèi)谷胱甘肽的藥物有丁硫氨酸砜(BSO)、異硫氰酸酯和氮丙啶衍生物等。BSO是谷胱甘肽合成的限速酶谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)的抑制劑，該化合物已被證明在多種類型的腫瘤細胞中可導(dǎo)致GSH減少進而體現(xiàn)其抗癌活性[42]。異硫氰酸酯能與GSH結(jié)合而導(dǎo)致GSH的快速耗盡。此外，胱氨酸/谷氨酸轉(zhuǎn)運蛋白抑制劑，如柳氮磺胺吡啶，可通過抑制谷胱甘肽合成中的限速底物半胱氨酸的前體胱氨酸的攝入而導(dǎo)致細胞內(nèi)GSH的減少[43]。對于硫氧還原蛋白系統(tǒng)，1-甲基丙基2-咪唑基二硫化物(PX-12)是硫氧還原蛋白1(TRX-1)的抑制劑，在體內(nèi)具有抗腫瘤活性[44]。然而，細胞質(zhì)中的抗氧化劑并不能有效清除線粒體中的ROS，有研究表明在動物模型中使用線粒體特異性的抗氧化劑可以顯著減少成瘤率[45]。

考慮到氧化應(yīng)激在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的重要作用，通過干預(yù)氧化還原代謝消除氧化應(yīng)激反應(yīng)已被認為是預(yù)防和治療腫瘤的重要策略。然而，氧化還原干預(yù)在腫瘤治療中的作用非常復(fù)雜，因而存在不少爭議。曾有報道顯示，抗氧化劑N-乙酰葡糖胺(NAC)可以抑制淋巴瘤在小鼠體內(nèi)的生長[46]，但后來的研究又發(fā)現(xiàn)NAC可增加小鼠黑色素瘤的轉(zhuǎn)移病灶[8]。大多數(shù)抗氧化劑在臨床試驗中并未顯示出有效的治療效果。一個可能的解釋是，細胞為了存活啟動了有效的氧化還原調(diào)控，即使外源性給予抗氧化劑，對體內(nèi)細胞的氧化還原平衡狀態(tài)影響也相對有限。需要特別指出的是，因為多數(shù)腫瘤細胞處于高氧化應(yīng)激狀態(tài)，給予抗氧化劑可能利于腫瘤的細胞存活并增強其抗藥性。因此，這方面的臨床研究必須十分慎重。

3.3 克服與氧化應(yīng)激相關(guān)的耐藥性 鑒于正常細胞與惡性細胞之間ROS含量的差異，給予外源性活性氧誘導(dǎo)劑可優(yōu)先殺傷腫瘤細胞。然而，腫瘤細胞在持續(xù)高氧化應(yīng)激的環(huán)境下可能上調(diào)細胞的抗氧化系統(tǒng)，表現(xiàn)在上調(diào)的細胞內(nèi)GSH含量，增高某些抗氧化酶的表達等。例如，耐藥的白血病細胞HL-60可抵抗過氧化氫的細胞毒作用，這很可能是由于該細胞高表達過氧化氫酶所致[47]。腫瘤細胞對三氧化二砷的抵抗與細胞內(nèi)HMOX1、SOD1和GSH的上調(diào)有關(guān)[48]。同樣，研究表明ROS誘導(dǎo)劑，如紫杉醇，阿霉素或鉑類藥物的耐藥與細胞抗氧化能力的升高相關(guān)[49]。因此，耐藥與腫瘤細胞對內(nèi)源性氧化應(yīng)激的適應(yīng)有密切關(guān)系。

基于上述原因，消除腫瘤細胞對氧化應(yīng)激的適應(yīng)機制是克服腫瘤耐藥的重要措施。一種策略是靶向干預(yù)控制ROS和氧化還原敏感性的關(guān)鍵分子。谷胱甘肽，硫氧還原蛋白和過氧化物酶被認為是氧化還原干預(yù)的潛在靶標。以往研究顯示，天然化合物苯乙基異硫氰酸酯(PEITC)能夠優(yōu)先殺傷RAS誘導(dǎo)的惡性轉(zhuǎn)化的卵巢細胞和來自患者的原代白血病細胞，并有效克服其對格列衛(wèi)的耐藥性。PEITC可使腫瘤細胞內(nèi)的谷胱甘肽迅速耗盡，有效破壞氧化應(yīng)激的適應(yīng)機制并導(dǎo)致對氧化還原敏感的MCL-1等生存蛋白的降解[50]。前已述及，單獨使用活性氧誘導(dǎo)劑對腫瘤可能療效不佳，故更好的策略可能是活性氧誘導(dǎo)劑與能夠消除氧化應(yīng)激適應(yīng)機制的化合物聯(lián)用。最近的研究顯示，PEITC和其他抗腫瘤藥物聯(lián)合可產(chǎn)生更強的抗腫瘤能力[51]。隨著該領(lǐng)域研究的進展，越來越多的新型化合物能有效的破壞腫瘤細胞內(nèi)的氧化還原機制從而實現(xiàn)有效殺滅腫瘤細胞并克服腫瘤耐藥。

3.4 氧化還原干預(yù)的聯(lián)用藥物策略 在腫瘤治療中，單獨使用某一特定的藥物較容易出現(xiàn)耐藥，療效也相對較差。因此，臨床上大多采用聯(lián)合用藥的治療方案。由于細胞的氧化還原平衡狀態(tài)由ROS的產(chǎn)生和活性氧的消除率2個方面所決定，這為聯(lián)合用藥干預(yù)腫瘤細胞的氧化還原平衡提供了合適的生化基礎(chǔ)。上述的聯(lián)合ROS誘導(dǎo)劑和抑制細胞抗氧化能力的化合物PEITC就是該聯(lián)合用藥方案的一個例子?；钚匝跽T導(dǎo)劑三氧化二砷和超氧化物歧化酶抑制劑聯(lián)合應(yīng)用對原發(fā)性慢性淋巴細胞白血病(chronic lymphocytic leukemia，CLL)有顯著療效，對CLL細胞的毒性明顯增強[52]。聯(lián)合三氧化二砷和消耗GSH的抗壞血酸在治療復(fù)發(fā)或難治的多發(fā)性骨髓瘤中也有明顯治療效果[53]。在鼻咽癌中使用硼替唑米聯(lián)合SAHA(辛二酰苯胺異羥肟酸)具有協(xié)同作用，導(dǎo)致ROS介導(dǎo)的細胞死亡[54]。最近的研究顯示，聯(lián)合靶向線粒體呼吸鏈的藥物和抑制清除線粒體ROS的藥物可以阻止原發(fā)性肝細胞腫瘤在小鼠體內(nèi)的轉(zhuǎn)移[45]。

此外，研究發(fā)現(xiàn)聯(lián)合抑制GSH代謝和硫氧還蛋白代謝的藥物可增強腫瘤細胞對17-烯丙基氨基-17-去甲氧基格爾德霉素(17-AAG)的治療敏感性[55]。熱休克蛋白90(HSP90)的上調(diào)是腫瘤細胞重要的保護機制，而17-AAG能結(jié)合HSP90并對其產(chǎn)生抑制作用。HSP90抑制劑與mTOR抑制劑雷帕霉素聯(lián)合可導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和線粒體損傷，從而增強由活性氧介導(dǎo)的殺滅腫瘤細胞的活性，并明顯降低腫瘤在小鼠體內(nèi)的生長[56]。因此，HSP90抑制劑與誘導(dǎo)氧化應(yīng)激的藥物聯(lián)合能有效殺滅腫瘤細胞。另外，有研究顯示聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶(PARP)抑制劑，如veliparib或olaparib與卡鉑聯(lián)用對多種不同類型的腫瘤都有較好的治療效果[57]。放射治療和傳統(tǒng)的細胞毒性抗癌藥物大都可以直接或間接地增加腫瘤細胞中ROS水平，因此聯(lián)合放療或傳統(tǒng)化療與抑制抗氧化系統(tǒng)的藥物有望取得治療腫瘤的良好療效。

4 腫瘤干細胞的氧化還原狀態(tài)

化療或放療后腫瘤復(fù)發(fā)的重要原因之一是未能徹底殺滅具有高度抗藥性的腫瘤干細胞[58]?？紤]到氧化還原適應(yīng)在腫瘤耐藥中的重要作用，因此推測腫瘤干細胞耐藥也與氧化還原調(diào)控機制密切相關(guān)。與一般腫瘤細胞相比，腫瘤干細胞的ROS水平較低，這有利于腫瘤干細胞維持自我更新能力和干性。腫瘤干細胞有較低的ROS水平的主要原因之一是抗氧化物質(zhì)GSH的合成增高和磷酸戊糖途徑的高活性，后者產(chǎn)生較多還原物質(zhì)NADPH。另外，腫瘤干細胞的線粒體活性氧的產(chǎn)生可能下降(見圖5)。有研究發(fā)現(xiàn)CD44+的胃腸腫瘤干細胞通過激活胱氨酸谷氨酸轉(zhuǎn)運載體而增加GSH的合成。腫瘤干細胞中低水平的ROS有助于其抵抗放射治療，因為放射線主要通過誘導(dǎo)自由基的產(chǎn)生而發(fā)揮其對細胞的毒性作用，而腫瘤干細胞中的高GSH和低ROS水平不利于放射線對細胞的損傷作用[59]。另外，腫瘤干細胞在體內(nèi)常處于相對缺氧的環(huán)境中，這些缺氧的環(huán)境可能限制其分化和維持其干性[60]。缺氧可能會限制內(nèi)源性活性氧的產(chǎn)生，不利于放射線對腫瘤干細胞的殺滅。殘留的腫瘤干細胞會導(dǎo)致日后腫瘤的復(fù)發(fā)。

圖5 腫瘤干細胞內(nèi)低水平ROS的可能機制線粒體呼吸下調(diào)導(dǎo)致ROS生成減少，磷酸戊糖途徑代謝活躍使NADPH生成增加以及增高的GSH合成能力等因素使腫瘤干細胞內(nèi)的ROS水平降低。這些因素可促進腫瘤干細胞細胞存活和耐藥性Fig.5 Possible mechanisms for maintaining a low level of ROS in cancer stem cellsDecreased ROS production from low mitochondrial respiration, increased NADPH production through pentose phosphate metabolism, and increased GSH synthesis together result in a low level of ROS in cancer stem cells.This can promote cancer stem cell survival and resistance to therapy

考慮到腫瘤干細胞的生物學(xué)特性，可以推測這群特殊的細胞能夠通過較高的抗氧化能力將ROS維持在一個較低的范圍內(nèi)以保持其干性和腫瘤形成的能力。腫瘤干細胞的存活和耐藥可能歸因于高度上調(diào)的抗氧化機制。在這個重要的研究領(lǐng)域中，首先確定腫瘤干細胞相比于正常干細胞和一般腫瘤細胞的氧化還原狀態(tài)是很重要的。明確腫瘤干細胞中維持氧化還原平衡的關(guān)鍵分子機制是設(shè)計有效殺滅這些細胞以徹底清除腫瘤的關(guān)鍵。破壞腫瘤干細胞的抗氧化系統(tǒng)是否能夠增加對其他抗腫瘤藥物的敏感性？外源性的活性氧應(yīng)激是否能夠?qū)е履[瘤干細胞失去其干性？氧化還原調(diào)節(jié)策略聯(lián)合傳統(tǒng)抗癌藥物是否能夠更有效殺滅腫瘤干細胞？這些問題尚需進一步深入研究。

5 結(jié)論和展望

腫瘤細胞的高ROS水平可能促進細胞增殖，而對高氧化應(yīng)激的適應(yīng)可能促進細胞存活和抗藥性。這2種現(xiàn)象體現(xiàn)了氧化應(yīng)激在腫瘤發(fā)生發(fā)展及耐藥中的關(guān)鍵作用。通過氧化還原調(diào)節(jié)策略靶向干預(yù)腫瘤細胞的這些生化特征可望提高抗腫瘤的選擇性和克服抗藥性。氧化應(yīng)激一方面促進腫瘤發(fā)展，另一方面導(dǎo)致氧化損傷，這為腫瘤治療提供了2種可能的干預(yù)策略。一種策略是通過抗氧化劑來增加ROS清除的能力，以期抑制腫瘤生長。然而，大規(guī)模的前瞻性隨機臨床試驗發(fā)現(xiàn)在長期服用抗氧化劑維生素E的健康男性人群中前列腺癌的發(fā)生率升高，這提示抗氧化劑可能促進某些腫瘤的發(fā)生[7]。也有實驗數(shù)據(jù)顯示抗氧化劑NAC和維生素E通過減少ROS從而降低DNA損傷和p53的表達，有利于腫瘤細胞的增殖。此外，由于非干細胞在一定條件下可以向干細胞轉(zhuǎn)化，如果低水平的ROS利于維持細胞的干性，那么抗氧化劑將有可能促進腫瘤干細胞的生成[59]。一些研究者推測，補充抗氧化劑可用于預(yù)防腫瘤或者增強化療和放療療效。然而，最近的研究亦顯示出相反的結(jié)果，提示抗氧化劑能夠促進腫瘤細胞的存活和增殖。

另一種治療策略是用具有氧化作用或能夠抑制抗氧化系統(tǒng)的藥物來進一步升高ROS從而殺滅腫瘤細胞。在實驗?zāi)Ｐ椭?，ROS誘導(dǎo)劑通過升高胞內(nèi)的ROS，使這一氧化應(yīng)激超過細胞抗氧化系統(tǒng)所能承受的閾值而殺滅腫瘤細胞[61]。GSH作為細胞內(nèi)主要的抗氧化劑，干預(yù)其代謝可望成為抗腫瘤藥物的重要靶標。然而，其他具有抗氧化能力的酶對腫瘤細胞的存活也是至關(guān)重要的，是潛在的治療靶標。進一步探究細胞內(nèi)抗氧化分子的代謝和調(diào)控將利于設(shè)計更有效的抗腫瘤治療策略。聯(lián)合使用ROS誘導(dǎo)劑和抑制ROS清除的藥物能引起腫瘤細胞內(nèi)ROS嚴重升高，可能是提高抗腫瘤作用的有效策略。然而這一策略也可能促進正常細胞突變。因此，通過調(diào)節(jié)ROS治療腫瘤是否獲益目前仍有一定的爭議。

近年來大量的研究表明改變細胞氧化還原代謝在不同類型腫瘤的發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用。對高氧化應(yīng)激的適應(yīng)在一定程度上解釋了腫瘤細胞在持續(xù)內(nèi)源性高氧化狀態(tài)下的存活和抗藥性。腫瘤細胞普遍具有增強的抗氧化能力，這與放療化療抵抗相關(guān)。因此，通過藥物消除這一適應(yīng)機制并聯(lián)合傳統(tǒng)化放療可望提高療效和克服腫瘤細胞的抗藥性。由于腫瘤干細胞在腫瘤的發(fā)生發(fā)展及耐藥性過程中起關(guān)鍵作用，通過氧化還原調(diào)節(jié)的手段消除腫瘤干細胞在腫瘤治療中具有重要意義。目前對腫瘤干細胞的的氧化還原狀態(tài)及其調(diào)控的認識尚屬初期階段，有許多不明確及爭議之處。隨著新技術(shù)的發(fā)展，特別是代謝組學(xué)分析技術(shù)與活性氧實時檢測及細胞內(nèi)活性氧的定位分析技術(shù)將大幅度推進對腫瘤氧化應(yīng)激和代謝適應(yīng)及其調(diào)控機制的研究，并據(jù)此設(shè)計出更有效的干預(yù)策略，以期提高腫瘤療效。

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(編校：吳茜)

作 者 簡 介

黃蓬，教授，博士生導(dǎo)師。畢業(yè)于美國德州大學(xué)休斯頓生物醫(yī)學(xué)研究生院，獲博士學(xué)位。2007年成為美國德州大學(xué)M.D.Anderson癌癥中心終身教授；2008年教育部長江學(xué)者講座教授，2010年國家“千人計劃”特聘專家，任中山大學(xué)腫瘤防治中心教授。主要研究方向為腫瘤代謝，腫瘤細胞線粒體功能改變，活性氧應(yīng)激調(diào)控及代謝靶向抗癌藥物。代表性論文發(fā)表于Nature,CancerCell,NatureCellBiology,JNCI，NatureRevDrugDiscovery等學(xué)術(shù)刊物，現(xiàn)為MolecularCancer副主編及多家專業(yè)雜志的編委。

ROS-mediated mechanisms: an anticancer strategy

YANG Meng-qi, LIU Pan-pan, HUANG PengΔ

(Department of Experimental Research, SunYat-sen University Cancer Center, Guangzhou 510060, China)

Under the influence of oncogenic signals and abnormal metabolism, the redox status of cancer cells often differs from that of the normal cells, manifesting as elevated generation of reactive oxygen species(ROS) and oxidative stress.Many signaling pathways involved in tumorigenesis can directly or indirectly regulate ROS metabolism.Currently, the biological significance of increased ROS in cancer cells is still somewhat controversial.ROS on the one hand can promote cancer development and drug resistance, and on the other hand can also cause cell injury and even cell death.To maintain cell viability and proliferation, cancer cells usually up-regulate their antioxidant capacity in adaptation to the intrinsic oxidative stress.Such adaptive mechanisms to oxidative stress are highly important in both cancer development and also play a major role in cancer cell response to therapy.Compelling evidences from recent studies have suggested that targeting the redox regulation mechanisms through proper intervention strategies may have significant therapeutic implications in cancer treatment.This article will focus on alterations of redox status in cancer cells, their adaptation to oxidative stress, and the underlying mechanisms.Potential therapeutic strategies based on such biochemical characteristics of cancer cells will also be discussed.

reactiveoxygen species; cancer cells; ROS stress; redox adaptation

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.09.004

國家自然科學(xué)基金(81430060；81502573)；廣東省自然科學(xué)基金(2014A030310421)

楊夢祺，女，博士在讀，E-mail：yangmq@sysucc.org.cn；黃蓬，通信作者，男，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：腫瘤代謝，腫瘤細胞線粒體功能改變，活性氧應(yīng)激調(diào)控及代謝靶向抗癌藥物，E-mail：huangpeng@sysucc.org.cn。

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