程 潔， 樓之茵， 李 琳， 趙忠新

(1. 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，上海 200092； 2. 第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)征醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，上海 200003)

?

·基礎(chǔ)研究·

大麻素1型受體過(guò)表達(dá)對(duì)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎小鼠的免疫調(diào)節(jié)

程 潔1， 樓之茵1， 李 琳1， 趙忠新2

(1. 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，上海 200092； 2. 第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)征醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，上海 200003)

目的 探討大麻素1型受體(cannabinoid 1 receptor, CB1R)過(guò)表達(dá)對(duì)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis, EAE)小鼠細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)的影響。方法 選用C57B/L6小鼠制備EAE小鼠模型，采用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染技術(shù)制備CB1R過(guò)表達(dá)組。觀察假手術(shù)組和CB1R過(guò)表達(dá)組小鼠的神經(jīng)功能缺損癥狀和體質(zhì)量變化；用ELISA法檢測(cè)EAE小鼠脊髓、脾臟中細(xì)胞因子INF-γ、IL-6、IL-10、IL-17、IL-1β、TNF-α濃度的變化。結(jié)果 與相同時(shí)間點(diǎn)的假手術(shù)組相比，CB1R過(guò)表達(dá)組出現(xiàn)神經(jīng)功能缺損的時(shí)間及癥狀嚴(yán)重程度和體質(zhì)量減輕程度顯著降低(P<0.05)。假手術(shù)組和CB1R過(guò)表達(dá)組中，細(xì)胞因子在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周免疫組織的分布不相同。與假手術(shù)組相比，CB1R過(guò)表達(dá)組EAE小鼠脊髓組織中IL-10的濃度顯著升高(P<0.01)，而INF-γ、IL-6、IL-17、IL-1β、TNF-α的濃度顯著降低(P<0.05)。結(jié)論 CB1R過(guò)表達(dá)對(duì)EAE小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性損傷的保護(hù)作用，可能通過(guò)上調(diào)抑炎因子，下調(diào)促炎因子的表達(dá)實(shí)現(xiàn)。

大麻素1型受體； 實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎； CB1R過(guò)表達(dá)； 細(xì)胞因子

多發(fā)性硬化(multiple sclerosis, MS)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system， CNS)炎性脫髓鞘自身免疫性疾病，其發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，但普遍認(rèn)為與免疫調(diào)節(jié)功能異常密切相關(guān)。實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephal-omyelitis, EAE)是研究多發(fā)性硬化的經(jīng)典動(dòng)物模型。通過(guò)對(duì)EAE的大量研究，發(fā)現(xiàn)在EAE病情演變中，由細(xì)胞因子(cytokines， CK)構(gòu)成的免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)起著重要而復(fù)雜的作用[1]。

內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)(endocannabinoid system, ECS)包括內(nèi)源性大麻素，調(diào)節(jié)大麻素合成、轉(zhuǎn)運(yùn)與失活的相關(guān)蛋白，酶類和大麻素受體(cannabinoid receptor， CBR)。ECS具有廣泛的生理作用，目前認(rèn)為，它可能通過(guò)抑制神經(jīng)興奮性毒性和參與免疫炎性反應(yīng)維持CNS微環(huán)境穩(wěn)定，進(jìn)而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。研究證實(shí)，MS中存在ECS功能失調(diào)[2]。所以，大麻素受體(cannabinoid receptor， CBR)在MS發(fā)生發(fā)展中的調(diào)節(jié)作用成為新的研究熱點(diǎn)和難點(diǎn)。

大麻素受體包括大麻素1型受體(CB1R)和大麻素2型受體(CB2R)，均屬G蛋白偶聯(lián)受體，目前研究較多且得到共識(shí)的是CB1R。本研究通過(guò)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染技術(shù)誘導(dǎo)CB1R高表達(dá)觀察EAE小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)中細(xì)胞因子的變化，探討CB1R在EAE發(fā)生發(fā)展中可能的保護(hù)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及試劑

健康雌性C57B/L6小鼠24只，8～10周齡，體質(zhì)量22～25g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。

MOG35-55肽段購(gòu)自北京聯(lián)科生物公司。完全弗氏佐劑(CFA)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。結(jié)核菌素(TB)購(gòu)自美國(guó)BD Difco公司。百日咳毒素(PTX)購(gòu)自美國(guó)Enzo Life Sciences公司。ELISA檢測(cè)盒購(gòu)自美國(guó)Peprotech公司。

1.2 MOG35-55抗原混懸液制備

MOG35-55肽段3mg，溶于1ml PBS中(3mg/ml)；3mg結(jié)核菌素溶于1ml完全弗氏佐劑(4mg/ml)；采用針管混合器將等體積的兩種溶液體充分混合，制成油包水樣乳白色混懸液，以靜置后無(wú)分層為合格。

1.3 構(gòu)建由MOG35-55誘導(dǎo)的EAE小鼠模型

C57B/L6小鼠背部脊柱兩側(cè)四點(diǎn)皮下注射MOG35-55抗原混懸液(200μl/只)，同時(shí)尾靜脈注射PTX 200ng/100μl，48h后再次尾靜脈注射PTX 200ng/100μl加強(qiáng)免疫。所有小鼠置相同的飼養(yǎng)環(huán)境，自由飲食，自然作息。每日記錄小鼠體質(zhì)量，評(píng)估臨床癥狀。

1.4 EAE小鼠癥狀評(píng)估及分組

從免疫當(dāng)天進(jìn)行小鼠臨床癥狀評(píng)分，直至免疫后第28天。采用國(guó)際評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下。0分： 無(wú)癥狀；1分： 垂尾；2分： 行路不穩(wěn)、后肢力弱、翻正反射遲鈍；3分： 后肢麻痹和(或)前肢力弱；4分： 前肢麻痹；5分： 四肢癱；6分： 瀕臨死亡或死亡。

EAE小鼠24只，隨機(jī)分成EAE假手術(shù)組(12只)和EAECB1R過(guò)表達(dá)組(12只)。EAE假手術(shù)組于L4～5間隙注射15μl溶劑為對(duì)照，CB1R過(guò)表達(dá)組于L4～5間隙注射經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)篩選的含CB1R過(guò)表達(dá)基因序列的干擾載體，過(guò)表達(dá)NM號(hào)(NM_007726.3)，載體pLOV.CMV.eGFP.2A.EF1a.PuroR。引物序列Primer(+)： 5′-AACC-CCGGTCCGATGGCTAGCATGCATGAAGTCGATC-TTAGACGGCC-3′，同源重組序列目的基因5′端配對(duì)序列；Primer(-)： CGTCATCCTTGTAGTCG-CTAGCCAGAGCCTCGGCAGACGTGTC同源重組序列目的基因3′端配對(duì)序列。

1.5 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)細(xì)胞因子

注射后第28天分別取假手術(shù)組和過(guò)表達(dá)組EAE小鼠的脊髓和脾臟，稱取80mg組織，冰浴條件下提取組織胞漿蛋白。在37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育48h后，取上清液，用ELISA法檢測(cè)INF-γ、IL-6、IL-10、IL-17、IL-1β、TNF-α的濃度。

隨著經(jīng)濟(jì)發(fā)展、人口增加和資源的過(guò)度開發(fā)，我國(guó)水資源供給和需求出現(xiàn)嚴(yán)重的失衡，計(jì)劃體制下的水資源管理體制對(duì)此無(wú)能無(wú)力，政府因此嘗試用市場(chǎng)化方法來(lái)解決我國(guó)面臨的水資源難題。隨著新水法的頒布，我國(guó)水資源市場(chǎng)配置的改革進(jìn)程明顯提速。2004年水利部下發(fā)《水利部關(guān)于內(nèi)蒙古寧夏黃河干流水權(quán)轉(zhuǎn)換試點(diǎn)工作的指導(dǎo)意見》，2005年頒布并實(shí)施了《水利部關(guān)于水權(quán)轉(zhuǎn)讓的若干意見》《關(guān)于印發(fā)水權(quán)制度建設(shè)框架的通知》，2006年國(guó)務(wù)院頒布實(shí)施《取水許可和水資源費(fèi)征收管理?xiàng)l例》，2008年水利部頒布《水量分配暫行辦法》和《取水許可辦法》。這些法律和法規(guī)的頒布，標(biāo)志著我國(guó)正式啟動(dòng)水權(quán)市場(chǎng)建設(shè)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用GraphPad Prism 5.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料用F檢驗(yàn)進(jìn)行樣本方差齊性檢驗(yàn)，樣本符合正態(tài)分布且方差齊性時(shí)，兩組均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 假手術(shù)組和過(guò)表達(dá)組EAE小鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分的動(dòng)態(tài)變化

免疫后每日評(píng)估EAE小鼠的神經(jīng)功能缺損，測(cè)量EAE小鼠體質(zhì)量。假手術(shù)組最早出現(xiàn)神經(jīng)功能缺損為第10天，而CB1R過(guò)表達(dá)組出現(xiàn)神經(jīng)功能缺損為第14天，顯著晚于EAE假手術(shù)組(P<0.05)。CB1R過(guò)表達(dá)組神經(jīng)功能缺損評(píng)分顯著低于EAE假手術(shù)組(P<0.05)，見圖1A。與假手術(shù)組相比，CB1R過(guò)表達(dá)組EAE小鼠體質(zhì)量減輕程度顯著好于假手術(shù)組(P<0.05)，見圖1B。

2.2 假手術(shù)組與CB1R過(guò)表達(dá)組EAE小鼠不同組織中細(xì)胞因子的表達(dá)

ELISA結(jié)果顯示： 無(wú)論是假手術(shù)組還是CB1R過(guò)表達(dá)組，細(xì)胞因子INF-γ、IL-6、IL-10、IL-17、TNF-α在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的表達(dá)顯著高于外周免疫組織(P<0.01)，而IL-1β在外周免疫組織中的表達(dá)顯著高于中樞神經(jīng)系統(tǒng)(P<0.01)，見表1。

2.3 CB1R過(guò)表達(dá)對(duì)不同組織中細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)

圖1 不同時(shí)間點(diǎn)EAE假手術(shù)組和CB1R過(guò)表達(dá)組小鼠神經(jīng)功能缺損及體質(zhì)量的變化Fig.1 Clinical score and body weight at different time point between EAE sham group and CB1R over-expressing groupA； 臨床評(píng)分；B； 體質(zhì)量；與CB1R過(guò)表達(dá)組相比，*P<0.05，△P<0.01

表1 假手術(shù)組與CB1R過(guò)表達(dá)組脊髓組織與脾臟中細(xì)胞因子的表達(dá)

與脾臟細(xì)胞因子相比，*P<0.05，ΔP<0.01

圖2 CB1R過(guò)表達(dá)對(duì)脊髓、脾臟組織中IL-10、INF-γ、IL-17、IL-1β、IL-6、TNF-α濃度調(diào)節(jié)Fig.2 Regulation to INF-γ, IL-6, IL-10, IL-17, IL-1β and TNF-α in spinal cord and spleen of CB1R over-expressing groupA； 脊髓組織，B： 脾臟；*P<0.05，**P<0.01

3 討 論

大多數(shù)研究認(rèn)為，EAE/MS主要是T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫性疾病，特異性抗原誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞發(fā)生免疫應(yīng)答所致。根據(jù)所分泌的細(xì)胞因子不同，T細(xì)胞主要分化成Th0、Th1、Th2細(xì)胞和Th3細(xì)胞四個(gè)亞型。其中Th1細(xì)胞所分泌的代表性因子包括INF-γ、TNF-α、IL-1β、IL-12等，參與誘導(dǎo)麻痹和炎癥反應(yīng)，主要促使EAE的發(fā)生、發(fā)展和加重；而Th2細(xì)胞所分泌代表性因子包括IL-10、IL-4、IL-13、TGF-β等，主要可使EAE/MS抑制或逆轉(zhuǎn)[3]。Th1/Th2細(xì)胞反應(yīng)失衡是EAE/MS發(fā)病的重要機(jī)制[4]。近年來(lái)，發(fā)現(xiàn)一種分泌IL-17的新的Th亞群(Th17)，被認(rèn)為是可能參與組織炎癥和免疫反應(yīng)的主要細(xì)胞亞型[3]。

IL-17生物學(xué)活性的特征是具有強(qiáng)大的致炎性。它能促進(jìn)機(jī)體局部產(chǎn)生趨化因子，如IL-8、MCP-1(單核細(xì)胞趨化蛋白-1)、Gro-α(生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子-α)，因此有助于單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的迅速增多；能刺激產(chǎn)生IL-6和PGE-2，增強(qiáng)局部炎癥[5]。Brucklacher-Waldert等[5]發(fā)現(xiàn)，IL-17mRNA表達(dá)在MS患者血和腦脊液中病毒升高。Dardalhon等[6]發(fā)現(xiàn)，在EAE的CNS中，早期以Th17細(xì)胞浸潤(rùn)為主，而晚期卻以Thl細(xì)胞浸潤(rùn)為主。Th17細(xì)胞的產(chǎn)生快于Thl細(xì)胞，啟動(dòng)急性炎癥的形成，而Thl在其后的炎癥維持中發(fā)揮作用[7]。INF-γ是對(duì)MS有影響的促炎因子，可反映MS的活動(dòng)性并檢測(cè)藥物療效[8]。研究[9]證明，IL-10水平升高在MS的免疫病理過(guò)程中起到重要的保護(hù)作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，脊髓組織中IL-10、IL-17、TNF-α、INF-γ和IL-6的濃度無(wú)論在假手術(shù)組還是CB1R過(guò)表達(dá)組都顯著高于脾臟中。而IL-1β濃度反之，無(wú)論在假手術(shù)組還是CB1R過(guò)表達(dá)組脾臟中顯著高于脊髓。由此推測(cè)，CB1R參與EAE的發(fā)生發(fā)展主要通過(guò)中樞神經(jīng)系統(tǒng)免疫微環(huán)境發(fā)揮作用。

隨著研究的深入，目前發(fā)現(xiàn)大麻素受體系統(tǒng)在眾多神經(jīng)系統(tǒng)疾病中起著重要的神經(jīng)保護(hù)和免疫調(diào)節(jié)的作用[10-11]。樓之茵等[12]的研究發(fā)現(xiàn)，給予CB1R抑制劑(SR141716A、SR1)，EAE小鼠脊髓IL-17、IL-1β、IL-6、TNF-α的濃度顯著升高，而IL-10則顯著降低，與之對(duì)應(yīng)的是SR1誘導(dǎo)的EAE小鼠起病時(shí)間提前以及早期神經(jīng)功能缺損癥狀加重。

本研究發(fā)現(xiàn)，CB1R過(guò)表達(dá)組EAE小鼠脊髓中抑炎因子IL-10的濃度明顯升高而促炎因子INF-γ、IL-17、IL-1β、IL-6、TNF-α的濃度顯著降低。與之相對(duì)應(yīng)，CB1R過(guò)表達(dá)組EAE小鼠臨床癥狀發(fā)作時(shí)間顯著延遲，神經(jīng)功能缺損程度也顯著減輕，同時(shí)CB1R過(guò)表達(dá)組EAE小鼠的體質(zhì)量減輕程度也好于假手術(shù)組。我們推測(cè)，中樞神經(jīng)系統(tǒng)CB1R過(guò)表達(dá)可能通過(guò)激活抑炎因子IL-10、抑制促炎因子IL-17等起到神經(jīng)保護(hù)作用。

MS/EAE的免疫機(jī)制復(fù)雜，CB1R過(guò)表達(dá)能減輕EAE小鼠的神經(jīng)功能缺損程度，提示CB1R對(duì)小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性損傷有保護(hù)作用，這種作用可能通過(guò)上調(diào)抑炎因子，下調(diào)促炎因子的表達(dá)實(shí)現(xiàn)。

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Effect of cannabinoid 1 receptor over-expression on immunomodulation in mice with experimental autoimmune encephalomyelitis

CHENGJie1，LOUZhi-yin1,LILin1，ZHAOZhong-xin2

(1. Dept. of Neurology， Xinhua Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine， Shanghai 200092， China；2. Dept. of Neurology， Changzheng Hospital, Second Military Medical University， Shanghai 200003， China)

Objective To investigate the effect of cannabinoid 1 receptor (CB1R) over-expression on immunomodulation in mice with experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). Methods EAE was induced in C57B/L6 mice, CB1R over-expression was prepared by plasmid transfection. The change of neurological deficit and the body weight were compared between sham group and over-expression group. Serum cytokines INF-γ, IL-6, IL-10, IL-17, IL-1β and TNF-α were measured by ELISA. Results The onset time of neurologic impairment, the severity of symptoms and weight loss were significantly lower in CB1R over-expression group than sham group (P<0.05). The cytokine profile was different between central nervous system and peripheral immune tissue in both groups. Compared with sham group, the level of IL-10 in spinal cord was significantly higher (P<0.01) and INF-γ, IL-6, IL-17, IL-1β and TNF-α were significantly lower (P<0.05). Conclusion CB1R can protect central nervous system from inflammatory injury in EAE mice by up-regulation of inhibiting inflammatory cytokines and down-regulation of proinflammatory cytokines.

cannabinoid 1 receptor; experimental autoimmune encephalomyelitis; CB1R over-exp-ression; cytokines

10.16118/j.1008-0392.2016.02.001

2015-12-06

國(guó)家自然科學(xué)青年基金(81200921)

程 潔(1973—)，女，主治醫(yī)師，碩士.E-mail： jjchengjj@sina.com

趙忠新.E-mail： zhaozx@medmail.com.cn

R 744.3

A

1008-0392(2016)02-0001-04