葉志強　劉文華　羅斯特　徐大德　趙健榮

摘要[目的]研究野外黑眶蟾蜍（Bufo melanostictus）蝌蚪的生存狀況。[方法]研究分別在堿性水（pH 7.5～8.0）以及酸性水（pH 5.5～6.0）2種模擬環(huán)境條件下，通過急性毒性試驗方法以不同的濃度梯度Mg2+對黑眶蟾蜍蝌蚪進行24和48 h的脅迫試驗。[結(jié)果]在相同濃度梯度和相同觀察時間下，黑眶蟾蜍蝌蚪在堿性水中的存活率低于酸性水；不同pH的水環(huán)境與Mg2+ 的協(xié)同作用顯著影響黑眶蟾蜍蝌蚪的48 h存活率（F7，32=3.373，P<0.05）；黑眶蟾蜍蝌蚪在酸性水環(huán)境下適宜生存的Mg2+濃度范圍為1 418.41～1 590.54 mg/L，半致死濃度（LC50）為2 357.32 mg/L，安全濃度為521.51 mg/L；在堿性水環(huán)境下適宜生存的Mg2+濃度范圍為1 264.91～1 418.41 mg/L，LC50為1 879.81 mg/L，安全濃度為533.99 mg/L。[結(jié)論]該研究可為今后黑眶蟾蜍的保護提供理論依據(jù)。

關鍵詞 黑眶蟾蜍；蝌蚪；存活率；Mg2+；急性毒性試驗

中圖分類號 Q494 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2016）05-060-03

Abstract[Objective]The aim was to study the survival status of Bufo melanostictus tadpoles in the field.[Method]The regular acute toxicity test was carried out that Bufo melanostictus tadpoles were breed in the alkaline water （pH 7.5-8.0） and acidity water （pH 5.5-6.0） with different Mg2+ concentration gradient for 24 and 48 h.[Result]The results showed that the survival rate of Bufo melanostictus tadpoles in the alkaline water was lower than the acidity water in the same condition. Synergistic effects of different pH and Mg2+ concentration had a significant effect on the survival rate of Bufo melanostictus tadpoles in the 48 h toxicity experiment（F7，32=3.373， P<0.05）. In the acidity water environment， 48 h toxicity experiment results showed that the optimal Mg2+ concentration was 1 418.41-1 590.54 mg/L， the median lethal concentration （LC50） was 2 357.32 mg/L and the safe concentration was 521.51 mg/L. By contract， these three indexes in the alkaline water environment were 1 264.91-1 418.41， 1 879.81 and 533.99 mg/L， respectively.[Conclusion]The study can provide theoretical basis for protection of Bufo melanostictus.

Key words Bufo melanostictus； Tadpoles； Survival rate； Mg2+； Acute toxicity test

黑眶蟾蜍（Bufo melanostictus）隸屬兩棲綱（Amphibia）無尾目（Anura）蟾蜍科（Bufonidae）蟾蜍屬（Bufo）[1-2]，主要分布在我國南部地區(qū)，包括廣東、廣西、福建、云南、香港等。黑眶蟾蜍在肇慶市屬于常見種類，其繁殖期一般在3～6月，主要食物來源為昆蟲。由于黑眶蟾蜍能夠大量捕食農(nóng)林業(yè)的害蟲，對促進農(nóng)林業(yè)發(fā)展及維持生態(tài)平衡具有重要作用[3]。生物防治作為現(xiàn)代農(nóng)業(yè)防治的重要一環(huán)，其中的天敵防治直接反映了農(nóng)田中各類生物的生存狀態(tài)（如兩棲類等），其生存效果與生態(tài)環(huán)境的優(yōu)劣存在密切關系[3]。然而，隨著現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的發(fā)展，農(nóng)藥及化肥的廣泛使用卻對農(nóng)田生態(tài)平衡造成一定的負面影響，主要表現(xiàn)為危及農(nóng)田中各類兩棲動物的存活。鎂作為化肥中的重要組成成分，在我國南方地區(qū)使用量較大，高濃度的Mg2+對兩棲類幼體具有毒性及致死效應[4]。為了研究黑眶蟾蜍的野外生存狀況，筆者用MgCl2·6H2O通過急性毒性試驗探討在酸性水與堿性水中Mg2+ 濃度對黑眶蟾蜍蝌蚪存活率的影響，以期為黑眶蟾蜍的保護提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

黑眶蟾蜍蝌蚪來源于廣東省肇慶學院生物園的水池中，捕獲的蝌蚪放進裝有當?shù)厮矗ㄔ厮┑酿B(yǎng)殖水箱中，放入水草和碎石等，以模擬蝌蚪野外生活的環(huán)境，確保在試驗前蝌蚪的活性。

1.2 試驗時間與水源

2014年3～5月，在肇慶學院生物園生理實驗室中進行試驗，氣溫（23.0±3.8）℃，水溫（19.6±6.8）℃，水源是經(jīng)過曝氣的原池水，符合試驗用水要求。

1.3 藥品與儀器

1.3.1 藥品。MgCl2·6H2O，分析純，由廣東省汕頭光華化學廠生產(chǎn)；鹽酸，分析純，由廣州化學試劑廠生產(chǎn)。

1.3.2 儀器。日本生產(chǎn)（MODEL）型·DJ200S電子天平、（精度0.000 1 mg）、500 mL燒杯、Thermo Eutech pH計（pH 700）。

1.4 試驗方法

參照付澤春等[5]的研究方法，測定原池水pH 范圍為7.5～8.0，Na+和Mg2+質(zhì)量濃度分別為1.8和4.5 mg/L，試驗所用Mg2+的基礎濃度為4.5 mg/L。

試驗用水：①保持原池水初始各項指標的狀態(tài)不變，作為試驗所用的堿性水；

②模擬酸雨的pH，逐滴滴加1 mol/L鹽酸至原池水中，將pH調(diào)節(jié)至5.5～6.0，作為試驗所用的酸性水；

③配制Na+、Mg2+質(zhì)量濃度分別為1.8和3 154.6 mg/L的母液。

1.5 試驗設計

取酸性母液和堿性母液各75 mL，分別設置3個平行組，取生長狀況一致、體重相近的黑眶蟾蜍蝌蚪60尾，每個平行組投入蝌蚪10尾，不投放餌料連續(xù)養(yǎng)殖48 h，每12 h換水1次，以保證水體的清潔與pH不變。

Mg2+的梯度濃度設置為4.5、45.0、450.0、800.0、1 600.0和3 000.0 mg/L，每個濃度梯度設置3個平行組，每個平行組投放黑眶蟾蜍蝌蚪10尾，不換水，不投飼，分別在24和48 h后觀察，確定其100%死亡與0%死亡的最低濃度范圍大致為800～2 000 mg/L。根據(jù)這個范圍以等對數(shù)間距法分成7個濃度梯度，稀釋原池水后將每個濃度梯度設置3個平行組，每個平行組投放相同規(guī)格的黑眶蟾蜍蝌蚪10尾，每12 h換水1次，以保證水體的清潔與pH不變，24和48 h后觀察2組水中各Mg2+濃度下黑眶蟾蜍蝌蚪的存活數(shù)。

1.6 測定項目與方法

對于黑眶蟾蜍蝌蚪對Mg2+的適應能力，采用存活率10%、50%與90%為標準來確定；同時，計算不同pH水環(huán)境下24和48 h各濃度梯度下蝌蚪的存活率，采用直線回歸分析計算致死濃度LC10、LC50和LC90，按照以下公式計算安全濃度SC（Safe concentration）[6]：

SC=0.3×48 h LC503/24 h LC502。

1.7 數(shù)據(jù)處理

利用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件和 Systat SigmaPlot12.1軟件對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計和繪圖，數(shù)據(jù)在進一步統(tǒng)計檢驗前，用KolmogorovSmirnov 和Bartlett分別檢驗其正態(tài)性和方差同質(zhì)性，采用雙因素方差分析進行分析。24和48 h各濃度存活尾數(shù)描述性統(tǒng)計值用平均值±標準誤（±SE）表示，顯著性水平設置為α=0.05。

2 結(jié)果與分析

由表1和表2可知，當Mg2+的質(zhì)量濃度范圍為800～1 600 mg/L時，堿性水與酸性水環(huán)境下均出現(xiàn)黑眶蟾蜍蝌蚪個體死亡現(xiàn)象。

由表1可知，在堿性水與酸性水環(huán)境下Mg2+ 對黑眶蟾蜍蝌蚪的毒性均呈現(xiàn)為單向劑量效應，Mg2+質(zhì)量濃度越高，急性毒性越大。在2種不同水環(huán)境下，不同Mg2+濃度對黑眶蟾蜍蝌蚪的24 h和48 h存活尾數(shù)均具有顯著影響（24 h：F7，32=4.078，P<0.05；48 h：F7，32=3.646，P<0.05）。當Mg2+濃度達到1 418.41 mg/L時，堿性水環(huán)境下黑眶蟾蜍蝌蚪24 h和48 h的存活率均明顯低于酸性水環(huán)境。

由表3和表4可知，在相同Mg2+濃度下，酸性水環(huán)境與堿性水環(huán)境中黑眶蟾蜍蝌蚪對Mg2+耐受能力差異明顯，表現(xiàn)為酸性水中黑眶蟾蜍蝌蚪的24 h LC50為2 745.10 mg/L，而堿性水中24 h LC50為1 931.82 mg/L；酸性水環(huán)境中黑眶蟾蜍蝌蚪的48 h LC50為2 357.32 mg/L，堿性水環(huán)境中48 h LC50為1 879.81 mg/L。以48 h LC10與48 h LC90分別為最適生存濃度與最高耐受濃度，酸性水條件下黑眶蟾蜍蝌蚪最適生存濃度為1 364.76 mg/L，最高耐受濃度為3 349.88 mg/L；堿性水條件下，黑眶蟾蜍蝌蚪最適生存濃度為1 263.48 mg/L，最高耐受濃度為2 496.15 mg/L；酸性水條件下黑眶蟾蜍蝌蚪長期適宜生存的安全濃度為521.51 mg/L，堿性水條件下黑眶蟾蜍蝌蚪長期適宜生存的安全濃度為533.99 mg/L。

3 討論

3.1 Mg2+對黑眶蟾蜍蝌蚪的急性毒性作用

Mg2+在動物體內(nèi)除了維持細胞的勢位差、維持細胞結(jié)構穩(wěn)定外，還廣泛參與各類酶代謝反應，是多種酶的活性劑和重要組分，同時作為重要的輔助因子、激活劑、活化劑以及拮抗劑，保護心臟、調(diào)節(jié)神經(jīng)的興奮與抑制，并且通過與Ca2+拮抗作用抑制肌肉過度收縮，起到調(diào)節(jié)酶代謝與神經(jīng)的重要作用[7]。該試驗結(jié)果表明，當Mg2+達到一定濃度時，無論是堿性或是酸性水環(huán)境均對黑眶蟾蜍蝌蚪具有顯著的急性毒性作用。在酸性水環(huán)境下，當Mg2+濃度達到1 590.54 mg/L時，黑眶蟾蜍蝌蚪開始出現(xiàn)個體死亡現(xiàn)象，而在堿性水環(huán)境下黑眶蟾蜍蝌蚪開始出現(xiàn)死亡的Mg2+濃度則為1 418.41 mg/L。死亡個體均表現(xiàn)為身體僵直或尾部不自然的彎曲且沉沒水體[8]，而其余存活個體則表現(xiàn)為焦躁不安和無規(guī)律地游動，身體失去平衡以及反應遲緩等反應。據(jù)此推測，應為過量的Mg2+對黑眶蟾蜍蝌蚪神經(jīng)產(chǎn)生刺激所造成的中毒現(xiàn)象。

與東北長白山的林蛙蝌蚪相比，黑眶蟾蜍蝌蚪對Mg2+具有較高的耐受性[9]。在pH相同的水環(huán)境條件下，東北長白山林蛙蝌蚪對Mg2+的耐受濃度范圍為133.8～501.6 mg/L，黑眶蟾蜍蝌蚪則為1 264.91～1 418.41 mg/L，這可能是與南方土壤Mg2+遷出率較高，導致水中Mg2+濃度較大，從而提高了黑眶蟾蜍蝌蚪對環(huán)境Mg2+的耐受性[10]。

3.2 pH對Mg2+毒性作用的影響

在不添加Mg2+的情況下，通過觀察黑眶蟾蜍蝌蚪堿性水和酸性水環(huán)境中的生存狀況，發(fā)現(xiàn)二者在短期內(nèi)（48 h）無明顯差異。隨著水中的Mg2+濃度的不斷遞增，在達到一定濃度后均出現(xiàn)黑眶蟾蜍蝌蚪個體死亡現(xiàn)象，個體存活率不斷下降。

該試驗中Mg2+濃度在堿性水與酸性水環(huán)境中對黑眶蟾蜍蝌蚪的急性毒性作用存在差異，表明Mg2+與pH值水環(huán)境的協(xié)同作用對黑眶蟾蜍蝌蚪的急性毒性作用差異顯著（F7，32=4.078，P<0.05）。在堿性水中對Mg2+的耐受濃度范圍為1 264.91～1 418.41 mg/L，低于酸性水1 418.41～1 590.54 mg/L。與酸性水環(huán)境相比，堿性水環(huán)境中Mg2+急性毒性作用更大，更不利于黑眶蟾蜍蝌蚪的生存。Mg2+一般作為重要的功能元素參與到植物的光合作用之中，而在水環(huán)境中更是被水生植物以及藻類吸收。在自然條件下，水中的Mg2+濃度通常不會過高[9]。但是，由于南方土壤多為紅壤，其Mg2+的遷移率較高，從而放大了Mg2+在堿性水環(huán)境條件下的毒性作用。兩棲類的幼體對水環(huán)境的敏感性與重金屬對水生大型蚤類的毒性作用存在著較大差異情況十分類似，在自然條件下隨著pH的增大，Cu2+對水生大型蚤類的毒性不斷升高[11]。因此，在堿性環(huán)境下Mg2+對黑斑蛙蝌蚪的急性毒性效應也會隨著pH的增大而升高[12]?？刂谱匀画h(huán)境水體的pH和Mg2+濃度具有極為重要的生態(tài)效應。例如，在廣東粵西地區(qū)的水質(zhì)為硬水，具有較高的堿性，因此為維持野外兩棲類的正常生存條件，需要在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過程中科學合理控制鎂肥的添加量，從而使水中Mg2+濃度控制在合理范圍內(nèi)。

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