李勇國 王艷飛 馬娟

[摘要] 目的 探討云南部分漢族原發(fā)性高血壓（EH）患者與血管緊張素原（AGT）基因M235T突變位點的關(guān)系。方法 選擇2013年1月～2014年1月年在昆明市第一人民醫(yī)院心內(nèi)科住院的行動態(tài)血壓及相關(guān)臨床檢查確診為EH的患者122例為EH組，同期入選44例行動態(tài)血壓排除高血壓的患者為對照組。收集EH組和對照組基本臨床資料，包括年齡、性別比例、血清總膽固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、三酰甘油、平均左室舒張末徑、平均左室收縮末徑、左室射血分數(shù)等指標，所有患者遵守知情同意的原則，采集被檢者靜脈血0.5 ml，通過聚合酶鏈反應技術(shù)及基因芯片技術(shù)檢測AGT基因M235T，同時對樣本進行序列測定，比較各組間基因型分布和等位基因的頻率分布。 結(jié)果 EH組AGT M235T基因型分布與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P=0.122），EH組AGT-TT、AGT-MT和AGT-MM基因型頻率分別為43.4%、54.9%、1.6%，對照組分別為31.8%、61.4%、6.8%；T等位基因頻率EH組（70.9%）與對照組（62.5%）比較，差異無統(tǒng)計學意義（P=0.145）。 結(jié)論 AGT基因M235T基因變異與云南漢族人群EH的發(fā)病可能無相關(guān)性，AGT基因多態(tài)性可能不是EH的危險因素。

[關(guān)鍵詞] 原發(fā)性高血壓；血管緊張素原；基因

[中圖分類號] R544.1 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2016）03（a）-0041-04

[Abstract] Objective To explore the relationship between essential hypertention（EH） in part of the han nationality in Yunnan and gene M235T mutations of angiotensinogen（AGT）. Methods 122 patients，conducted ambulatory blood pressure and related clinical examination and diagnosed as EH in the First People′s Hospital of Kunming Heart Medicine from January 2013 to January 2014 were selected as EH group.44 patients，conducted ambulatory blood pressure and excluded hypertension at the same term，were selected as control group.Basic clinical data included age，sex ratio，serum total cholesterol，high-density lipoprotein，low-density lipoprotein，triglyceride，average left ventricular end-diastolic diameter and average diameter at the end of the left ventricular contraction left ventricular ejection fraction were collected.All patients were abided by principles of informed consent.0.5 ml venous blood of patients were collected and the gene M235T of AGT were tested by using PCR and gene chip technology.The sample were conducted sequence determination to compare the genotype and allele frequency distribution in different groups. Results The difference of AGT M235T genotype distribution between EH group and control group had no statistical significance （P=0.122）.The genotype frequency of AGT-TT，AGT-MT and AGT-MM in EH group was respectively 43.4%，54.9% and 1.6%，which was respectively 31.8%，61.4% and 6.8% in control group.The T allele frequency had no obvious difference between EH group（70.9%） and control group（62.5%）（P=0.145）. Conclusion It has no relationship between gene M235T mutations of angiotensinogen and essential hypertention in Han nationality of Yunnan crowd.The gene polymorphism of AGT may not be risk factors of essential hypertention.

[Key words] Essential hypertention；Angiotensinogen；Gene

原發(fā)性高血壓（essential hypertension，EH）是目前發(fā)病率最高的一種心血管疾病。現(xiàn)對EH的發(fā)病機制仍未研究透徹。但大量研究證實，EH屬“復雜疾病”，遺傳因素、心理社會因素、體表指數(shù)、年齡、膳食等對其發(fā)病均有影響，其中20%～40%的血壓變化與遺傳因素有關(guān)，因此篩選高血壓候選基因已成為高血壓研究的重點之一[1]。眾多的EH候選基因及候選位點當中，易感基因最有可能為編碼腎素-血管緊張素的基因，其中血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）的前體物質(zhì)是血管緊張素原（angiotensinogen，AGT），AGT的濃度變化限制了RAS中AngⅡ的轉(zhuǎn)化速度。目前有關(guān)AGT基因多態(tài)性與EH之間的關(guān)系得出的結(jié)論各有不同。一方面考慮為研究人群種族遺傳及地理環(huán)境的差異，其次還與檢測方法及檢測技術(shù)各不同存在很大關(guān)系。盡管通過研究不同人群、種族、利用不同的研究技術(shù)方法對AGT基因M235T多態(tài)性與EH的關(guān)系進行研究，同時研究的相關(guān)報道也較多，但對云南部分漢族高血壓人群的相關(guān)研究較少。本研究旨在探討血管緊張素原基因M235T突變位點與云南漢族人群EH的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2013年1月～2014年1月在昆明市第一人民醫(yī)院心內(nèi)科的住院患者，受試者均為該地區(qū)的漢族人群。受試者均對調(diào)查和檢測項目知情同意。行動態(tài)血壓檢查診斷為EH患者122例，男79例，女43例，平均年齡（61.88±12.68）歲。選擇同期行動態(tài)血壓檢查證實未患有高血壓的患者44例為對照組，男27例，女17例，平均年齡（63.59±9.87）歲。兩組性別、年齡比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。所有病例均符合WHO的高血壓診斷標準。EH診斷標準依據(jù)《1999WHO/ISH高血壓處理指南》的建議：在未服用抗高血壓藥的情況下，收縮壓≥140 mmHg和（或）舒張壓≥90 mmHg，排除繼發(fā)性高血壓。同時經(jīng)病史、體檢、實驗室檢查和心臟超聲、心電圖、血壓等檢查排除冠心病、高血壓、心肌病、瓣膜性心臟病和先天性心臟病者。

1.2 研究方法

1.2.1 各生化、心臟超聲指標的測定 所有患者清晨空腹抽取無抗凝劑靜脈血2 ml送檢。血標本嚴格按操作要求處理，均在2 h內(nèi)完成檢測。采用美國Beckman Coulter DxC80 全自動分析儀測定血清總膽固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、三酰甘油等指標。應用美國GE公司生產(chǎn)的彩色多普勒超聲儀Vivid 7，探頭頻率2～4 MHz，通過Simpon方法測量出平均左室舒張末徑、平均左室收縮末徑、左室射血分數(shù)等指標。

1.2.2 標本的采集 遵守知情同意的原則，采集被檢者靜脈血0.5 ml，用一次性無菌注射針頭抽取，放入含50 μl的2%乙二胺四乙酸（EDTA）溶液，置于1.5 ml的無菌離心管中，蓋上蓋子，上下顛倒混勻，通過低滲法裂解紅細胞，分離白細胞，飽和酚/氯仿法抽提基因組DNA。利用TE緩沖液溶解，標本在4℃保存。保存≤3周。

1.2.3 PCR 擴增 采用適用0.2 ml擴增管并有熱蓋的PCR擴增儀擴增。

1.2.4 雜交顯色 將反應試管條通過BaiO FLWS-526全自動雜交儀進行雜交。結(jié)束后將取出的芯片放入BaiO BE-2.0生物芯片識讀儀，圖像Array Doctor軟件分析可自動輸出檢測結(jié)果，最后檢測出AGT M235T基因的多態(tài)性位點。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析，計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，采用t檢驗，計數(shù)資料用百分率（%）表示，采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1兩組一般臨床資料的比較

EH組的年齡、性別比例、血清總膽固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、三酰甘油、平均左室舒張末徑、平均左室收縮末徑、左室射血分數(shù)等指標與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）（表1）。

2.2 兩組AGT基因M235T多態(tài)性檢測

EH組及對照組的基因型頻率適合度檢測顯示皆達到Hardy-Weinberg平衡?；蛐驮贓H組及對照組均以MT型最多見，TT型次之；EH組AGT-TT基因型頻率高于對照組，但兩組間AGT M235T基因型分布差異無統(tǒng)計學意義（χ2=4.1998，P=0.122）。EH組T等位基因型頻率高于對照組，兩組M等位基因頻率分別為29.1%（EH組）、37.5%（對照組），T等位基因頻率分別為70.9%（EH組）、62.5%（對照組），兩組比較差異無統(tǒng)計學意義（χ2=2.122，P=0.145）（表2）。

3 討論

高血壓是人類常見的一種心血管疾病，可分為原發(fā)性和繼發(fā)性兩大類。多數(shù)患者高血壓的病因機制不明，稱為EH，所占比例達95%以上。目前認為腎素-血管緊張素系統(tǒng)（RAS）在高血壓的發(fā)生、發(fā)展中起到重要作用[2]。當編碼AGT的外顯子2區(qū)域核苷酸704處胸腺嘧啶（T）被胞嘧啶（C）替代，導致基因編碼產(chǎn)物第235號氨基酸由蛋氨酸（M）變異為蘇氨酸（T），即M235T分子變異，會出現(xiàn)3種基因型，MM、MT和TT。AGT作為RAS的關(guān)鍵分子，其第2外顯子M235T位點的多態(tài)性與EH相關(guān)性的報道近來較多，但結(jié)論不一致[3-5]。AGT基因M235T基因變異致高血壓的機制尚未完全確切。Jeunemaitre等[6]對AGT基因M235T基因變異與高血壓的相關(guān)研究證實，攜帶T235等位基因者血漿AGT濃度超出不攜帶T235等位基因者的10%～20%，而血漿AGT是AngⅡ合成的前提物質(zhì)，血漿AGT濃度升高導致的結(jié)果是AngⅠ、AngⅡ生成增加，最終強烈的收縮血管反應導致血壓升高[7]。本實驗關(guān)于AGT基因M235T突變位點與云南EH關(guān)系的研究結(jié)果顯示，部分漢族EH人群和正常人群的AGT M235T基因型分布差異無統(tǒng)計學意義；兩組T等位基因頻率分別為70.9%（EH組）、62.5%（對照組），差異無統(tǒng)計學意義，提示AGT基因M235T基因變異與云南漢族人群EH的發(fā)病可能無相關(guān)性。

1992年Jeunemaitre等[6]在高血壓同胞配對研究中首次發(fā)現(xiàn)AGT基因M235T變異與高血壓的相關(guān)性，高血壓患者235T等位基因的頻率明顯高于對照組。龍莉等[8]研究了關(guān)于AGT基因M235T多態(tài)性在云南彝族人群中的分布，得出AGT基因M235T多態(tài)性分布存在民族、種族差異。王瑞麗等[9]研究促血管收縮相關(guān)基因多態(tài)性與哈薩克族EH相關(guān)性，得出哈薩克族人EH主要與AGT基因M235T多態(tài)性、AGT基因核心啟動子（AGCEI）G-6A變異、醛固酮合成酶基因多態(tài)性有關(guān)。也有學者認為，M235T不會引起AGT蛋白在結(jié)構(gòu)和功能方面發(fā)生變化，提示M235T只是作為一個標記點，不是功能性的，AGT基因之中或其鄰近部位一個未知功能位點上的基因發(fā)生了變異及這個未知功能位點和M235T之間產(chǎn)生不平衡均可能是導致高血壓發(fā)病的機制[9]。因此，在研究不同人種AGT基因突變與EH的關(guān)系得出的結(jié)論也各不相同[10]。一方面原因考慮為研究人群種族遺傳及地理環(huán)境的差異，本文漢族人相關(guān)等位基因還存在異質(zhì)性，可能與EH受多個影響因素有關(guān)，僅從人群自身研究不全面，還需結(jié)合生活習慣等因素進行研究[11-12]，其次還與檢測方法及檢測技術(shù)各不同存在很大關(guān)系，目前檢測AGT基因M235T多態(tài)性的方法有聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態(tài)性分析法（PCR-RFLP）、等位基因特異性寡核苷酸雜交法（PCR-ASO）、突變基因分離聚合酶鏈多態(tài)性反應法（MS-PCR）、改良PCR-RFLP法（以SfaN-Ⅰ消化）、PCR聯(lián)合變性梯度膠電泳法（DGGE）。其中傳統(tǒng)的PCR-RFLP應用最為廣泛。也有關(guān)于監(jiān)測方法不同對結(jié)果的影響研究，提示應用多年的PCR-RFLP仍不失為一種確切可行的檢測AGT基因M235T多態(tài)性的方法，而新型MS-PCR的應用還需行進一步的研究，所以不同監(jiān)測手段仍是影響因素[13-14]。繼續(xù)對AGT基因M235T多態(tài)性的進一步分析，有利于心血管疾病的診治及預防。

綜上所述，EH是由遺傳及環(huán)境共同作用的結(jié)果，而AGT基因是高血壓遺傳易感性的主要候選基因之一[15]。不同地區(qū)、不同種族可能造成其對某些疾病的易感性存在明顯差異，同時其他一些因素的影響也可能導致易感性存在差異。因此進行相關(guān)研究可以對高血壓高危人群的預測及臨床指導有重要的理論意義。本研究對AGT基因M235T突變位點與云南漢族EH的關(guān)系進行初步探討，為進一步基因多態(tài)位點研究積累了資料。

[參考文獻]

[1] Gu D，Reynolds K，Wu X，et al.Prevalence，awareness，treatment，and control of hypertension in China[J].Hypertension，2002，40（8）：920-927.

[2] Dickson ME，Sigmund CD.Genetic basis of hypertension：revisiting angiotensinogen[J].Hypertension，2006，48（1）：14-20.

[3] Hingorani AD，Sharma P，Jia H，et al.Blood pressure and the M235T polymorphism of the angiotensinogen gene[J].Hypertension，1996，28（5）：907-911.

[4] Fernández-Llama P，Poch E，Oriola J，et al.Angiotensinogen gene M235T and T174M polymorphisms in essential hypertension：relation with target organ damage[J].Am J Hypertens，1998，11（4 Pt 1）：439-444.

[5] Ragg H，Preibisch G.Structure and expression of the gene coding for the human serpin hLS2.[J].J Biol Chem，1988， 263（24）：12129-12134.

[6] Jeunemaitre X，Soubrier F，Kotelevtsev YV，et al.Molecular basis of human hypertension：role of angiotensinogen[J].Cell，1992，71（1）：169-180.

[7] 張春雨，趙世剛，牛廣明，等.蒙古族人群原發(fā)性高血壓與AGT M235T及CYP11B2 C-344T基因多態(tài)性的相關(guān)性研究[J].中國醫(yī)師雜志，2007，9（1）：31-33.

[8] 龍莉，楊榆玲，瞿秋，等.血管緊張素原基因M235T多態(tài)性在云南彝族人群中的分布[J].昆明醫(yī)科大學學報，2012，33（11）：4-7.

[9] 王瑞麗，王冬曉，古麗麗，等.促血管收縮相關(guān)基因多態(tài)性與哈薩克族原發(fā)性高血壓相關(guān)性研究[J].中國民族民間醫(yī)藥，2012，12（8）：25-26.

[10] 楊月明，何姬苓.血管緊張素原基因多態(tài)性與我國高血壓和腦卒中的關(guān)系[J].中國全科醫(yī)學，2008，11（2）：262.

[11] Li X，Du Y，Huang X.Correlation of angiotensin-converting enzyme gene polymorphism with effect of antihypertensive therapy by angiotensin converting enzyme inhibitor[J].Cardiovasc Pharmacol Ther，2003，8（1）：25-30.

[12] 朱旭明，謝國強，張健，等.血管緊張素原基因M235T多態(tài)性與原發(fā)性高血壓相關(guān)性的Meta分析[J].重慶醫(yī)學，2013，42（11）：3759-3760.

[13] Kawada N，Moriyama T，Imai E，et al.Angiotensinogen gene polymorphism of threonine/methionine at position 235-potential problems of the modified restriction endonuclease（Tth111-Ⅰ） digestion method[J].J Nephrol，1997， 10（6）：314-317.

[14] Rust S，F(xiàn)unke H，Assmann G.Mutagenically separated PCR（MS-PCR）：a highly specific one step procedure for easy mutation detection[J].Nucl Acids Res，1993，21（16）：3623-3629.

[15] Fornage M，Turner ST，Sing CF，et al.Variation at the M235T locus of the angiotensinogen gene and essential hypertension：a population-based case-control study from Rochester，Minnesota[J].Hum Genet，1995，96（3）：295-300.

（收稿日期：2015-11-20 本文編輯：王紅雙）