宋雨來(lái) 謝良穩(wěn) 李志民 張曉丹

摘要：在乙酸鈣、磷酸二氫鈣為主成分的弱酸性電解液中，以乙二胺四乙酸（EDTA）和檸檬酸作為絡(luò)合劑，采用微弧氧化的方法，在鈦合金表面成功地直接制備出含有羥基磷灰石（HA）的陶瓷層.隨著電解液Ca/P的增加，膜層中HA含量升高，膜層表面孔洞分布更均勻，表面變粗糙.動(dòng)物種植試驗(yàn)表明，陶瓷層覆蓋植入體產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)較弱，新的肌肉組織能夠在膜層表面生長(zhǎng).

關(guān)鍵詞：微弧氧化；鈦合金；羥基磷灰石；組織相容性

中圖分類號(hào)：TG156 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

鈦合金因其具有良好的機(jī)械性能和一定的生物相容性和耐蝕性，受到了廣大硬組織植入材料研究者的青睞[1-3].但是，鈦合金硬組織植入體長(zhǎng)期存在于生物體內(nèi)，其表面產(chǎn)生游離的金屬離子進(jìn)入生物組織內(nèi)會(huì)造成細(xì)胞死亡[4].一些特殊成分的陶瓷材料具有良好的生物相容性，彌補(bǔ)了鈦合金的不足之處，但陶瓷材料的強(qiáng)度和韌性不足，不能完全滿足硬組織植入材料的力學(xué)性能要求[5-6].因此，陶瓷材料只能在一些特定部位，有條件地替代一些金屬質(zhì)植入性產(chǎn)品.目前醫(yī)學(xué)領(lǐng)域70%的植入性器件不得不由金屬制成[7].

微弧氧化技術(shù)能在鈦合金表面原位生長(zhǎng)出含有羥基磷灰石（HA）陶瓷膜，這種成分與天然骨組織的無(wú)機(jī)物成分相同.因此，這種方法制備的鈦合金植入材料結(jié)合了金屬和陶瓷膜的各自優(yōu)點(diǎn)，即植入材料表面具有良好的生物活性和生物相容性，同時(shí)，基體又具有良好的機(jī)械性能[8].基于良好的應(yīng)用前景，使用微弧氧化技術(shù)在鈦合金表面生成含有HA生物陶瓷膜的研究倍受關(guān)注.

大量研究表明，目前鈦合金表面微弧氧化HA膜研制主要采用二步方法，即通過(guò)微弧氧化技術(shù)結(jié)合后處理技術(shù)在氧化膜層外表面生成含HA的生物陶瓷膜.在二步法制備含羥基磷灰石膜層的基本原理、工藝過(guò)程，以及膜層的組織結(jié)構(gòu)控制和性能等方面取得了豐富的研究成果[9-12].近年來(lái)，采用微弧氧化技術(shù)在鈦合金表面直接生成含有HA涂層的技術(shù)逐漸成為研究熱點(diǎn). Bai等將微弧氧化技術(shù)與電沉積技術(shù)有效結(jié)合在一起，通過(guò)在電解液中加入納米羥基磷灰石顆粒，在鈦合金表面直接制備出含有銳鈦礦和羥基磷灰石的陶瓷層，膜層的HA含量與電壓密切相關(guān)[13].Chen等在乙酸鈣和磷酸二氫鈉電解液中，用一步法在純鈦表面制備出含有銳鈦礦、金紅石和羥基磷灰石的陶瓷層，其方法相對(duì)于傳統(tǒng)的二步法更為簡(jiǎn)單快速[14].Kim等在CaCl2和KH2PO4電解液中，采用一步法在鈦合金表面成功制備了含有HA的陶瓷層，并認(rèn)為電解液中CaCl2的濃度是影響膜層厚度重要因素[15].可見(jiàn)，一步法制備技術(shù)具有制備周期短、成本低、工序少的優(yōu)點(diǎn)，但研究仍處于起步階段，在膜層形成機(jī)制、電解液配方優(yōu)化、電參數(shù)優(yōu)化、成分和組織控制等方面仍需開展系統(tǒng)、深入的研究.

本文通過(guò)研究不同成分電解液對(duì)微弧氧化膜層組織和結(jié)構(gòu)的影響，開發(fā)了高效環(huán)保的電解液配方，在弱酸性條件下，可在鈦合金表面直接生成含有HA的生物陶瓷膜.并通過(guò)生物學(xué)方法，評(píng)價(jià)了膜層的組織相容性.研究結(jié)果將豐富鈦合金表面微弧氧化理論，并為鈦合金植入性材料的研發(fā)和應(yīng)用提供可靠的實(shí)驗(yàn)支持.

1實(shí)驗(yàn)方法

1.1電解液配制

本研究以乙酸鈣和磷酸二氫鈣作為主成分，檸檬酸和乙二胺四乙酸（EDTA）做絡(luò)合劑，用蒸餾水配置成電解液，氫氧化鉀調(diào)解pH值.首先將乙酸鈣和EDTA按比例混合溶解在蒸餾水中，再將磷酸二氫鈣和檸檬酸按一定比例混合溶解在蒸餾水中，待兩者都完全溶解后混合，在混合的溶液中通過(guò)添加氫氧化鉀調(diào)節(jié)電解液的pH值至5.混合過(guò)程中用磁力攪拌器對(duì)溶液進(jìn)行攪拌促進(jìn)試劑溶解和防止沉淀.Ca/P是電解液配方中重要參數(shù)，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，通過(guò)設(shè)定不同的Ca/P，調(diào)整乙酸鈣，EDTA加入量對(duì)電解液成分進(jìn)行優(yōu)化，具體電解液組成見(jiàn)表1.

1.2氧化膜制備

鈦合金作為陽(yáng)極浸入電解液中，不銹鋼桶作為陰極.電參數(shù)為：電流密度10 A/dm2；頻率150 Hz；占空比12%；氧化時(shí)間20 min.本實(shí)驗(yàn)采用恒流方式進(jìn)行氧化處理，通過(guò)電壓調(diào)節(jié)來(lái)控制電流密度恒定.制備過(guò)程中，開通機(jī)械攪拌器保持電解液成分均勻.試樣取出后，超聲波清洗5 min，電吹風(fēng)吹干，自封袋中保存，待檢測(cè)分析.

1.3微觀組織及相組成

采用EVO18型掃描電子顯微鏡觀察膜層表面微觀形貌.采用D/Max 2500PC型X射線衍射儀分析相組成，輻射源為CuKα，電壓/電流為40 kV/30 mA，掃描范圍為10°～90°，掃描速度為0.5 °/min.

1.4動(dòng)物種植試驗(yàn)

選取3只大白兔，每只白兔左右腿肌肉處分別手術(shù)植入一枚未處理鈦合金植入體和微弧氧化處理植入體.術(shù)后3 d內(nèi)給動(dòng)物注射適量青霉素消炎針劑，一周之內(nèi)隔天護(hù)理患處.8周后切開每個(gè)圍繞植入體周圍1 cm左右的肌肉組織，連同植入體及周圍肌肉組織取下，取下的標(biāo)本在福爾馬林溶液中固定10 d，固定好的標(biāo)本進(jìn)行植入體與肌肉組織分離，將軟組織進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋，石蠟切片，制成切片標(biāo)本，染色后進(jìn)行光學(xué)顯微觀察.

2結(jié)果與分析

2.1相組成

圖1為不同Ca/P的電解液中形成的膜層表面XRD衍射圖譜.從圖中可以看出，當(dāng)Ca/P為1.5/1時(shí)，膜層的主要相組成為金紅石和銳鈦礦，磷酸鈣和羥基磷灰石的衍射峰不明顯.有研究表明在等離子體的高溫高壓作用下，來(lái)自于基體的Ti和電解液中的O極易生成TiO2，并且當(dāng)反應(yīng)溫度升高時(shí)，更易于金紅石的形成[16].隨著Ca/P的增加，銳鈦礦的衍射峰降低，羥基磷灰石和磷酸鈣相的衍射峰逐漸增強(qiáng)，說(shuō)明適度增加電解液中的Ca/P有利于在氧化膜中生成羥基磷灰石.

本文采用EDTA與乙酸鈣，檸檬酸與磷酸二氫鈣分別絡(luò)合，使磷酸二氫鈣同時(shí)成為鈣離子和磷酸根離子的供體，相同濃度條件下，比常用的鈉鹽具有更高的Ca/P，提高了電解液的利用率.通常在堿性條件下，OH-的活度較高，溶液能夠提供充足的羥基促進(jìn)HA形成.本文采用的電解液呈弱酸性，溶液不能直接提供大量的OH-，但是，具有較高活度的H+通過(guò)促進(jìn)CaTiO3的分解提供羥基加快HA生成[15].進(jìn)一步提高Ca/P，如Ca/P為4∶1和5∶1時(shí)，經(jīng)肉眼觀察鈦合金表面均不能形成完整的氧化膜，因此未對(duì)其相組成進(jìn)行檢測(cè).可見(jiàn)，電解液的Ca/P選取3∶1時(shí)更利于生成完整的HA膜.

2.2微觀組織

圖2為不同電解液Ca/P條件下制備的微弧氧化膜層表面微觀形貌.從圖2（a）中可以看出，當(dāng)Ca/P為1.5∶1時(shí)膜層存在很多形狀不規(guī)則的孔洞，數(shù)量較多，大小不一，孔洞之間的陶瓷層表面平整光滑，無(wú)裂紋產(chǎn)生.

圖2（b）和（c）分別為Ca/P為2∶1和3∶1時(shí)膜層表面形貌.隨著電解液Ca/P的增加，膜層表面粗糙度變大，表面出現(xiàn)大量的細(xì)小顆粒，分布相對(duì)均勻，經(jīng)EDS分析結(jié)合XRD結(jié)果判斷為HA顆粒.此外，膜層表面孔洞數(shù)量減少，尺寸降低，未發(fā)現(xiàn)裂紋.膜層表面的形貌變化可能是因?yàn)殡S著Ca/P增加，表面電弧數(shù)量減少，膜層中大量HA開始生成，最終導(dǎo)致粗糙度增加，孔洞數(shù)量降低[11-12，15].有研究表明，對(duì)羥基磷灰石植入材料而言，較大的粗糙度和適當(dāng)?shù)目锥从欣谔岣吣拥慕M織相容性[17].

2.3生物相容性

馬宋三色染色，即Masson三色法是傳統(tǒng)經(jīng)典的膠原纖維染色法[18].本研究的染色結(jié)果：細(xì)胞核呈鮮明的藍(lán)黑色，膠原纖維呈綠色，紅細(xì)胞和肌細(xì)胞呈紅色.圖3（a）為未處理鈦合金植入體周圍肌肉組織經(jīng)Masson染色后在光鏡下的顯微組織形貌.從圖中可以看到，植入體周圍出現(xiàn)了大量呈綠色的膠原纖維，即出現(xiàn)大面積的纖維增生和炎癥細(xì)胞，阻礙了肌肉細(xì)胞在植入體表面結(jié)合和生長(zhǎng)[19]，說(shuō)明未經(jīng)微弧氧化表面處理的鈦合金作為植入體的組織相容性差.圖3（b）為微弧氧化處理鈦合金植入體周圍肌肉組織經(jīng)Masson染色后光鏡顯微組織形貌.圖中紅色占據(jù)大面積，肌肉與植入體表面接觸處表現(xiàn)為多層紅綠相間的形貌，且每一層綠色厚度均較小，說(shuō)明植入體周圍的肌肉組織中炎癥細(xì)胞少，產(chǎn)生的膠原纖維少，即纖維增生少.肌肉組織中少量的纖維增生可以形成肉芽組織參與炎癥的愈合過(guò)程[20]，并且隨著時(shí)間的推移，這種與肌細(xì)胞相間的少量纖維增生會(huì)慢慢分散，肌肉組織與植入體表面會(huì)更好地

結(jié)合.此外，植入體表面肌肉組織生長(zhǎng)出新生肌肉細(xì)胞，這種肌肉細(xì)胞面向植入體表面的一側(cè)生長(zhǎng)，說(shuō)明肌肉纖維在向植入體表面推進(jìn)生長(zhǎng).顯然，與鈦合金裸露表面相比，微弧氧化表面處理膜層組織相容性好.

3結(jié)論

1） 以乙酸鈣和磷酸二氫鈣作為主成分，以EDTA和檸檬酸作為絡(luò)合劑，在弱酸性條件下，采用微弧氧化方法，能夠在鈦合金表面直接生成HA陶瓷膜.

2） 隨著Ca/P的增加，膜層表面變得粗糙，HA含量逐漸增加，孔洞尺寸減小，分布均勻.當(dāng)Ca/P為1/3時(shí)膜層組織和成分較為理想，進(jìn)一步增加Ca/P膜層會(huì)出現(xiàn)大面積的燒損嚴(yán)重破壞了完整性.

3） 動(dòng)物種植試驗(yàn)初步證明，HA膜覆蓋鈦合金植入體相比鈦合金植入體更有利于減少炎癥反應(yīng)，促進(jìn)周圍肌肉組織的生長(zhǎng)，具有更好的組織相容性.

參考文獻(xiàn)

[1]KOBAYASHI E， MATSUMOTO S， YONEYAMA T， et al.Mechanical properties of the binary titaniumzirconium alloysand their potential for biomedical materials[J].Journal of Biomedical Materials Research， 1995， 29：943 - 950.

[2]BOTHE R T， BEATON L E， DAVENPORT H A. Reaction of bone to multiple metallicimplants[J].Surgery， 1940， 7： 598-602.

[3]BRETTLE J.A survey of the literature on metallic surgical implants[J]. Injury， 1970， 2： 26-39.

[4]KIMA S H， JEONG Y H，CHOE H C. Morphology change of HA films on highly ordered nanotubular TiNbHfalloys as a function of electrochemical deposition cycle[J]. Surface & Coatings Technology，2014，259：281-289.

[5]SUCHANK W， YOSHIMURA M.Processing and properties of hydroxyapatitebased biomaterials for use as hard tissue replacementimplants[J]. Journal of Materials Research， 1998，13： 94-117.

[6]YUE X Y， YU L， ZHANG C P.Toughening mechanisms in ironcontaining hydroxyapatite/titanium composites[J]. Biomaterials，2010，31：1493-1501.

[7]TAKAO Hanawa. Biofunctionalization of titanium for dental implant[J]. Japanese Dental Science Review， 2010， 46： 93-101.

[8]HUNG K Y， CHENG S， SHI C S. Titanium surface modified by hydroxyapatite coating for dental implanting[J]. Surface & Coatings Technology，2013，231：337-345.