王蔚曦，黃曉琴乾元浩生物股份有限公司南京生物藥廠

微載體懸浮培養(yǎng)技術(shù)在疫苗生產(chǎn)中的應(yīng)用

王蔚曦，黃曉琴
乾元浩生物股份有限公司南京生物藥廠

微載體懸浮培養(yǎng)技術(shù)是一種新的細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，并已被國外疫苗生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)用大規(guī)模生產(chǎn)中，但這項技術(shù)在國內(nèi)并不普及。本文以介紹國內(nèi)當(dāng)前疫苗生產(chǎn)技術(shù)切入，闡述了微載體懸浮培養(yǎng)技術(shù)的獨(dú)特優(yōu)勢和過程優(yōu)化，并分別介紹了微載體懸浮培養(yǎng)技術(shù)在實驗室和大規(guī)模培養(yǎng)中的研究進(jìn)展，最后展望了此技術(shù)在未來的發(fā)展方向。

微載體懸浮培養(yǎng)技術(shù)；疫苗生產(chǎn)；過程優(yōu)化；研究進(jìn)展

隨著科技的發(fā)展，疫苗生產(chǎn)技術(shù)日新月異。而細(xì)胞苗以其成本低，產(chǎn)量高，安全性好而倍受各家廠商青睞。作為細(xì)胞苗生產(chǎn)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)也正迎來巨大的革新。

1　現(xiàn)階段動物疫苗生產(chǎn)中的細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)

1.1貼壁培養(yǎng)

貼壁培養(yǎng)是指使細(xì)胞靜置貼在容器表面，并不斷生長繁殖而形成單層的培養(yǎng)方法。

此方法的優(yōu)點(diǎn)有：容易完全換液，細(xì)胞清洗方便，無需離心；可在顯微鏡下直接觀察到細(xì)胞的形態(tài)和生長狀態(tài)，如病毒感染后出現(xiàn)的細(xì)胞病理性改變，細(xì)胞誘導(dǎo)分化或致癌因素引起的細(xì)胞形態(tài)變化；可以采用灌注技術(shù)來替代細(xì)胞過濾系統(tǒng)，達(dá)到高密度培養(yǎng)細(xì)胞的目的；細(xì)胞可以更有效的表達(dá)同一產(chǎn)品；便于進(jìn)行實驗；細(xì)胞容易適應(yīng)環(huán)境，適用細(xì)胞種類廣[1]。

此方法的缺點(diǎn)有：傳代和擴(kuò)大培養(yǎng)困難，生產(chǎn)規(guī)模受限；操作麻煩，細(xì)胞取樣和計數(shù)困難；傳質(zhì)和傳氧差，測定和控制細(xì)胞同質(zhì)性困難；傳代換液容易污染；占用空間大。

轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)是疫苗生產(chǎn)中較早期使用的貼壁培養(yǎng)技術(shù)。而后衍生出的多層平板培養(yǎng)系統(tǒng)以增加比表面積的方式實現(xiàn)細(xì)胞高密度培養(yǎng)，可控性好，產(chǎn)品質(zhì)量均一。然而此方法培養(yǎng)的部分細(xì)胞不能被充分消化，長期培養(yǎng)會使死角處細(xì)胞堆積[2]。目前較熱門的貼壁培養(yǎng)技術(shù)是生物反應(yīng)器系統(tǒng)，其中較為常見的是固定床式生物反應(yīng)器。此種方法培養(yǎng)的細(xì)胞規(guī)模大，密度高。

1.2懸浮培養(yǎng)

懸浮培養(yǎng)是細(xì)胞在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)生長繁殖的培養(yǎng)方法。

此方法的優(yōu)點(diǎn)有：細(xì)胞無需適應(yīng)，即可大量生長繁殖；細(xì)胞與培養(yǎng)液和氣體可以充分接觸，細(xì)胞收率高；可連續(xù)測定細(xì)胞濃度，便于定量研究；傳質(zhì)和傳氧好，易于控制培養(yǎng)條件；傳代無需消化分散，使細(xì)胞免受傷害；可在連續(xù)封閉系統(tǒng)中進(jìn)行，減少受污染的機(jī)會；易于大規(guī)模生產(chǎn)。

此方法的缺點(diǎn)有：難以采用灌流培養(yǎng)，細(xì)胞密度低；適用細(xì)胞種類少（僅能適用于非貼壁細(xì)胞和兼性貼壁細(xì)胞）[3]。

懸浮培養(yǎng)方法有靜置懸浮培養(yǎng)法、翻滾培養(yǎng)法、旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)法、旋搖培養(yǎng)法、電磁懸攪培養(yǎng)法、震蕩培養(yǎng)法和滋養(yǎng)器裝置培養(yǎng)，常用反應(yīng)器為攪拌式生物反應(yīng)器和氣升式生物反應(yīng)器。懸浮培養(yǎng)技術(shù)多用于重組蛋白和單克隆抗體生產(chǎn)。

1.3固定化培養(yǎng)

固定化培養(yǎng)是將細(xì)胞限制或固定在特定空間位置的培養(yǎng)技術(shù)。

此方法的優(yōu)點(diǎn)有：適用細(xì)胞廣；培養(yǎng)的細(xì)胞密度高；細(xì)胞損傷低；易更換培養(yǎng)液；易分離純化。

此方法的缺點(diǎn)有：生產(chǎn)成本高；無確定的優(yōu)化培養(yǎng)系統(tǒng)。

固定化培養(yǎng)方法主要有吸附法、包埋法、微載體細(xì)胞培養(yǎng)法、多空載體培養(yǎng)法、微囊化培養(yǎng)法和中空纖維培養(yǎng)法等。其中微載體細(xì)胞培養(yǎng)法、微囊化培養(yǎng)法和中空纖維培養(yǎng)法是目前比較成熟且有應(yīng)用價值的大規(guī)模培養(yǎng)方法。

2　微載體懸浮培養(yǎng)技術(shù)介紹

微載體細(xì)胞培養(yǎng)法是將細(xì)胞吸附于微載體表面，在培養(yǎng)液中進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，是細(xì)胞在微載體表面長成單層的培養(yǎng)方法。

2.1微載體懸浮培養(yǎng)的優(yōu)勢

它結(jié)合了貼壁培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)的傳統(tǒng)優(yōu)勢：使細(xì)胞貼附在微小顆粒載體上，創(chuàng)造了較大的面積供細(xì)胞貼附、生長、增殖，且載體小，比重輕，在輕度攪拌下即可使細(xì)胞懸浮于培養(yǎng)液中，增加細(xì)胞與培養(yǎng)液的比表面積；細(xì)胞所處環(huán)境均一且容易測量與監(jiān)控；培養(yǎng)操作可系統(tǒng)化、自動化，降低了污染發(fā)生的機(jī)會；占用空間??；培養(yǎng)液利用率高；重復(fù)性好，放大容易。

2.2微載體懸浮培養(yǎng)的步驟及過程優(yōu)化

微載體懸浮培養(yǎng)與一般的細(xì)胞培養(yǎng)一樣需要經(jīng)過接種、觀察培養(yǎng)、計數(shù)、消化、分離和傳代等幾個步驟。然而，可以從以下幾個方面對其進(jìn)行優(yōu)化，從而使通過微載體懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞更有活力，密度更高。

2.2.1微載體的選擇

現(xiàn)階段的微載體主要分為固體微載體和液體微載體[4]。固體微載體包括實心球體微載體和大孔微載體。液體微載體是在攪拌過程中形成微珠，并使細(xì)胞貼壁生長，達(dá)到培養(yǎng)目的時停止攪拌，通過離心分相使細(xì)胞懸浮于有機(jī)相和培養(yǎng)液相之間。從材料上看，微載體的來源主要有早期的人工合成聚合物和現(xiàn)代的天然聚合物及其衍生物[5]。

我們所要選擇的微載體應(yīng)不含毒害細(xì)胞的物質(zhì)且有很好的生物相容性，密度應(yīng)略大于培養(yǎng)液，直徑應(yīng)盡可能小，且有較大的單位體積內(nèi)表面積，利于細(xì)胞生長。另據(jù)研究，微載體表面的電荷密度是影響細(xì)胞貼壁的因素之一，過低的電荷密度使細(xì)胞貼壁不充分，而過高的電荷密度會“毒害”細(xì)胞。此外，優(yōu)良的微載體還應(yīng)是非剛性材料，具有良好的光學(xué)透性，不吸收培養(yǎng)液中的營養(yǎng)成分，易回收，耐高壓滅菌，且價格低廉。在大規(guī)模培養(yǎng)之前，還應(yīng)使用不同微載體對細(xì)胞進(jìn)行小規(guī)模的預(yù)先培養(yǎng)，以確認(rèn)不同微載體對特定細(xì)胞在細(xì)胞密度、培養(yǎng)壽命和產(chǎn)品表達(dá)上的影響。

2.2.2動物細(xì)胞系的選擇及懸浮馴化

在細(xì)胞系的選擇上，因為不同細(xì)胞以及同種細(xì)胞不同克隆株對病毒的易感性都不同，所以在大規(guī)模生產(chǎn)前應(yīng)將細(xì)胞與準(zhǔn)備擴(kuò)增的病毒進(jìn)行相互適應(yīng)性選擇[6]。此外，理想的細(xì)胞系還應(yīng)是能夠高速繁殖的活力較強(qiáng)的細(xì)胞。

在細(xì)胞系的馴化上，因為微載體懸浮培養(yǎng)會使貼壁細(xì)胞的生長狀態(tài)產(chǎn)生變化，所以在馴化過程中，我們可以通過降低培養(yǎng)液中血清濃度的方式來提高細(xì)胞的穩(wěn)定性。

3　研究進(jìn)展

3.1微載體培養(yǎng)實驗室研究進(jìn)展

Jayakumar等使用Cultispher-G微載體培養(yǎng)Vero細(xì)胞制備狂犬疫苗，TCID50達(dá)106個/mL，高于同期轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)效價。[7]李薇等使用Cytodex-3微載體在15L生物反應(yīng)器中培養(yǎng)Vero細(xì)胞，細(xì)胞總數(shù)可達(dá)1.7×1010個，高于同期同體積轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)細(xì)胞，接種乙腦病毒，效價達(dá)到7-7.5lgPFU/mL，可連續(xù)收獲13-15次，均高于同期轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)細(xì)胞[8]。王佃亮等使用Biosilon微載體在1.5L Celligen生物反應(yīng)器中灌流培養(yǎng)Vero細(xì)胞，細(xì)胞密度可達(dá)2.05×107個/mL，接種皰疹性口炎病毒，證明細(xì)胞密度越高，效價越高[9]。韓寶三等用Cyto?dex-3微載體培養(yǎng)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，證明微載體培養(yǎng)技術(shù)可以很好地擴(kuò)增人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，且增殖活性高于同期單層聚苯乙烯培養(yǎng)的細(xì)胞[10]。吳清法等用Cultispher-G微載體培養(yǎng)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，細(xì)胞密度和能量利用率均高于同期12孔板靜止培養(yǎng)的細(xì)胞[11]。

3.2微載體大規(guī)模培養(yǎng)進(jìn)展

Genzel等用生物反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng)MDCK細(xì)胞并接種馬流感病毒，研究了細(xì)胞生長和病毒增殖過程中物質(zhì)代謝情況，為工業(yè)化生產(chǎn)打下基礎(chǔ)[12]。美國Baxter公司6000L生物反應(yīng)器微載體懸浮培養(yǎng)Vero細(xì)胞已經(jīng)能夠生產(chǎn)人源或禽源的H1、H2、H3、H5、H7和H9毒株并對野生型人H5N1病毒有更高產(chǎn)率[13]。

在國內(nèi)，采用生物反應(yīng)器進(jìn)行微載體懸浮培養(yǎng)的最大瓶頸是逐級放大技術(shù)的開發(fā)。清大天一與2011年成功實現(xiàn)10L-50L-120L-650L反應(yīng)器逐級放大微載體懸浮培養(yǎng)MDCK細(xì)胞、Vero細(xì)胞、ST細(xì)胞等多種細(xì)胞[14]。張立等研究了微載體放大過程中的接種工藝并建立了球傳球動力學(xué)模型，用此方法在50L生物反應(yīng)器中培養(yǎng)Vero細(xì)胞，細(xì)胞密度達(dá)1.1×107個/mL[15]。

4　當(dāng)前微載體懸浮培養(yǎng)技術(shù)所存在的問題及對其未來的展望

4.1微載體懸浮培養(yǎng)技術(shù)所存在的問題

微載體懸浮培養(yǎng)技術(shù)雖然經(jīng)過多年研究而有了長足的進(jìn)步，但在將其應(yīng)用到細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的過程中依舊出現(xiàn)不少問題。

首先，通過生物反應(yīng)器微載體懸浮培養(yǎng)細(xì)胞時，細(xì)胞生長會受到對剪切力的敏感性、營養(yǎng)供給阻礙、代謝產(chǎn)物堆積等多種因素影響而使得細(xì)胞活性和密度較低。此外，凋亡細(xì)胞不及時清除還可能造成細(xì)胞大面積死亡[16]。

其次，在細(xì)胞培養(yǎng)的過程中，隨著細(xì)胞的增殖，需要及時增加微載體以供細(xì)胞黏附生長。但是,在實際生產(chǎn)過程中,添加微載體會給操作帶來不便并增加產(chǎn)品污染的幾率,且微載體不能無限增加,當(dāng)微載體不能提供足夠細(xì)胞生長所需的表面時,細(xì)胞生長便會受到抑制。

最后，由于大部分微載體價格高昂，使得對此項技術(shù)的大規(guī)模培養(yǎng)工藝探索變得困難，也使得將此技術(shù)在發(fā)展中國家推廣遇到障礙。

4.2微載體培養(yǎng)的展望

在過去幾十年時間里，應(yīng)用微載體懸浮培養(yǎng)技術(shù)大規(guī)模培養(yǎng)細(xì)胞在疫苗生產(chǎn)領(lǐng)域已積累大量的實驗數(shù)據(jù)。但是，在以下幾方面微載體懸浮培養(yǎng)技術(shù)依舊有進(jìn)步空間。

如前所述，理想化的微載體應(yīng)是能滿足避免細(xì)胞受機(jī)械力損傷，有良好生物相容性，無細(xì)胞毒性，價格低廉且易回收等諸多條件。但就目前的科研進(jìn)展，并未出現(xiàn)能滿足上述要求的微載體。所以，將來微載體的研究方向應(yīng)是改良現(xiàn)有微載體，以滿足細(xì)胞生長要求并便于推廣此項技術(shù)。

除此之外，對現(xiàn)有的生物反應(yīng)器進(jìn)行優(yōu)化和研發(fā)個性化的無血清培養(yǎng)基，以便將這種技術(shù)在細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)領(lǐng)域進(jìn)一步推廣也是微載體懸浮培養(yǎng)未來的發(fā)展方向。

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王蔚曦（1988-)，女，江蘇南京人，本科學(xué)歷，助理工程師，從事疫苗制造工作。