楊聚奇 趙興緒/甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)

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特異性PCR方法快速診斷假性皮疽組織胞漿菌

楊聚奇 趙興緒/甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)

馬流行性淋巴管炎（epizootic lymphangitis，EL）是由偽皮疽組織胞漿菌（Histoplasma farciminosum）引起多種動物以形成淋巴管和淋巴結(jié)周圍炎、腫脹、化膿、潰瘍和肉芽腫結(jié)節(jié)為特征的慢性傳染病。2014年8月18日，靖遠(yuǎn)縣高灣鄉(xiāng)農(nóng)戶家出現(xiàn)馬、騾、驢等馬屬動物發(fā)病情況，發(fā)病動物初期出現(xiàn)跛行，四肢、頸部等皮膚出現(xiàn)豌豆大或核桃大的硬性結(jié)腫，后破潰流出黃白色或淡紅色膿液，逐漸形成潰瘍，繼后肉芽增生，潰瘍高于皮膚表面如蘑菇狀或周圍突起中間凹陷，易于出血，不易愈合。部分馬屬動物鼻黏膜有大小不同的黃色圓形或橢圓扁平隆起或鼻腔流出少量膿性鼻漏，眼瞼結(jié)膜部有潰瘍性結(jié)膜炎。8月20日～23日接到部分戶主電話，為了找出引起暴發(fā)的可能病因及風(fēng)險因素，8月25日開始介入調(diào)查，10月27日結(jié)束，期間共到高灣鄉(xiāng)7次收集信息，并采集典型病例的患病部位病料進(jìn)行實驗室診斷。

一、假性皮疽組織胞漿菌H212分離株內(nèi)含肽Prp8前體基因PCR檢測與鑒定

（一）相關(guān)試劑

DL2000 DNA Marker，Agarose Gel DNA Extraction Kit 均購自O(shè)MEGA公司，DNA提取試劑盒為Roche羅氏，TaKaRa PCR Amplification Kit 購于大連寶生物。

（二）引物設(shè)計與合成

根據(jù)參考基因序列（GenBank： JX274629.1），利用 Primer Premier 5.0 設(shè)計并合成了用于鑒定假性皮疽組織胞漿菌中（Histoplasma capsulatum var. farciminosum isolate H212 intein-containing Prp8 precursor）基因的特異性引物，引物序列由大連寶生物合成。

上游-F： 5'TCGCATTAG-TATTGACGCTGAC 3'

下游-R：5'AGAGCTG-GTCTTTATCGACTCTG 3'

（三）假性皮疽組織胞漿菌基因組的提取

1.取收集的病料置37℃/-20℃的條件下反復(fù)凍溶3次，吸取上清液200μl，加入200 ul trizol，劇烈振蕩30 s，12 000 rpm離心2 min；

2.取上清200 ul，加入100 ul的苯酚和100 ul的氯仿，劇烈振蕩30 s，12 000 rpm 離心2 min；

3.取上清150 ul，加入300 ul無水乙醇，上下巔倒幾次，12 000 rpm離心2 min；

4.棄上清，加入1 000 ul 75%的乙醇，12 000 rpm離心2 min；

5.棄上清，于56℃烘箱中烘干；

6.加入30～50 ul超純水，95℃～100℃加熱5 min。直接進(jìn)行PCR或于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

（四）病料中假性皮疽組織胞漿菌內(nèi)含肽Prp8前體基因的檢測

在病料中對假性皮疽組織胞漿菌基因組進(jìn)行提取后，用TaKaRa PCR Amplification Kit對提取的病料基因進(jìn)行用PCR檢測。

PCR擴(kuò)增基因的反應(yīng)條件分別為：94℃ 5 min；94℃ 45s，56℃ 45s，72℃ 2 min，共35個循環(huán)，72℃10 min，4℃結(jié)束反應(yīng)。將擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物，送大連寶生物公司進(jìn)行測序。

（五）瓊脂糖凝膠電泳

配制1.0%的瓊脂糖凝膠，按終濃度1 ug/ml加入E.B.，取5 ul PCR產(chǎn)物與0.5 ul 10倍加樣緩沖液混合均勻，以DL2000 Marker作對照，85V恒定電壓電泳30 min后，在紫外透射儀下觀察，并記錄結(jié)果。

圖4 目的基因PCR擴(kuò)增

二、DNA測序

將核酸電泳檢測為陽性PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程技術(shù)公司進(jìn)行測序。

得到的測序結(jié)果用DNAStar軟件（5.0版）進(jìn)行分析，并在基因庫中進(jìn)行序列比對分析。以此確定特異PCR作為診斷方法的準(zhǔn)確性。

（一）測序結(jié)果分析

基因測序后比對的結(jié)果可查詢網(wǎng)址（http：//blast. ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi），與H212菌株的同源性為99%，與其他假性皮疽組織胞漿菌菌株同源性也在98%以上。

（二）特異性PCR擴(kuò)增

疽桿菌、鏈球菌、假性皮疽組織胞漿菌的基因進(jìn)行擴(kuò)增檢測，根據(jù)PCR最佳條件擴(kuò)增條件，用特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳后，結(jié)果顯示這對特異性引物只能擴(kuò)增出假性皮疽組織胞漿intein-containing Prp8 precursor基因。

三、討論

（一）特異性引物的設(shè)計問題

建立PCR診斷方法，引物的設(shè)計至關(guān)重要。該試驗在設(shè)計引物時，所選用的模板序列是假性皮疽組織胞漿intein-containing Prp8 precursor基因。這個基因在基因庫中與其他病原的基因同源性在80%以下，只有和莢膜阿耶羅菌nam1 mRNA前體的加工剪接因子8這個部分基因有98%的同源性，但是莢膜阿耶羅菌nam1 mRNA前體的加工剪接因子8這個基因是mRNA，首先需要反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，而假性皮疽組織胞漿inteincontaining Prp8 precursor基因是DNA，在試驗過程中直擴(kuò)增的是DNA，所以莢膜阿耶羅菌nam1 mRNA前體的加工剪接因子8基因不會影響本實驗特異性試驗。基因測序后比對的結(jié)果可查詢網(wǎng)址（http：//blast.ncbi. nlm.nih.gov/Blast.cgi），與H212菌株的同源性為99%，與其他假性皮疽組織胞漿菌菌株同源性也在98%以上。

（二）PCR實驗條件的優(yōu)化

由于存在污染、聚合酶抑制劑、不適宜的反應(yīng)條件影響反應(yīng)靈敏度，導(dǎo)致假陰性或假陽性結(jié)果等原因，因此利用PCR方法建立的診斷體系，必須在應(yīng)用于臨床常規(guī)檢查前，對影響PCR反應(yīng)的各個因素進(jìn)行優(yōu)化，篩選出最佳反應(yīng)體系，從而達(dá)到提升PCR診斷方法敏感性和特異性的目的。影響PCR方法敏感性的因素非常多，但據(jù)文獻(xiàn)報道，Mg2+濃度和退火溫度是影響PCR結(jié)果的主要因素，直接影響到PCR能否成功。在不同的引物一模板系統(tǒng)中，最適合的Mg2+也不相同；而退火溫度升高，可以防止非特異性擴(kuò)增現(xiàn)象所以本次實驗主要從Mg2+，濃度和退火溫度來優(yōu)化反應(yīng)條件，確定特異引物所能擴(kuò)增理想模板量的最佳反應(yīng)條件，這對簡化操作程序具有重要意義。

（三）病原樣品的選擇

本試驗選擇疽桿菌、鏈球菌、假性皮疽組織胞漿菌作為特異性試驗的樣品。由于這三種在文獻(xiàn)報道中引起的臨床癥狀最為相似。除此之外，通過基因庫中對比查詢，未在發(fā)現(xiàn)同源性高的其他病原。因此本診斷方法選擇它們作為特異性試驗的樣品。

（四）結(jié)論

綜上所述用特異PCR方法來快速診斷假性皮疽組織胞漿菌是可行的，本方法克服了傳統(tǒng)方法的一些弱點，具有特異性強(qiáng)，敏感性高，穩(wěn)定性強(qiáng)，簡便，快速的優(yōu)點，對于假性皮疽組織胞漿菌病分子流行病學(xué)的調(diào)查、診斷、疾病的防制都具有重要的意義。

參考文獻(xiàn)（略）