張正英，陳玉梁

( 1.甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，蘭州　730070；2.甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 生物技術(shù)研究所，蘭州　730070)

甘藍(lán)過量表達(dá)硝酸還原酶基因?qū)ο跛猁}積累的影響

張正英1，陳玉梁2

( 1.甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，蘭州730070；2.甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 生物技術(shù)研究所，蘭州730070)

為探索過量表達(dá)硝酸還原酶基因?qū)Ω仕{(lán)(BrassicaoleraceaL. var.capitataL.)硝酸鹽積累的影響，以‘中甘11號(hào)’下胚軸為外植體，采用根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)介導(dǎo)法將煙草硝酸還原酶基因(NR)導(dǎo)入甘藍(lán)，獲得13株卡那霉素抗性植株。PCR和Southern blot檢測(cè)證實(shí)，NR基因已經(jīng)成功導(dǎo)入并整合到甘藍(lán)的基因組。4個(gè)轉(zhuǎn)基因株系硝酸鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)明顯低于非轉(zhuǎn)基因供體株系，降幅為13.9%～23.0%。說明：將重組硝酸還原酶基因?qū)敫仕{(lán)且得到超量表達(dá)，創(chuàng)制低硝酸鹽育種材料的方法可行。

甘藍(lán)；農(nóng)桿菌介導(dǎo)法；硝酸還原酶基因；硝酸鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)

甘藍(lán)(BrassicaoleraceaL. var.capitataL.)是人們喜食的蔬菜之一。以甘藍(lán)、花椰菜、娃娃菜等優(yōu)勢(shì)蔬菜產(chǎn)品為主的 “高原夏菜” 已成為甘肅農(nóng)業(yè)的亮點(diǎn)，銷往全國(guó)80多個(gè)大中城市[7]。甘藍(lán)存在硝酸鹽積累的品種特異性，是較易積累硝酸鹽的蔬菜品種之一[8-9]。近年來，因栽培中過度使用化學(xué)肥料、農(nóng)藥造成蔬菜化肥農(nóng)藥殘留問題突出，重茬栽培葉類蔬菜硝酸鹽危害尤為明顯[10-11]。都韶婷等[12]研究顯示，篩選低硝酸鹽積累的蔬菜品種是降低蔬菜硝酸鹽積累的一種可行措施。

甘藍(lán)轉(zhuǎn)基因研究已在抗蟲、抗旱、耐鹽及雄性不育等方面取得較好的進(jìn)展，優(yōu)化以農(nóng)桿菌介導(dǎo)法為主的基因轉(zhuǎn)化體系，明確子葉、下胚軸等外植體及基因型在甘藍(lán)基因轉(zhuǎn)化中的作用，創(chuàng)造一些具有利用前景的新材料[13-16]。為探索過量表達(dá)硝酸還原酶基因?qū)Ω仕{(lán)硝酸鹽積累的影響，本研究將硝酸還原酶基因轉(zhuǎn)入甘藍(lán)且得到超量表達(dá)，獲得低硝酸鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)的育種材料，為其他蔬菜的品質(zhì)改良提供新思路。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1植物材料甘藍(lán)品種‘中甘11號(hào)’由甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院飛天種業(yè)股份公司提供。試驗(yàn)在甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.1.2菌株和載體供試根癌農(nóng)桿菌菌株為L(zhǎng)BA4404。植物重組質(zhì)粒表達(dá)載體pBCSL16由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)植物生理生化國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室肖興國(guó)博士提供，質(zhì)粒中目標(biāo)基因NR與選擇基因nptⅡ相連，由 CaMV35s啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)(圖1)。

1.1.3培養(yǎng)基MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，固體YEP培養(yǎng)基為培養(yǎng)農(nóng)桿菌所用培養(yǎng)基，液體MS培養(yǎng)基為菌液懸浮培養(yǎng)基。甘藍(lán)遺傳轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基及其配方見表1。

圖1　植物表達(dá)載體pBCSL16結(jié)構(gòu)

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1外植體準(zhǔn)備將預(yù)冷處理的‘中甘11’號(hào)種子，用自來水沖洗30 min，40 ℃水浸泡30 min，濾去水分；用φ=75%乙醇處理1 min，再用1 g/L HgCl2消毒8 min，無菌水清洗6次；接種到播種培養(yǎng)基上發(fā)芽。取7 d齡苗的下胚軸接種于預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基，25 ℃暗處預(yù)培養(yǎng)2 d，用于轉(zhuǎn)化試驗(yàn)。

1.2.2侵染菌液制備挑取含有NR質(zhì)粒的農(nóng)桿菌LBA4404單菌落，接種于5 mL液體YEB培養(yǎng)基(含50 mg/L卡那霉素和100 mg/L鏈霉素)，28℃、250r/min振蕩培養(yǎng)過夜；將培養(yǎng)好的菌液按1%的接種量接種至YEB培養(yǎng)基(含50 mg/L卡那霉素和100 mg/L鏈霉素)，28 ℃繼續(xù)培養(yǎng)24 h，直到OD600約為1.0左右，將菌液懸浮液在8 000 r/min離心8 min收集菌體，用無菌的1/2 MS培養(yǎng)基重新懸浮菌體沉淀，并按照懸浮液和1/2 MS培養(yǎng)基按一定比例稀釋，使獲得的侵染菌液OD600值約為0.6。

表1　甘藍(lán)遺傳轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基

1.2.3遺傳轉(zhuǎn)化取出在預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)2 d的下胚軸，浸入用1/2 MS稀釋、OD600值為 0.6的工程菌液，浸染10 min，期間一直輕微搖動(dòng)，使農(nóng)桿菌與外植體充分接觸；用濾紙吸去外植體表面過多的菌液，接種于置有一層無菌濾紙的MS培養(yǎng)基，每皿接種10～15個(gè)外植體，25 ℃黑暗共培養(yǎng)2 d。清洗外植體，轉(zhuǎn)入加有500 mg/L羧芐青霉素的分化培養(yǎng)基，25 ℃、16 h/8 h光周期下培養(yǎng)，誘導(dǎo)抗性愈傷組織產(chǎn)生。采用延遲篩選法篩選抗性芽，即在得到綠色分化芽時(shí)轉(zhuǎn)入加有卡那霉素的延遲選擇培養(yǎng)基，且卡那霉素質(zhì)量濃度由5 mg/L逐漸增加到20 mg/L。經(jīng)卡那霉素篩選至抗性芽長(zhǎng)1 cm左右，將保持綠色的抗性芽轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中長(zhǎng)成完整綠色植株。未用農(nóng)桿菌侵染的對(duì)照外植體用同樣方法進(jìn)行培養(yǎng)。對(duì)篩選得到的生根綠苗進(jìn)行編號(hào)，通過莖段進(jìn)行擴(kuò)繁，擴(kuò)大株系群體。將經(jīng)分子鑒定、生根健壯的轉(zhuǎn)化苗開瓶練苗7 d，沖洗干凈根部的培養(yǎng)基，移入V(蛭石)∶V(土)=1∶1的花盆，開始用塑料薄膜覆蓋花盆，并及時(shí)澆水、通風(fēng)，后期管理同溫室培養(yǎng)常規(guī)管理。按獲得的抗性植株占總外植體的百分率統(tǒng)計(jì)轉(zhuǎn)化率。

1.2.4PCR分子檢測(cè)分別取經(jīng)抗生素篩選的T0遺傳轉(zhuǎn)化再生植株葉片和對(duì)照植株葉片各2 g，用CTAB法[17]提取甘藍(lán)基因組DNA。根據(jù)nptⅡ基因序列設(shè)計(jì)引物，預(yù)期擴(kuò)增片段大小為676 bp。上、下游引物序列分別為：5′-CGTAAAGCACGAGGAAGC-3′和5′-AATGAACTCCAGGACGAGG-3′，均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR擴(kuò)增體系：10×PCR Buffer 2.5 μL，25 mmol/L dNTP 2.0 μL，25 mmol/L MgCl22.0 μL，20 μmol/L兩端引物各1.0 μL，TaqDNA 聚合酶1 U，基因組DNA 模板200 ng，加雙蒸水至25 μL。PCR擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性45 s，68 ℃復(fù)性1 min，72 ℃延伸2 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。取樣10.0 μL經(jīng)20 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增效果。

1.2.5Southern blot雜交分析以提取的轉(zhuǎn)化植株基因組DNA為樣品，以質(zhì)粒pBCSL16經(jīng)BamHⅠ酶切 DNA為正對(duì)照，以非轉(zhuǎn)化植株基因組DNA為負(fù)對(duì)照，DNA經(jīng)內(nèi)切酶BamHⅠ消化，8 g/L瓊脂糖電泳檢測(cè)酶切結(jié)果準(zhǔn)確后，采用毛細(xì)管轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜，準(zhǔn)備分子雜交。質(zhì)粒用BamHⅠ酶切，回收約3.7 kb的硝酸還原酶基因片段作模板，用地高辛標(biāo)記該片段作為雜交探針，進(jìn)行Southern blot雜交。探針標(biāo)記、雜交及檢測(cè)試劑盒為DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter KitⅠ，購(gòu)自羅氏診斷產(chǎn)品(上海)有限公司，具體步驟按照試劑盒操作說明執(zhí)行。

1.2.6轉(zhuǎn)基因株系硝酸鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定轉(zhuǎn)基因和對(duì)照植株在溫室生長(zhǎng)約 2個(gè)月后，取其葉片采樣。每個(gè)株系測(cè)定4株，以未轉(zhuǎn)化植株為對(duì)照，測(cè)定方法采用GB/T 15401-1994。

2結(jié)果與分析

2.1甘藍(lán)轉(zhuǎn)化體系的建立及轉(zhuǎn)化植株的獲得

在對(duì)影響轉(zhuǎn)化效果的關(guān)鍵因素進(jìn)行優(yōu)化后，初步建立一套適宜‘中甘11號(hào)’的遺傳轉(zhuǎn)化體系，即將7 d苗齡的下胚軸，在預(yù)培養(yǎng)基中培養(yǎng)2 d后作為外植體，在OD600約 0.6的農(nóng)桿菌工程菌液中浸染10 min，再在pH為5.8、不加抗生素的分化培養(yǎng)基中共培養(yǎng)2 d；經(jīng)愈傷組織誘導(dǎo)分化、繼代培養(yǎng)與抗生素延遲篩選、生根生長(zhǎng)等過程，獲得抗性工程植株13株，遺傳轉(zhuǎn)化頻率為10.9%。

2.2轉(zhuǎn)化植株的 PCR檢測(cè)與Southern blot雜交

以質(zhì)粒pBCSL16為陽(yáng)性對(duì)照，未轉(zhuǎn)化基因植株為陰性對(duì)照，對(duì)13株抗性苗中生長(zhǎng)健壯的4株進(jìn)行 PCR分析。4株轉(zhuǎn)基因植株均得到 1條676 bp的片段，與預(yù)期片段大小相符(圖2)。

將 PCR檢測(cè)為陽(yáng)性的 4株轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行Southern blot雜交分析，4株植株均獲得明顯的雜交信號(hào)，而非轉(zhuǎn)化對(duì)照基因組中未出現(xiàn)任何雜交信號(hào)，進(jìn)而證實(shí)NR基因已整合至甘藍(lán)基因組(圖3)。

1. Marker；2. 陽(yáng)性對(duì)照Positive control；3. 陰性對(duì)照Negative control；4～7. 轉(zhuǎn)化植株G2、G4、G6、G21Transgenic plants: G2,G4,G6 and G21

圖2甘藍(lán)轉(zhuǎn)化植株的PCR 鑒定

Fig.2PCR amplification of transgenic plants of cabbage

1. Marker；2. 陰性對(duì)照Negative control；3. 陽(yáng)性對(duì)照Positive control；4～7. 轉(zhuǎn)化植株G2、G4、G6、G21Transgenic plants: G2,G4,G6 and G21

圖3甘藍(lán)轉(zhuǎn)化植株的 Southern blot雜交

Fig.3Southern blot hybridization of

transgenic cabbage plants

2.3甘藍(lán)轉(zhuǎn)基因植株硝酸鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)

對(duì)轉(zhuǎn)基因甘藍(lán)植株葉片硝酸鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示，甘藍(lán)轉(zhuǎn)基因植株體內(nèi)硝酸鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)均顯著低于未轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩?，降?3.9%～23.0%，其中，株系G2和G21降低幅度最大，接近和達(dá)到23.0%(圖4)。說明，利用基因工程技術(shù)降低蔬菜植株硝酸鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)的方法可行。

圖4　轉(zhuǎn)基因甘藍(lán)植株硝酸鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)

3結(jié)論與討論

因?yàn)榈视昧吭黾蛹斑B作，蔬菜中累積硝態(tài)氮的增加程度遠(yuǎn)大于生長(zhǎng)量的增加量[8]，這是蔬菜中硝酸鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高的起因。提高氮素肥料利用率、降低硝酸鹽積累量、提高硝酸還原酶活性是降低蔬菜中硝酸鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)的有效途徑，本研究初步證明，與甘藍(lán)未轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩瓯容^，轉(zhuǎn)基因植株體內(nèi)的硝酸鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)降低13.9%～23.0%，差異十分明顯，說明：通過基因的過量表達(dá)可以實(shí)現(xiàn)降低蔬菜中硝酸鹽含量的目標(biāo)。

建立高效的遺傳轉(zhuǎn)化體系是實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因遺傳操作的基礎(chǔ)。有研究顯示，建立較好的種子表面消毒技術(shù)，平均發(fā)芽率可達(dá)到75%以上[18]。以無菌苗子葉、下胚軸為外植體，從基因型、苗齡、培養(yǎng)基(生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑、AgNO3質(zhì)量濃度等)等因素研究甘藍(lán)轉(zhuǎn)化體系，發(fā)現(xiàn)用下胚軸作外植體效果明顯優(yōu)于子葉。王肖紅等[19]、李春雨等[16]、何紹敏等[20]等以甘藍(lán)下胚軸為外植體成功獲得耐鹽、不育和抑制自交不親和的轉(zhuǎn)化體。

在甘藍(lán)類蔬菜上，多數(shù)試驗(yàn)采用10～25 mg/L卡那霉素作為篩選壓[21]。預(yù)備試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，較低質(zhì)量濃度(5 mg/L)的卡那霉素可抑制下胚軸再生，當(dāng)卡那霉素質(zhì)量濃度高于20 mg/L可致甘藍(lán)不定芽白化死亡，說明甘藍(lán)對(duì)卡那霉素非常敏感，為達(dá)到既不影響再生又確保篩選的目的，采取抗生素延遲篩選的辦法效果較好。即在分化初期的培養(yǎng)基中(第1周)不加卡那霉素，僅加入羧芐青霉素，抑制農(nóng)桿菌；待外植體膨大產(chǎn)生愈傷后，繼代篩選培養(yǎng)過程中加入卡那霉素，選擇壓力由5 mg/L逐漸增加到20 mg/L進(jìn)行抗性篩選。加入卡那霉素后外植體的分化速度減緩，部分外植體開始白化或褐化死亡，每隔15 d進(jìn)行繼代培養(yǎng)，隨著選擇次數(shù)的增加逐漸降低羧芐青霉素質(zhì)量濃度至200 mg/L，直至分化出綠苗。

在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的蕓苔屬蔬菜遺傳轉(zhuǎn)化方法中，轉(zhuǎn)化效率受基因型和外植體影響較明顯。甘藍(lán)轉(zhuǎn)基因的難度較大，品種間也存在較大差異[22]。

本研究?jī)H建立甘藍(lán)品種‘中甘11號(hào)’的遺傳轉(zhuǎn)化體系，而且不是純系自交系，限制獲得材料的應(yīng)用；由于外源基因的插入位點(diǎn)具有隨機(jī)性，目標(biāo)基因在后代中的遺傳穩(wěn)定性和表達(dá)還有待于深入研究。

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Effect of Overexpression of Nitrate Reductase Gene on Nitrate Accumulation in Cabbage

ZHANG Zhengying1and CHEN Yuliang2

(1. Gansu Academy of Agricultural Sciences,Lanzhou730070,China;2.Institute of Biotechnology,Gansu Academy of Agricultural Sciences,Lanzhou730070,China)

To explore the effects of overexpression of nitrate reductase gene on cabbage(BrassicaoleraceaL. var.capitataL.) nitrate accumulation,the nitrate reductase gene from tobacco was transfer into genome of cabbage cultivar ‘Zhonggan No.11’ viaAgrobacteriumtumefaciensand 13 transgenic plants with kanamycin risistance were obtained.PCR and Southern blot showed that nitrate reductase gene was successfully integrated into the genome of cabbage. Determination of leaf nitrate content showed that nitrate content were significantly lower,with the decline range of 13.9%-23.0%,in four transgenic lines than the donor line. The results indicated that it is feasible to create cabbage breeding materials characterized low nitrate by means of excessively expressing the restructured nitrate reductase genes.

Cabbage;Agrobacterium-mediated gene transfer; Nitrate reductase gene; Nitrate mass fraction

2016-02-23

2016-04-20

The National Natural Science Foundation of China(No.31460350); the Operating Sci-tech Project of Gansu province(No.QS022-C31-048).

ZHANG Zhengying,male,associate research fellow.Research area:genetics and breeding in crops.E-mail:kegc8@sina.com

(責(zé)任編輯：郭柏壽Responsible editor:GUO Baishou)

2016-02-23修回日期：2016-04-20

國(guó)家自然科學(xué)基金(31460350)；甘肅省科學(xué)事業(yè)費(fèi)(QS022-C31-048)。

張正英，男，副研究員，研究方向?yàn)樽魑镞z傳育種。E-mail：kegc8@sina.com

S335.3

A

1004-1389(2016)07-1024-05

網(wǎng)絡(luò)出版日期：2016-06-30

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20160630.1624.018.html