種宇軒，任連海，王 攀

(北京工商大學(xué) 食品學(xué)院，北京 100048)

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利用煎炸廢油合成PHA的工藝條件探討

種宇軒，任連海，王 攀

(北京工商大學(xué) 食品學(xué)院，北京 100048)

摘要：以煎炸廢油作為發(fā)酵過程中的碳源，對殺蟲貪銅菌發(fā)酵生產(chǎn)PHA過程的發(fā)酵特性進行了研究。考察了發(fā)酵過程中初使pH值、搖瓶裝液量、培養(yǎng)溫度、搖床轉(zhuǎn)速、接種量和廢油添加量六個因素與細(xì)胞干重及PHA產(chǎn)量之間的關(guān)系。實驗結(jié)果表明：以餐廚廢油作為碳源物質(zhì)發(fā)酵制備PHA是可行的，并得到發(fā)酵優(yōu)化條件為：初使pH值為7.5、裝液量100 mL/250 mL、培養(yǎng)溫度28 ℃、接種量3 %、轉(zhuǎn)速160 r/min、廢油添加量25 mL/L，在此條件下菌株合成PHA能力最佳。

關(guān)鍵詞：聚羥基脂肪酸酯； 煎炸廢油； 發(fā)酵條件

1引言

餐廚廢油是餐飲行業(yè)廢棄油脂的混合物，包括煎炸廢油、泔水油和地溝油等源自于餐飲業(yè)的廢油脂，成分主要是烹調(diào)用植物油和食品中動物油脂，化學(xué)組成主要為脂肪酸甘油酯[1]。其中煎炸廢油主要來自于餐飲業(yè)的煎炸工序，這類廢油產(chǎn)生源相對集中，容易收集[1]。煎炸廢油屬于大分子疏水性有機物，其在多次煎炸過程中與空氣中的氧氣接觸，發(fā)生一系列水解、氧化、聚合等復(fù)雜反應(yīng)，使得油黏度增加，油中原本含有的一些不飽和脂肪酸含量極低，產(chǎn)生了一些具有致癌作用的脂肪酸類聚合物及醛、酮、內(nèi)酯等刺激性氣味的物質(zhì)[2]。

聚羥基脂肪酸酯( Poly hydroxya lkanoates，PHA) 是一類廣泛存在于微生物體內(nèi)的高分子生物聚酯，在生物體內(nèi)主要作為碳源和能量的貯藏物質(zhì)。PHA 與傳統(tǒng)的化工合成的塑料具有相似的材料學(xué)性質(zhì)，更有著顯著的生物相容性和生物可降解性的特點。其具有光學(xué)活性、壓電性和氣體相隔性等許多優(yōu)秀的物理性能，使其有著廣泛應(yīng)用的價值[3，4]。

生產(chǎn)成本高是目前限制聚羥基脂肪酸酯應(yīng)用的主要原因，而原料成本高是這其中的關(guān)鍵因素。PHA生產(chǎn)的整個過程應(yīng)該被整體設(shè)計和分析,包括碳源分析、發(fā)酵過程、PHA產(chǎn)率以及提取方法等[5]。目前PHA生產(chǎn)主要依賴于微生物發(fā)酵，在微生物發(fā)酵合成PHA的所有發(fā)酵條件因素中，底物是一個重要因素，底物成本占到總成本的28 %～50 %[6]。因此采用更佳廉價的底物可以在很大程度上降低PHA的生產(chǎn)成本。

煎炸廢油在多次使用之后會產(chǎn)生對于人的身體健康有害的物質(zhì)，但同時煎炸廢油具有較高的碳含量，因此將煎炸廢油回收應(yīng)用于PHA的發(fā)酵，不僅可以解決煎炸廢油所造成的廢水、廢氣的環(huán)境問題，避免煎炸廢油對于人身健康造成的風(fēng)險，同時可以將廢棄資源循環(huán)再利用，降低PHA的生產(chǎn)成本，并產(chǎn)生附加值更高的產(chǎn)品[7～10]，可謂一舉多得。

2實驗部分

2.1實驗材料

2.1.1菌種及煎炸廢油

(1)菌株：選用實驗室保藏的購于中國微生物保藏中心的1.7092-殺蟲貪銅菌(Cupriavidus necator)。Cupriavidus necator是一類可以食用油或廢棄油脂發(fā)酵生產(chǎn)PHA的一株高產(chǎn)菌株[11]。

(2)煎炸廢油：多次反復(fù)煎炸雞翅、肉串等重復(fù)使用兩天的廢油。

2.1.2培養(yǎng)基

(1)種子培養(yǎng)基：10 g/L蛋白胨，5 g/L牛肉膏，5 g/L氯化鈉，1L蒸餾水，混合后調(diào)至pH值為7.0。

(2)發(fā)酵培養(yǎng)基：3 g硫酸銨，1 g磷酸二氫鉀，11.1 g磷酸氫二鈉，0.2 g硫酸錳，和1 mL微量元素(9.7 g FeCl3，7.8 g CaCl2，0.156 g CuSO4·5 H2O，0.119 g CoCl2，0.118 g NiCl2，0.062 g CrCl2于1L0.1mol/L的HCl溶液中)，一定量的煎炸廢油。

2.2實驗方法：

2.2.1發(fā)酵條件：

(1)種子培養(yǎng)：將活化后的菌株接種于種子培養(yǎng)基中，置于搖床(30 ℃，160r/min)中搖瓶培養(yǎng)48 h。

(2)發(fā)酵培養(yǎng)：在發(fā)酵培養(yǎng)基中移取相應(yīng)接種量的種子培養(yǎng)液，在不同的發(fā)酵條件下進行搖瓶培養(yǎng)。其中發(fā)酵條件選取不同的初使pH值，發(fā)酵溫度，搖床轉(zhuǎn)速，裝液量，廢油添加量，接種量進行培養(yǎng)。

2.2.2分析方法：

(1)細(xì)胞干重的測定：取一定量的菌液于50 mL的離心管中，于離心機6000r/min離心15 min，離心后棄去上清，加入一定量蒸餾水，繼續(xù)離心兩次洗去油脂及培養(yǎng)基殘留，棄上清后將樣品冷凍干燥，在分析天平上稱重計數(shù)。

(2)PHA的定量分析：采用氣相色譜法(GC)分析確認(rèn)[12,13]。樣品的預(yù)處理過程為：將凍干后的樣品加入2 mL的氯仿、2 mL的苯甲酸-甲醇溶液(1 g/L的苯甲酸、3 %的硫酸，用甲醇(色譜純)定容至1L)，混合，置于烘箱中在105 ℃下進行甲酯化4h。消解后的樣品, 室溫冷卻30 min，加入1 mL的蒸餾水，劇烈震蕩1 min，靜置分層30 min，取1 mL下層有機相進行氣相色譜分析測定。

3結(jié)果分析與討論

3.1初使pH值對PHA產(chǎn)量的影響

為了考察初使pH對細(xì)菌生長及PHA合成情況的影響,設(shè)計初使pH的單因素影響實驗, 分別調(diào)節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基的初使pH值為6、6.5、7、7.5、8，搖瓶裝液量為150 mL滅菌后接入2 %的活化菌液，廢油添加量為20 mL/L，30 ℃，160r/min恒溫振蕩培養(yǎng)72 h。

圖1　初使pH值對細(xì)胞干重及PHA產(chǎn)量的影響

由圖1可知，當(dāng)pH值為6時，細(xì)胞干重最小，約為3.38 g/L。隨pH值的升高，細(xì)胞干重迅速增高，在pH值為7.5時達(dá)到最大，約為7.26 g/L；之后隨著pH值的繼續(xù)增高，細(xì)胞干重呈現(xiàn)減少趨勢。PHA產(chǎn)量也隨pH值的增大呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，其中pH值為7.5時，獲得PHA產(chǎn)量最佳。

因此，可以看出實驗菌株在初使偏弱堿性環(huán)境下菌株生長情況較好，且PHA產(chǎn)量相對較高，證明菌株適宜在弱堿條件下生長，PHA適宜在弱堿性條件下積累。分析原因應(yīng)為在此條件下與菌株生長有關(guān)的酶和與PHA合成相關(guān)的酶的活性最好。因此發(fā)酵條件適宜pH值范圍為pH 7～8，其中，pH值為7.5時最佳。

3.2裝液量對PHA產(chǎn)量的影響

設(shè)置250 mL搖瓶中每瓶裝發(fā)酵液量分別為50 mL、75 mL、100 mL、125 mL、150 mL，pH值調(diào)為7.5，滅菌后接入2 %的活化菌液，煎炸廢油添加量20 mL/L，30 ℃，160r/min恒溫振蕩培養(yǎng)72 h。

圖2　搖瓶裝液量對細(xì)胞干重及PHA產(chǎn)量的影響

由圖2可知，在裝液量為50mL時，細(xì)胞干重最小，最小值約為5.29 g/L，隨著裝液量的增加，細(xì)胞干重也隨之增加，當(dāng)裝液量為100mL時，細(xì)胞干重到達(dá)最大值，約為7.52 g/L；隨著裝液量的繼續(xù)增加，細(xì)胞干重又隨之呈現(xiàn)減少趨勢。

PHA產(chǎn)量也是呈先增大后減小趨勢，裝液量在50～100 mL區(qū)間時，菌液中的PHA含量隨其增加而增加，在100 mL達(dá)到峰值，最大PHA產(chǎn)量約為6.31 g/L；隨后隨著裝液量的增加，PHA產(chǎn)量逐漸減少。這是因為通常情況下，裝液量的多少影響著菌體與空氣相接觸的機會。隨著裝液量的增加，菌體與空氣的接觸機會就會減小，溶解氧量也隨之減少，菌體生長受到抑制。因此搖瓶發(fā)酵過程的最佳裝液量為100 mL。

3.3培養(yǎng)溫度對PHA產(chǎn)量的影響

將發(fā)酵培養(yǎng)基pH值調(diào)為7.5，搖瓶裝液量為100 mL。滅菌后接入2 %的活化菌種，煎炸廢油添加量20 mL/L，放入恒溫振蕩培養(yǎng)箱中分別以24 ℃、26 ℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃為培養(yǎng)溫度，160 r/min搖床振蕩培養(yǎng)72 h。

圖3　培養(yǎng)溫度對細(xì)胞干重及PHA產(chǎn)量的影響

由圖3可知，在24 ℃時細(xì)胞干重為最小值，細(xì)胞干重隨著培養(yǎng)溫度的升高而增大，在28 ℃時達(dá)到最大值8.01 g/L；之后，隨著溫度的繼續(xù)升高，細(xì)胞干重又逐漸降低。

PHA為胞內(nèi)產(chǎn)物，PHA產(chǎn)量與菌體產(chǎn)量呈正相關(guān)的狀態(tài)[14,15]，因此不同培養(yǎng)溫度條件下，PHA的產(chǎn)量不同。溫度較低時，生物量也較低，是因為溫度低菌體生長比較緩慢；隨著溫度的升高，菌種大量繁殖，故而產(chǎn)生的PHA量也明顯增多；而高溫對菌體的生長影響也很明顯，當(dāng)溫度升至28 ℃以上，隨溫度的升高，PHA產(chǎn)量呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢，說明培養(yǎng)溫度過高對菌株的生長會產(chǎn)生抑制作用，引起細(xì)胞的死亡，導(dǎo)致PHA產(chǎn)量也隨之降低，因此適宜的培養(yǎng)溫度為28 ℃。

3.4搖床轉(zhuǎn)速對PHA產(chǎn)量的影響

將發(fā)酵培養(yǎng)基pH值調(diào)為7.5，搖瓶裝液量為100 mL。滅菌后接入2 %的活化菌種，煎炸廢油添加量20 mL/L，放入28 ℃，轉(zhuǎn)速分別為120 r/min、140 r/min、160 r/min、180 r/min、200 r/min的搖床中恒溫振蕩培養(yǎng)72 h。

由圖4可知，轉(zhuǎn)速為200 r/min時，細(xì)胞干重最小，而隨著轉(zhuǎn)速的減小，細(xì)胞干重迅速增多，在轉(zhuǎn)速為160 r/min時達(dá)到峰值，約為7.03 g/L，隨著轉(zhuǎn)速的繼續(xù)逐漸減小，細(xì)菌干重又開始逐漸減少。

由圖4可以看出，轉(zhuǎn)速過低會導(dǎo)致菌株與營養(yǎng)物接觸不充分，菌種生長狀況不佳，使得PHA產(chǎn)量相對較少；而當(dāng)轉(zhuǎn)速過高時，溶解氧過高，又會抑制合成菌的生長。因此，轉(zhuǎn)速過高或過低都會導(dǎo)致PHA產(chǎn)量的減少，較適宜轉(zhuǎn)速范圍為140～180r/min，其中160r/min為合成PHA的最佳轉(zhuǎn)速。

圖4　搖床轉(zhuǎn)速對細(xì)胞干重及PHA產(chǎn)量的影響

3.5接種量對PHA產(chǎn)量的影響

將發(fā)酵培養(yǎng)基pH值調(diào)為7.5，搖瓶裝液量為100 mL。滅菌后分別接入1 %、2 %、3 %、4 %、5 %的活化菌種，煎炸廢油添加量20 mL/L，28 ℃，160r/min恒溫振蕩培養(yǎng)72 h。

圖5　接種量對細(xì)胞干重及PHA產(chǎn)量的影響

由圖5可以看出，接種量為1 % 時細(xì)胞干重為最小值4.89 g/L；隨著接種量的增加細(xì)胞干重逐漸增大，在接種量為3 % 時達(dá)到最大值7.23 g/L；隨后接種量繼續(xù)增大，細(xì)胞干重則逐漸降低。

分析原因為，在接種量為1 %時，由于菌體量較少，培養(yǎng)基營養(yǎng)物質(zhì)過剩，菌株適應(yīng)期延長，所以PHA的合成量也相對較少；隨著接種量的增加，使得有足夠的合成菌與營養(yǎng)物充分結(jié)合，菌體生長旺盛，故而合成的PHA量也明顯增多；而隨著接種量的繼續(xù)增加，由于菌株之間的對于營養(yǎng)物質(zhì)的競爭作用，菌株生長受到一定抑制，細(xì)胞干重與PHA的產(chǎn)量反而減小。因此3 %為菌種發(fā)酵的最佳接種量。

3.6廢油添加量對PHA產(chǎn)量的影響

將發(fā)酵培養(yǎng)基pH值調(diào)為7.5，搖瓶裝液量為100 mL。滅菌后接入3 %的活化菌種，煎炸廢油添加量分別為10 mL /L、15 mL /L、20 mL /L、25 mL /L、30 mL /L，28 ℃，160 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)72 h。

圖6　廢油添加量對細(xì)胞干重及PHA產(chǎn)量的影響

由圖6可以看出，當(dāng)廢油添加量為10 mL/L時，發(fā)酵液的細(xì)胞干重最小；隨著廢油添加量的增加，也就是碳源質(zhì)量的增加，細(xì)胞干重也快速增加；當(dāng)廢油添加量為25 mL/L時到達(dá)最大，約為7.91 g/L；隨著廢油的繼續(xù)增加，細(xì)胞干重呈現(xiàn)緩慢減少的趨勢。

PHA是原核微生物在碳、氮營養(yǎng)失衡的情況下,作為碳源和能源貯存而合成的一類熱塑性聚酯[16],因此發(fā)酵底物中碳源量的變化造成的碳氮比變化會對菌體PHA的合成情況會有明顯的影響。

因此，當(dāng)廢油添加量較少時，由于碳源物質(zhì)不充足，菌株并沒有得到足夠的營養(yǎng)物，成活率較低，故而PHA含量也較少；隨著廢油添加量的增多，菌株存活率增大，PHA含量隨之增大，這正好符合碳源過?？捎行Т龠MPHA的生成[17]；當(dāng)廢油添加量超過25 mL/L后，細(xì)胞干重和PHA含量反而出現(xiàn)下降的趨勢，這說明過多的油脂會抑制菌株的生長，從而降低PHA的產(chǎn)生量。

因此，發(fā)酵培養(yǎng)過程需要控制廢油的添加量，最佳添加量為25 mL/L。

4結(jié)論

(1)通過實驗研究，確定煎炸廢油可以作為以殺蟲貪銅菌發(fā)酵生產(chǎn)PHA過程的碳源物質(zhì)。煎炸廢油回收相對簡單，因此可以很好的解決PHA生產(chǎn)過程中底物原料成本高的問題，并達(dá)到將廢棄油脂資源化的目的。

(2)通過發(fā)酵條件的單因素影響試驗，確定了優(yōu)化發(fā)酵條件：當(dāng)初使pH值為7.5、裝液量為100mL/250 mL、培養(yǎng)溫度為28 ℃、接種量為3 %、轉(zhuǎn)速為160r/min、廢油添加量為25 mL/L進行發(fā)酵培養(yǎng)時，PHA產(chǎn)量可達(dá)到6.63 g/L，約占到細(xì)胞干重的 83.8 %。

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Fermentation Condition Factors Influence of a PHA Producing Strain Biosynthesis PHA by Using Waste Fried Oil

Chong Yuxuan, Ren Lianhai, Wang Pan

(SchoolofFoodandChemicalEngineering,BeijingTechnologyandBusinessUniversity,Beijing100048,China)

Abstract:Waste fried oil was used as carbon source in the process of PHA fermentation. The effects of six factors of fermentation condition on PHA synthetic quantity and cell weight were investigated. Fermentation condition factors include initial pH value, fluid volume per flask, culture temperature, shaking speed, inoculation amount and waste fried oil volume. The result shows that, at the condition of pH 7.5, 100 mL fluid medium per 250 mL conical flask, 28 ℃, 3 % inoculation amount, shaking speed 160 r/min and 25 mL/L waste fried oil, the yield of PHA reached a maximum value.

Key words:Polyhydroxyalkanoates; Waste fried oil; Fermentation condition factors

收稿日期：2016-04-06

基金項目：北京市自然科學(xué)基金(編號：8144041)；“十二五”國家科技支撐計劃(編號：2012BAC25B01;2014BAC27B01-03)

作者簡介：種宇軒(1989—)，男，北京工商大學(xué)食品學(xué)院碩士研究生。 通信作者：任連海(1971—)，男，博士，教授，主要從事固體廢物處理處置方面的研究工作。

中圖分類號：Q547

文獻標(biāo)識碼：A

文章編號：1674-9944(2016)10-0065-04