汪三存，丁美滿，魏曉林，張　濤，姚　斐（.嘉興市公安局刑偵支隊DNA實驗室，浙江 嘉興 3400；.嘉興市公安局南湖區(qū)分局刑偵大隊，浙江嘉興 34000）

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PowerPlex?21試劑盒擴增后的分型圖譜中Y片段丟失的識別

汪三存1，丁美滿1，魏曉林1，張濤2，姚斐1
（1.嘉興市公安局刑偵支隊DNA實驗室，浙江 嘉興 314001；2.嘉興市公安局南湖區(qū)分局刑偵大隊，浙江嘉興 314000）

摘要：目的 依據分型圖譜，直觀、簡便識別是否存在Amelogenin基因Y片段丟失的可能。方法 采用計算分型圖譜中等位基因峰高之和比值的方法，統(tǒng)計1 968份人員樣本經PowerPlex?21試劑盒擴增后Amelogenin與D3S1358基因座之間的均衡性、Amelogenin X等位基因與Amelogenin Y等位基因的均衡性以及D3S1358基因座不同等位基因的均衡性情況。結果 90.8%的女性樣本Amelogenin X等位基因峰高不低于D3S1358基因座等位基因峰高和的60%，94.9%的男性樣本Amelogenin X等位基因的峰高不超過D3S1358基因座等位基因峰高和的70%。結論 PowerPlex?21試劑盒擴增后的分型結果中，當Amelogenin基因只檢測到Amelogenin X等位基因，且Amelogenin X等位基因的峰高不及D3S1358基因座等位基因峰高之和的70%時，應考慮存在Y片段丟失的可能性。

關鍵詞：法醫(yī)遺傳學；DNA指紋法；基因頻率；Amelogenin基因

STR和Amelogenin復合擴增所得到的分型圖譜中，正常男性樣本得到X染色體和Y染色體特異的2種PCR產物片段，正常女性樣本則僅有X染色體特異的1種PCR產物片段。但是，有些男性個體因Amelogenin基因突變［1］導致Y染色體特異擴增后無產物，顯示為類似女性樣本的一條譜帶，易造成結果誤判。本研究通過對1968份經PowerPlex?21試劑盒擴增的人員樣本的分型結果進行統(tǒng)計分析，擬驗證依據分型圖譜中Amelogenin X等位基因與毗鄰的D3S1358基因座等位基因峰高之和的比值，可直觀識別Y染色體擴增片段是否缺失。

1　材料與方法

1.1研究對象

實驗室人員數據庫建設中受理的人員唾液FTA 卡1968份，其中女性樣本355份，男性樣本1613份。

1.2主要儀器與試劑

BSD600-Duet全自動打孔儀（澳大利亞BSD公司），9700型PCR儀（美國原AB公司），3130xl型和3500xl型遺傳分析儀（美國AB公司），PowerPlex?21試劑盒（美國promega公司）。

1.3DNA分型方法

1 968份唾液 FTA卡經 BSD600打孔（孔直徑1.2mm），采用PowerPlex?21試劑盒在9700型PCR儀上進行復合擴增，擴增產物應用3130xl型或3500xl型遺傳分析儀進行檢測，結果用GeneMapper ID-X1.4軟件進行分析。

1.4數據分析

依據GeneMapper ID-X1.4軟件的圖譜質量評分系統(tǒng)對每個圖譜的質量進行評分，選取符合判讀質量要求的樣本，共分成四組：D3S1358基因座為純合子的男性樣本組（M-1組）、D3S1358基因座為雜合子的男性樣本組（M-2組）、D3S1358基因座為純合子的女性樣本組（F-1組）和D3S1358基因座為雜合子的女性樣本組（F-2組）。

分型圖譜中，等位基因的峰面積按三角形的面積計算方式處理，但峰的底邊長度相較峰高的高度對于峰面積的影響可以忽略。因此，等位基因峰高的比值可以代表其均衡性［2］。均衡性計算公式：（HX+HY）/（HA+ HB）=（Amelogenin的 height1+height2）/（D3S1358的height1+height2）。式中HX表示Amelogenin X等位基因的峰高，HY表示Amelogenin Y等位基因的峰高，HA、HB表示D3S1358基因座的等位基因峰高，height1 和height2是GeneMapper ID-X1.4軟件中表示等位基因峰高的值。

女性樣本的HY和D3S1358基因座為純合子時的HB均為零。由于HA、HB只是與D3S1358基因座的height1、height2值對應，可能HA＞HB，也可能HA＜HB，因此，計算均衡性時存在HA=70%HB和HB=70%HA兩種情形，同樣道理，Amelogenin基因座與D3S1358基因座之間的均衡性、Amelogenin基因座X等位基因與Y等位基因之間的均衡性均包含兩種情形。

2　結果

2.1均衡性結果

根據標準［3］規(guī)定，復合擴增的分型結果中，同一基因座雜合子的均衡性不低于70%、毗鄰基因座的均衡性不低于50%。本研究1968例樣本中1927例（其中女性樣本346列，男性樣本1581例）的分型結果符合判讀要求。統(tǒng)計四組樣本的Amelogenin與D3S1358基因座等位基因峰高之和的比值，計算各組樣本的Amelogenin基因座與D3S1358基因座間的均衡性和Amelogenin基因座、D3S1358基因座上不同等位基因的均衡性結果（表1）。

表1　1927例樣本Amelogenin與D3S1358基因座間、Amelogenin和D3S1358基因座上不同等位基因的均衡性分布?。?）

本研究中，沒有發(fā)現男性樣本在Amelogenin基因座出現Y片段丟失的情形。表1結果顯示，Power-Plex?21試劑盒擴增后的分型結果中，超過82%的樣本Amelogenin與D3S1358基因座間的均衡性大于70%，超過91%的樣本Amelogenin X等位基因與Amelogenin Y等位基因、D3S1358基因座的不同等位基因的均衡性大于85%。90.8%的女性樣本Amelogenin X等位基因峰高不低于D3S1358基因座等位基因峰高和的60%，94.9%的男性樣本Amelogenin X等位基因的峰高不超過D3S1358基因座等位基因峰高和的70%。

2.2案例應用

2014年3月18日，嘉興市某賓館房間內發(fā)生一起強奸案。受害人陰道擦拭物的PowerPlex?21分型圖譜中，顯示Amelogenin基因座只有Amelogenin X等位基因（圖1）。并且，Amelogenin X等位基因的峰高與D3S1358基因座等位基因的峰高之和比值為：［19433/（14791+14879）］×100%=65.5%，應考慮Y片段丟失的可能。該檢材的DNA模板用PowerPlex? Y23試劑盒擴增，獲得了Y-STR數據（圖2），證實Amelogenin基因的Y片段存在缺失。破案后，嫌疑人的唾液FTA卡的STR分型結果（圖3）與受害人陰道擦拭物的分型相同。

3　討論

按照（HX+HY）/（HA+HB）=（Amelogenin的height1+ height2）/（D3S1358的 height1+height2）計算時，若（HX+HY）＜（HA+HB）且HX＜HY，則Amelogenin X等位基因峰高與D3S1358基因座峰高之和的比值最小。此種情形下，女性樣本的Amelogenin X等位基因峰高與D3S1358基因座峰高之和的比值約為 60%，即70%×85%≈60%；男性樣本的Amelogenin X等位基因峰高與D3S1358基因座峰高之和的比值約為42%，即70%×70%×85%≈42%。

作為初步識別判斷方法，可將此比值標準適當放大至更為保險的70%，即當分型圖譜中只顯示有Amelogenin X等位基因，且Amelogenin X等位基因的峰高不及D3S1358基因座峰高之和的70%時，應該考慮存在Y片段丟失的可能性。

當考慮Amelogenin基因有Y片段丟失可能時，可以通過：（1）用增加了Y染色體性別決定序列的擴增試劑盒（如AB公司的GlobalFiler?試劑盒包含Y-indel和DYS391）進行檢驗。（2）Y-STR驗證。（3）有條件的還可采用家系調查、直接測序等方法進行驗證、確認。

參考文獻：

［1］曹志華，孫亞男，唐立岡，等.Y染色體Amelogenin基因變異1例［J］.濟寧醫(yī)學院學報，2014，37（2）：122-123.

［2］中華人民共和國國家質量監(jiān)督檢驗檢疫總局，中國國家標準化管理委員會.法庭科學人類熒光標記STR復合擴增檢測試劑質量基本要求：GA/T 815—2009［S］.北京：中國標準出版社，2009.

［3］中華人民共和國公安部.人類DNA熒光標記STR分型結果的分析及應用：GA/T 1163—2014［S］.北京：中國標準出版社，2014.

（本文編輯：柳燕）

中圖分類號：DF795.2

文獻標志碼：A

doi：10.3969/j.issn.1004-5619.2016.03.008

文章編號：1004-5619（2016）03-0193-03

作者簡介：汪三存（1976—），男，主檢法醫(yī)師，主要從事法醫(yī)DNA研究；E-mail：wsc1976@sina.com

收稿日期：（2015-09-06）

Recognition of Y Fragment Deletion by Genotyping Graphs after Amplified by PowerPlex?21 Detection Kit

WANG San-cun1，DING Mei-man1，WEI Xiao-lin1，ZHANG Tao2，YAO Fei1
（1.DNA Lab of Criminal Investigation Detachment，Jiaxing Public Security Bureau，Jiaxing 314001，China；2.Criminal Investigation Team，Nanhu District Branch Bureau，Jiaxing Public Security Bureau，Jiaxing 314000，China）

Abstract：Objective To recognize the possibility of Y fragment deletion of Amelogenin gene intuitively and simply according to the genotyping graphs.Methods By calculating the ratio of total peak height of genotyping graphs，the statistics of equilibrium distribution between Amelogenin and D3S1358 loci，Amelogenin X-gene and Amelogenin Y-gene，and different alleles of D3S1358 loci from 1968 individuals was analyzed after amplified by PowerPlex?21 detection kit.Results Sum of peak height of Amelogenin X allele was not less than 60%that of D3S1358 loci alleles in 90.8%female samples，and sum of peak height of Amelogenin X allele was not higher than 70%that of D3S1358 loci alleles in 94.9%male samples.Conclusion The result of genotyping after amplified by PowerPlex?21 detection kit shows that the possibility of Y fragment deletion should be considered when only Amelogenin X-gene of Amelogenin is detected and the peak height of Amelogenin X-gene is not higher than 70%of the total peak height of D3S1358 loci.

Key words：forensic genetics；DNA fingerprinting；gene frequency；Amelogenin gene