張碩峰，賈占紅，吳金英，丁巖，魏蕓，孫建寧

(北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100102)

復(fù)方黃柏液對(duì)家兔皮膚創(chuàng)口肉芽組織增生的影響

張碩峰，賈占紅，吳金英，丁巖，魏蕓，孫建寧Δ

(北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100102)

目的 觀察復(fù)方黃柏液對(duì)家兔皮膚破損創(chuàng)口愈合以及對(duì)肉芽組織中TGF-β1、VEGF、FGF-7表達(dá)的影響。方法 15只家兔隨機(jī)分為5組，即對(duì)照組、京萬紅組、復(fù)方黃柏液0.3、0.2、0.1 mL組，用手術(shù)刀在每只家兔耳內(nèi)側(cè)做長方形切口復(fù)制皮膚切除性傷口模型，分別使用復(fù)方黃柏液0.3、0.2、0.1 mL及京萬紅軟膏外敷傷口，給藥5 d，以肉芽組織覆蓋率評(píng)價(jià)創(chuàng)面愈合情況，并通過免疫組化方法觀察創(chuàng)口肉芽組織中TGF-β1、VEGF、FGF-7的表達(dá)。結(jié)果 復(fù)方黃柏液可不同程度提高創(chuàng)口肉芽組織覆蓋率，使創(chuàng)口肉芽組織中VEGF、FGF-7的表達(dá)增加，顯著高于對(duì)照組(P<0.05，P<0.01)。結(jié)論 復(fù)方黃柏液可明顯促進(jìn)肉芽組織增生，促進(jìn)皮膚傷口的愈合。

復(fù)方黃柏液；創(chuàng)口愈合；TGF-β1；VEGF；FGF-7

復(fù)方黃柏液由黃柏、連翹、金銀花、蒲公英、蜈蚣組成。前期研究結(jié)果表明復(fù)方黃柏液具有抗感染，促進(jìn)皮膚傷口愈合的作用[1]。結(jié)合前期實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)，本研究仍采用兔耳創(chuàng)傷模型，但改變了創(chuàng)口的形狀，采用長方形切口，垂直于創(chuàng)口長軸取材，便于對(duì)創(chuàng)口愈合進(jìn)行多指標(biāo)監(jiān)測(cè)，而不受圓形傷口的限制[2]。以創(chuàng)口肉芽組織覆蓋率，肉芽組織中TGF-β1、VEGF、FGF-7的表達(dá)作為觀測(cè)指標(biāo)，以確定復(fù)方黃柏液對(duì)創(chuàng)口愈合的影響，并初步分析其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：大耳白家兔，15只，雄性，2～2.5 kg。北京市昌揚(yáng)西山養(yǎng)殖場(chǎng)提供，許可證編號(hào)：SCXK(京)2011-0010，合格證號(hào)：11402300001140。

1.1.2 藥品和試劑：復(fù)方黃柏液(批號(hào)：1209101，規(guī)格：100 mL/瓶，山東漢方制藥有限公司)，京萬紅軟膏，(批號(hào)：211954，規(guī)格：20 g/支，天津達(dá)仁堂京萬紅藥業(yè)有限公司)。第一抗體: VEGF抗體(博士德BA0407)；TGF-β1抗體(博士德BA0290)；FGF7抗體(博士德BA0853)。免疫組化染色試劑盒：Histostain-Plus Mouse Primary (Cat. No. 85-6643, Invitrogen, USA)；Histostain-Plus Rabbit Primary(Cat. No. 85-6743, Invitrogen, USA)。DAB Kit (Cat. No. 00-2014, Invitrogen, USA)。

1.2 方法

1.2.1 造模方法：實(shí)驗(yàn)前在家兔耳廓內(nèi)側(cè)用75%酒精擦拭。第2天用2把手術(shù)刀并聯(lián)(間隔5 mm)在家兔左右耳內(nèi)側(cè)，各做5 mm×10 mm長方形切口，撕去損傷皮膚，用消毒棉簽擦拭至軟骨板完全暴露，軟骨板未見明顯損傷即為造模成功，用膠貼棉覆蓋傷口并醫(yī)用膠布固定，復(fù)制皮膚切除性傷口模型。

1.2.2 分組給藥：將造模家兔隨機(jī)分為5組，每組3只，即對(duì)照組、京萬紅組、復(fù)方黃柏液0.3、0.2、0.1 mL組。造模后即刻將相應(yīng)藥物原液(京萬紅軟膏約0.2 g/處創(chuàng)口)滴加或涂抹在醫(yī)用膠貼棉貼處，覆蓋傷口并醫(yī)用膠布固定。每天換藥1次，對(duì)照組使用生理鹽水0.3 mL/處創(chuàng)口。共給藥5 d。

1.2.3 指標(biāo)檢測(cè)：取家兔耳部創(chuàng)面連同邊緣區(qū)域，4%甲醛溶液固定，垂直包埋，垂直創(chuàng)口長軸切片，做HE染色，免疫組化檢測(cè)VEGF、TGF-β1、FGF7在創(chuàng)口肉芽組織中的表達(dá)。鏡下觀察測(cè)量傷口肉芽組織未覆蓋區(qū)域距離，并計(jì)算肉芽組織覆蓋率。

免疫組化各指標(biāo)各樣本隨機(jī)選取創(chuàng)口肉芽組織3個(gè)視野，用圖像分析軟件Image pro-plus6.0，分別計(jì)算各視野IOD值，并計(jì)算均值。

2 結(jié)果

2.1 復(fù)方黃柏液對(duì)家兔耳部皮膚切除性傷口愈合的影響 與對(duì)照組相比，各劑量復(fù)方黃柏液可不同程度促進(jìn)家兔切除性傷口的愈合，使創(chuàng)口肉芽組織覆蓋率增加(P<0.05，P<0.01)。見表1。

表1 復(fù)方黃柏液對(duì)家兔耳部皮膚切除性傷口愈合的影響

*P<0.05，與對(duì)照組相比較，compared with control group

2.2 復(fù)方黃柏液對(duì)家兔耳部皮膚切除性傷口肉芽組織TGF-β1、FGF7和VEGF表達(dá)的影響 與對(duì)照組相比，各劑量復(fù)方黃柏液可不同程度促進(jìn)家兔切除性傷口的愈合，使創(chuàng)口肉芽組織中FGF7、VEGF表達(dá)增加(P<0.05，P<0.01)，但對(duì)創(chuàng)口肉芽組織TGF-β1表達(dá)作用不明顯，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖1，表2。

圖1 復(fù)方黃柏液對(duì)家兔耳部皮膚切除性傷口肉芽組織TGF-β1、FGF7和VEGF表達(dá)的影響Fig.1 Effect of FFHB liquid on TGF-1β and VEGF and FGF7 expression in granulation tissue of rabbit ear skin excision wound healing

組別劑量(mL/處創(chuàng)口)例數(shù)TGF-β1FGF7VEGF對(duì)照組-6109.4±41.064.8±19.642.0±15.1復(fù)方黃柏液組0.3697.4±20.0116.0±30.3**89.7±31.0*0.2691.1±59.3130.0±55.4*69.6±16.8*0.16113.4±49.4123.5±53.4*86.2±40.6*京萬紅組0.2g694.7±27.3140.2±28.6**96.3±43.3*

*P<0.05，**P<0.01，與對(duì)照組相比較，compared with control group

3 討論

創(chuàng)傷愈合，是醫(yī)學(xué)研究中的重要課題，肉芽組織形成數(shù)量的多少與質(zhì)量的好壞直接影響創(chuàng)面的修復(fù)程度。創(chuàng)面的修復(fù)過程是一個(gè)復(fù)雜的生物學(xué)過程，研究表明多種生長因子，如成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)等在組織修復(fù)過程中發(fā)揮著重要作用——刺激上皮細(xì)胞遷移、增殖以及促進(jìn)角質(zhì)細(xì)胞分層和分化，是創(chuàng)面愈合的重要因素[3]。

FGF家族由23個(gè)成員組成，主要由角質(zhì)細(xì)胞，成纖維細(xì)胞，血管內(nèi)皮細(xì)胞，平滑肌細(xì)胞，軟骨細(xì)胞和肥大細(xì)胞分泌，F(xiàn)GF-7是該家族重要的一員，多種組織的損傷會(huì)上調(diào)FGF-7的表達(dá)，F(xiàn)GF-7誘導(dǎo)表達(dá)主要通過激活蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)及環(huán)磷腺苷依賴的蛋白激酶途徑完成。角質(zhì)化細(xì)胞通過釋放IL-1β 調(diào)整成纖維細(xì)胞FGF-7 表達(dá)，IL-1β 是最有效的成纖維細(xì)胞FGF-7誘導(dǎo)物[4]。FGF-7在急性創(chuàng)傷后表達(dá)增加，其高水平表達(dá)與傷口恢復(fù)時(shí)間一致，他加快了上皮細(xì)胞增殖和上皮化的速率，能明顯刺激角質(zhì)細(xì)胞增殖和遷移從而促進(jìn)再上皮化[5]；同時(shí)，F(xiàn)GF-7還能增加對(duì)活性氧(ROS)解毒物質(zhì)的轉(zhuǎn)錄，如非硒依賴性谷胱甘肽過氧化物酶、過氧化物還原酶Ⅵ、核呼吸因子2 和肺部表皮型脂肪酸結(jié)合蛋白等，從而降低角質(zhì)細(xì)胞的凋亡，通過保護(hù)角質(zhì)細(xì)胞起到促進(jìn)上皮化的作用[6-8]；此外FGF-7還能促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖以及上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)表達(dá)，對(duì)新生血管形成起到一定的作用。VEGF的轉(zhuǎn)錄和分泌在急性創(chuàng)傷的早期增加。創(chuàng)傷形成后，活化的血小板、巨噬細(xì)胞在創(chuàng)面愈合中釋放VEGF，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，加速肉芽的生長，同時(shí)能誘導(dǎo)表皮基底細(xì)胞移行，加速創(chuàng)面的上皮化[9-11]。本研究表明復(fù)方黃柏液可不同程度增加創(chuàng)口肉芽組織中VEGF、FGF-7的表達(dá)，提示復(fù)方黃柏液可促進(jìn)創(chuàng)傷局部血管增生，使創(chuàng)面局部的微循環(huán)得以重建，增加局部血流量，促進(jìn)肉芽組織增生，并通過FGF-7的作用，促進(jìn)創(chuàng)面組織再上皮化，進(jìn)而促進(jìn)傷口愈合。

轉(zhuǎn)換生長因子-β (TGF-β)是一種多效性的細(xì)胞因子，主要由巨噬細(xì)胞，角質(zhì)細(xì)胞，成纖維細(xì)胞和血小板分泌，在細(xì)胞增殖、細(xì)胞遷移、細(xì)胞存活和凋亡、免疫調(diào)節(jié)、上皮-間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)換(epitheial-mesechymal transition，EMT)、細(xì)胞外基質(zhì)生成、炎癥等創(chuàng)傷修復(fù)期的多個(gè)生物學(xué)過程中起重要作用[12-13]。人皮膚組織中轉(zhuǎn)化生長因子β有β1、β2、β3三個(gè)亞型，均可刺激結(jié)締組織生長因子的表達(dá)，其中轉(zhuǎn)化生長因子β1可促進(jìn)創(chuàng)面早期愈合，對(duì)于創(chuàng)面愈合的結(jié)局具有重要意義[14]。創(chuàng)傷形成后，隨著轉(zhuǎn)化生長因子β在各細(xì)胞中表達(dá)增強(qiáng)，VEGF在細(xì)胞中的表達(dá)也明顯增強(qiáng)，從而促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，加速肉芽的生長，加速創(chuàng)面的愈合[15]。本研究結(jié)果表明復(fù)方黃柏液促進(jìn)肉芽組織中TGF-β1的表達(dá)增加作用不明顯，這可能與模型動(dòng)物創(chuàng)傷形成后局部損傷組織TGF-β1表達(dá)均顯著增加有關(guān)。

綜上所述，復(fù)方黃柏液具有明顯的促進(jìn)皮膚傷口愈合的作用，其作用機(jī)制可能與復(fù)方黃柏液促進(jìn)肉芽組織的生長，促進(jìn)創(chuàng)面組織再上皮化有關(guān)。

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(編校：吳茜)

Effect of Fufang Huangbai Ye on granulation tissue hyperplasia of rabbit skin wound

ZHANG Shuo-feng, JIA Zhan-hong, WU Jin-ying, DING Yan, WEI Yun, SUN jian-ningΔ

(Bejing University of Chinese Medicine, Beijing 100102, China)

ObjectiveTo observe the effect of Fufang Huangbai Ye(FFHB liquid) on wound healing and expression of TGF-β1, VEGF and FGF7 in granulation tissue of rabbit. MethodsUsing scalpel created rectangle wound through the skin to the level of the cartilage on the ventral aspect of each rabbit ear. Wounds had been treated with FFHB liquid 0.3,0.2,0.1 mL/d for 5 days. The coverage of granulation tissue and expression of TGF-β1, VEGF and FGF7 in granulation tissues of each group were observed and compared. ResultsFFHB liquid can increase the coverage of granulation tissue of wound and the expression of VEGF and FGF-7 in granulation tissue obviously (P<0.05,P<0.01). ConclusionFFHB liquid can promote the granulation tissue proliferation and wound healing.

Fufang Huangbai Ye;wound healing;TGF-β1;VEGF;FGF7

張碩峰，男，博士，副教授，研究方向：中藥藥理，E-mail：shuofengzhang@sina.com；通信作者，孫建寧，女，本科，教授，研究方向：中藥藥理，E-mail：jn_sun@sina.com。

R285.5

B

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.05.11