李艱++周廣柱

摘要：以3種竹柳品系3號、5號、7號為試驗(yàn)材料，以垂柳為參照，通過不同人工模擬-20、-25、-30、-33、-35、-38、-40 ℃等低溫處理，測定各枝條的相對電導(dǎo)率、可溶性蛋白、SOD、POD、游離脯氨酸及丙二醛含量等抗寒性相關(guān)指標(biāo)，運(yùn)用Logistic方程計算半致死溫度，通過主成分分析法和隸屬函數(shù)法綜合評價各竹柳品系與垂柳的抗寒性。結(jié)果表明，不同溫度梯度下，各抗寒指標(biāo)與竹柳品系和垂柳的抗寒性顯著相關(guān)（P<0.05）；各竹柳品系抗寒性均高于垂柳，相對電導(dǎo)率與抗寒綜合指數(shù)大小為竹柳5號>竹柳7號>竹柳3號>垂柳；半致死溫度與抗寒綜合指數(shù)極顯著負(fù)相關(guān)（P<0.01）。

關(guān)鍵詞：竹柳品系；垂柳；抗寒性；半致死溫度；綜合評價

中圖分類號： Q945.78文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2016）06-0307-04

收稿日期：2016-02-15

作者簡介：李艱（1991—），男，遼寧沈陽人，碩士研究生，主要從事園林植物栽培及應(yīng)用技術(shù)研究。E-mail：516061@qq.com。

通信作者：周廣柱，碩士，教授，主要從事園林植物栽培及應(yīng)用技術(shù)研究。E-mail：359860287@qq.com。竹柳（Salix Zhuliu）是美國加州農(nóng)大與美國幾家較大的紙業(yè)及種苗公司利用美國寒柳、朝鮮柳（Salix koreensis Anderss）、筐柳（Salix linearistipularis）和毛竹[Phyllostachys heterocycla （Carr.） Mitford cv. Pubescens]經(jīng)雜交選育而成的優(yōu)良用材與觀賞品系[1]，具有喜光、抗逆性強(qiáng)、生長快等特點(diǎn)。竹柳品系3號生長快、干直，5號抗逆性強(qiáng)，7號觀賞價值高。目前，竹柳品系抗鹽堿和繁殖技術(shù)方面的研究較多[2-3]，抗寒性研究相對較少。張捷等以抗寒性強(qiáng)的旱柳為參照，研究竹柳品系的抗寒性發(fā)現(xiàn)，竹柳各品系的抗寒性不如旱柳[4]。本試驗(yàn)選用抗寒性較強(qiáng)的垂柳（Salix babylonica）為參照，研究竹柳品系3號、5號、7號的抗寒性，以期為適栽垂柳的寒冷地區(qū)引種竹柳提供技術(shù)依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料采集

竹柳品系3號、5號、7號和垂柳1年生植株共300株，由內(nèi)蒙古包頭市引進(jìn)。試材采集在秋季落葉后進(jìn)行，按照李合生的對角線取樣法[5]，選取5個樣點(diǎn)，每個樣點(diǎn)隨機(jī)選取5株，每株采集5根1年生枝條；將采集的枝條在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)剪口蠟封，置于0 ℃條件下儲藏，備用。

1.2材料處理

2015年11月上旬，用蒸餾水沖洗干凈各供試枝條；選擇粗度相對均勻、成熟健壯的枝條分割成段，每段長10 cm，用自來水沖洗數(shù)遍，再用蒸餾水沖洗3～4次；待水分晾干，裝入聚乙稀袋中貼上標(biāo)簽，分別用紗布包好，放入泡沫盒中并置于0 ℃冰箱中保存，備用；將各品系和垂柳枝條分別在-20、-25、-30、-33、-35、-38、-40 ℃等溫度條件下進(jìn)行低溫脅迫處理，以0 ℃處理作為對照，以4 ℃/h的速率降溫，持續(xù) 12 h；逐步回溫至0 ℃，放置8 h，測定相關(guān)指標(biāo)，重復(fù)3次。

1.3測定方法

相對電導(dǎo)率采用電導(dǎo)儀法[6]測定；SOD活性、POD活性、可溶性蛋白含量、脯氨酸含量、丙二醛含量分別采用氮藍(lán)四唑（NBT）法、愈創(chuàng)木酚法、考馬斯亮藍(lán)法、茚三酮比色法、硫代巴比妥酸法[7]測定。

1.4數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

利用Logistic方程[8]y=k/（1+ae-bx） 求低溫半致死溫度LT50，式中，y為電導(dǎo)率，a、b為方程參數(shù)，k為最大電解質(zhì)透出率。以0 ℃的枝條測定值為對照組，以低溫處理的各主要抗寒性指標(biāo)測定值為處理值，計算各抗寒指標(biāo)的變化率為：變化率=（處理值-對照值）/對照值；對變化率標(biāo)準(zhǔn)化處理，進(jìn)行主成分分析。采用Microsoft excel 2003、SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，采用用Duncans新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)[9]。隸屬度數(shù)值計算公式為：R（Xij）=（Xij-Xjmin）/（Xjmax-Xjmin）；反隸屬函數(shù)值計算公式為：R（Xij）=1-（Xij-Xjmin）/（Xjmax-Xjmin）。式中，R（Xij）表示i種類j指標(biāo)的抗寒隸屬函數(shù)值；Xij表示i種類j指標(biāo)的測定值；Xjmin表示所有種類j指標(biāo)的最小值；Xjmax表示所有種類j指標(biāo)的最大值；i表示某個品系；j表示某指標(biāo)[10]。

2結(jié)果與分析

2.1低溫脅迫對竹柳相對電導(dǎo)率的影響及半致死溫度的確定

植物細(xì)胞電解質(zhì)的外滲程度可用相對電導(dǎo)率來表示，以反映植物細(xì)胞膜系統(tǒng)受低溫的傷害程度[11-12]。由圖1可見，隨溫度降低，各竹柳品系的相對電導(dǎo)率上升；-20～-30 ℃時，各品系的相對電導(dǎo)率明顯增加，不同品系相對電導(dǎo)率的增加幅度有所不同，竹柳5號相對電導(dǎo)率的變化明顯低于其他各品系；低于-35 ℃，各品系的相對電導(dǎo)率變化速率明顯下降。因此，-20～-35 ℃相對電導(dǎo)率大小的變化可有效反應(yīng)各品系的抗寒性強(qiáng)弱。由表1可見，竹柳各品系在人工低溫脅迫下的相對電導(dǎo)率經(jīng)Logistic方程回歸，其方程擬合度分別為0.958、0.967、0.966、0.976，擬合結(jié)果可靠；竹柳5號的半致死溫度相對最低，為-35.16 ℃，這說明竹柳5號的抗寒性相對最好。

2.2低溫脅迫對竹柳SOD活性的影響

魏臻武等研究表明，植物體內(nèi)SOD活性與植物本身的抗寒性具有相關(guān)性[13]。由圖2可見，溫度降低過程中，各品系的SOD含量呈先增高后降低趨勢；溫度在-20～-33 ℃時，各品系的SOD活性均呈上升趨勢，且變化明顯；溫度達(dá)到-35 ℃時，竹柳5號的SOD活性相對最好，這說明其細(xì)胞內(nèi)的保護(hù)酶調(diào)節(jié)作用相對最強(qiáng)，抗寒性最好；溫度低于-35 ℃，各品系的SOD活性呈下降趨勢，這說明各品系細(xì)胞內(nèi)的保護(hù)酶系統(tǒng)可能在低溫脅迫中受到傷害。

2.3低溫脅迫對竹柳POD活性的影響

繳麗莉等研究表明，植物體受到低溫脅迫，體內(nèi)的POD活性呈先升高后降低的趨勢，并認(rèn)為植物體內(nèi)POD活性與植物本身的抗寒性具有相關(guān)性[14-15]。由圖3可見，溫度降低過程中，各品系的POD活性呈先增高后降低的趨勢；溫度在 -20～-35 ℃時，各品系的POD活性均呈上升趨勢，且變化明顯；溫度達(dá)到-38 ℃時，竹柳5號的POD活性相對最好，這說明其細(xì)胞內(nèi)的保護(hù)酶調(diào)節(jié)作用最強(qiáng)，抗寒性相對最好；溫度低于-35 ℃，除竹柳5號外，其他品系的POD活性呈下降趨勢，說明這些品系細(xì)胞內(nèi)的保護(hù)酶系統(tǒng)可能在低溫脅迫中受到傷害。

2.4低溫脅迫對竹柳可溶性蛋白含量的影響

研究表明，經(jīng)低溫處理的植物，其可溶性蛋白質(zhì)含量變化與抗寒性存在相關(guān)性。由圖4可見，溫度降低過程中，各品系的可溶性蛋白含量呈先增高后降低的趨勢；溫度在-20～-35 ℃ 時，各品系的可溶性蛋白均呈上升趨勢，且變化明顯；溫度達(dá)到-38 ℃時，竹柳5號的可溶性蛋白含量最高；溫度低于-35 ℃，各品系的可溶性蛋白含量呈下降趨勢，這說明各品系體內(nèi)的蛋白質(zhì)代謝受到低溫的嚴(yán)重影響，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)代謝發(fā)生紊亂。

2.5低溫脅迫對竹柳脯氨酸含量的影響

Krishnan等認(rèn)為，植物體內(nèi)脯氨酸的積累受低溫影響，其含量與植物的抗寒性具有相關(guān)性[16]。由圖5可見，溫度降低過程中，各品系的脯氨酸含量呈先升高后降低的規(guī)律性變化，且各品系間的變化幅度存在一定差異；垂柳在高于-33 ℃時呈上升趨勢，而竹柳3號、7號在高于-35 ℃時呈上升趨勢，竹柳5號在高于38 ℃時呈上升趨勢。

2.6低溫脅迫對竹柳丙二醛含量的影響

研究表明，丙二醛的含量變化能反映胞質(zhì)的過氧化程度和植物對低溫脅迫的抵御能力。由圖6可見，在0～-20 ℃低溫脅迫時，各品系的MDA含量呈極緩慢下降趨勢；隨溫度降低，各品系的MDA含量迅速上升；-20～-30 ℃時，垂柳、竹柳3號的MDA含量均呈升高趨勢，且變化明顯，竹柳5號、7號的變化相對較小，這表明竹柳5號、7號對膜脂過氧化產(chǎn)物的清除能力較強(qiáng)，抗寒能力相對較好；-30 ℃時，竹柳3號、垂柳的丙二醛含量達(dá)到最大，這表明該溫度時竹柳3號、垂柳的細(xì)胞膜脂過氧化程度較高，受凍害嚴(yán)重，溫度繼續(xù)下降，組織會逐漸死亡。

2.7抗寒指標(biāo)的相關(guān)性分析

研究表明，各品系相對電導(dǎo)率、可溶性蛋白含量、SOD活性、POD活性、游離脯氨酸含量、丙二醛含量與抗寒性的相關(guān)性系數(shù)分別為0.986、-0.971、-0.984、-0.963、-0.977、0.954，相對電導(dǎo)率、丙二醛含量與抗寒性呈顯著正相關(guān)，可溶性蛋白含量、SOD活性、POD活性、游離脯氨酸含量與抗寒性呈顯著負(fù)相關(guān)。因此，選取相對電導(dǎo)率、可溶性蛋白含量、

SOD活性、POD活性、游離脯氨酸含量、丙二醛含量作為衡量竹柳抗寒性的主要指標(biāo)。但相關(guān)抗寒指標(biāo)不能完全解釋各品系抗寒的實(shí)質(zhì)，各品系的抗寒性可結(jié)合隸屬函數(shù)法進(jìn)行綜合評價。對表2、表3數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，由表4可見，第1、2主成分的特征根均大于1，綜合貢獻(xiàn)率達(dá)到96.790%，可以反映大部分信息。因此，提取第1、2主成分對竹柳的抗寒性進(jìn)行綜合評價。

通過第1、2主成分中各指標(biāo)的負(fù)荷量F與貢獻(xiàn)值Y，計算各抗寒性指標(biāo)對竹柳抗寒性的作用大小，確定相對電導(dǎo)率、SOD活性、POD活性、可溶性蛋白含量、游離脯氨酸含量、丙二醛含量6個抗寒指標(biāo)的權(quán)重Wi分別為0.124 323、0.258 517、0.177 813、0.055 131、0.132 496、0.251 719。由于各指標(biāo)的單位、性質(zhì)、數(shù)量不同，采用隸屬度函數(shù)法進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)數(shù)量化，根據(jù)主成分因子負(fù)荷量的正負(fù)確定隸屬函數(shù)的升降順序，從而以確保各指標(biāo)變化的連續(xù)性。根據(jù)各指標(biāo)隸屬度值與權(quán)重，得到各品系抗寒性的綜合指數(shù)Y，計算公式為：

Y=Wij×R（Xij）

。

式中：Wij為各指標(biāo)權(quán)重，R（Xij）為各指標(biāo)隸屬度值。由表5可見，不同品系抗寒性強(qiáng)弱的順序?yàn)橹窳?號>竹柳7號>竹柳3號>垂柳?？购C合指數(shù)與半致死溫度LT50的相關(guān)性分析結(jié)果表明，抗寒性綜合指數(shù)與半致死溫度的相關(guān)系數(shù)為 -0.995，有極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系。

3結(jié)論與討論

試驗(yàn)結(jié)果表明，在低溫脅迫過程中，隨著溫度降低，竹柳各試材的相對電導(dǎo)率呈逐漸升高的趨勢，這與何云等研究結(jié)論[17-19]相符；垂柳的半致死溫度相對最高，為-28.18 ℃，竹柳5號的半致死溫度相對最低，為-35.16 ℃；竹柳各試材的SOD活性與POD活性隨溫度降低，均呈先升高后降低的變化規(guī)律，這與王玲麗等結(jié)論[20-22]相符；可溶性蛋白含量隨溫度降低呈先升高后降低的趨勢，竹柳5號可溶性蛋白含量始終高于其他品系，可溶性蛋白含量可以簡單反應(yīng)試材抗寒性的強(qiáng)弱，與馬迪的研究結(jié)果[23]相符，但與司劍華等的研究結(jié)果[24]有些不同，這可能是由不同植物的抗寒機(jī)理存在一定差異所致；在達(dá)到半致死溫度前，各試材脯氨酸、丙二醛含量處于上升狀態(tài)，達(dá)到半致死溫度后逐漸降低，這可能是由于低溫環(huán)境導(dǎo)致植物體內(nèi)細(xì)胞受到嚴(yán)重?fù)p傷，從而導(dǎo)致膜質(zhì)過氧化作用的減弱，這與蘇李維等的研究結(jié)論[9]相符，但與司劍華等研究結(jié)果[24]不符。

植物是一個有機(jī)整體，受到逆境脅迫引起植物生理指標(biāo)變化的因素錯綜復(fù)雜[25]。通過抗寒各指標(biāo)與試材半致死溫度的相關(guān)性分析可知，相對電導(dǎo)率、可溶性蛋白含量、SOD活性、POD活性、游離脯氨酸含量、丙二醛含量與抗寒性有著密切的關(guān)系，但不能直接判斷品系間抗寒性的強(qiáng)弱[26-27]。將竹柳各抗寒性指標(biāo)的變化率通過主成分分析，并轉(zhuǎn)化為綜合的主成分，確定各個抗寒性指標(biāo)在抗寒作用中的權(quán)重，通過隸屬度函數(shù)分析法計算出綜合抗寒指數(shù)，結(jié)果表明，供試材料的抗寒性依次為竹柳5號>竹柳7號>竹柳3號>垂柳。

半致死溫度是表征植物抗寒性的主要生態(tài)因子[28]。試驗(yàn)結(jié)果表明，半致死溫度的高低不僅與供試材料的抗寒性強(qiáng)弱結(jié)果一致，而且與抗寒性綜合指數(shù)呈極顯著負(fù)相關(guān)。不同生境下竹柳的各個生理指標(biāo)可能會發(fā)生變化，單一指標(biāo)很難反映植物的抗寒性，也不能解釋植物抗寒性的生理生化機(jī)理[29-30]，運(yùn)用隸屬函數(shù)分析更具有科學(xué)性和可靠性[31-32]。

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