摘要：以組培生產(chǎn)的鐵皮石斛原球莖、叢生芽和植株莖段為材料提取石斛，測定其多糖含量，計(jì)算多糖累積效率，以了解不同形態(tài)鐵皮石斛組培苗的多糖含量及其變化規(guī)律。結(jié)果表明，不同形態(tài)的鐵皮石斛組培苗多糖含量差異較大，植株莖段的多糖含量相對(duì)最高，可達(dá)26.20%，原球莖多糖含量次之，為25.26%，二者均可達(dá)到《中華藥典》中對(duì)石斛中藥材多糖含量要求的規(guī)定；原球莖和植株莖段的多糖含量與培養(yǎng)時(shí)間呈正相關(guān)；原球莖多糖的積累效率相對(duì)最高，可以成為生產(chǎn)石斛多糖的原料新來源。

關(guān)鍵詞：鐵皮石斛；組織培養(yǎng)；多糖含量；莖段；原球莖；叢生芽

中圖分類號(hào)： S567.043文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2016）06-0403-03

收稿日期：2016-01-29

基金項(xiàng)目：濱州職業(yè)學(xué)院科研計(jì)劃（編號(hào)：2013YJKT11、2013XYKT07）。

作者簡介：張曉博（1980—），女，山西太原人，碩士，講師，從事動(dòng)物、植物生理學(xué)和生物化學(xué)教學(xué)與研究工作。E-mail：sdzhangxb@126.com。鐵皮石斛（Dendrobium offcinale Kimura et Migo）屬于蘭科石斛屬多年生草本植物，在自然條件下，鐵皮石斛采用傳統(tǒng)的實(shí)生苗栽培、分株、扦插等方式進(jìn)行生產(chǎn)，產(chǎn)量極低，而采用組織培養(yǎng)技術(shù)獲得鐵皮石斛成為目前最常用的生產(chǎn)方法。石斛多糖是鐵皮石斛中主要的活性成分，多糖含量是評(píng)價(jià)鐵皮石斛質(zhì)量高低的主要指標(biāo)[1]。本試驗(yàn)通過比較不同形態(tài)和不同時(shí)期鐵皮石斛組培苗中的多糖含量，為鐵皮石斛組織培養(yǎng)技術(shù)代替大田生產(chǎn)提供理論數(shù)據(jù)。

1材料與方法

1.1儀器與試劑

儀器主要有恒溫水浴鍋、回流提取裝置、分光光度計(jì)、離心機(jī)、電子天平、真空干燥箱、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。試劑主要有苯酚、濃硫酸、95%乙醇、葡萄糖，均為分析純；80%乙醇。

1.2試驗(yàn)材料的準(zhǔn)備

1.2.1鐵皮石斛原球莖分別取在1/2 MS+0.3 mg/L NAA+0.1 mg/L 6-BA固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)10、20、30 d的鐵皮石斛原球莖，烘箱中60 ℃烘干；粉碎，干燥至恒質(zhì)量；稱質(zhì)量，備用。

1.2.2鐵皮石斛叢生芽取鐵皮石斛原球莖轉(zhuǎn)接于1/2 MS+0.2 mg/L NAA+0.5 mg/L 6-BA固體培養(yǎng)基上，經(jīng) 14 d 誘導(dǎo)分化形成鐵皮石斛叢生芽；將叢生芽在烘箱中 60 ℃ 烘干；粉碎，干燥至恒質(zhì)量；稱質(zhì)量，備用。

1.2.3鐵皮石斛組培植株莖段切取鐵皮石斛叢生芽轉(zhuǎn)接于MS+1.2 mg/L NAA+0.3 g/L活性炭固體培養(yǎng)基上，分別取培養(yǎng)60、90、120 d的鐵皮石斛組培苗莖段部分，將其放在烘箱中60 ℃烘干；粉碎，干燥至恒質(zhì)量；稱質(zhì)量，備用。1.3測定內(nèi)容及方法

1.3.1含水量測定取培養(yǎng)于固體培養(yǎng)基的鐵皮石斛原球莖、叢生芽及植株稱質(zhì)量，干燥箱中105 ℃烘20～30 min，再在溫度60～80 ℃下烘干至恒質(zhì)量，稱質(zhì)量。

含水量=（M0-M1）÷M0×100%。

式中：M0為烘干前質(zhì)量；M1為烘干后質(zhì)量。

1.3.2多糖含量測定

1.3.2.1供試樣品多糖的制備取烘干待測樣品，粉碎，過3號(hào)篩（50目）；精確稱定0.3 g粉末，加水200 mL，加熱提取2 h；冷卻，轉(zhuǎn)移至250 mL容量瓶，加水稀釋至刻度，搖勻；過濾，濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至20 mL；將濃縮液移入 25 mL 容量瓶，定容，搖勻；精確吸取2 mL稀釋液，置15 mL離心管中，加入無水乙醇10 mL，搖勻，冷藏 2 h；取出，4 000 r/min 離心20 min，棄去上清液，沉淀用80%乙醇洗滌2次，每次8 mL；4 000 r/min離心20 min，棄去上清液，沉淀加熱水溶解，并轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶；冷卻，用水稀釋至刻度，搖勻，即得鐵皮石斛的多糖提取溶液。

1.3.2.2對(duì)照品溶液的配制以無水葡萄糖作為對(duì)照品，取適量，105 ℃干燥至恒質(zhì)量，精確稱量；加水溶解并定容，搖勻，制成每1 mL含糖100 μg的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液。

1.3.2.3檢測波長的選擇精確吸取標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液 0.5 mL，置于具塞比色管中，補(bǔ)加蒸餾水至2.0 mL；加苯酚試液1.0 mL，搖勻；迅速滴加濃硫酸5.0 mL，迅速搖勻，置沸水浴中加熱20 min；取出，置冰水浴中冷卻5 min；在550～650 nm 范圍內(nèi)對(duì)溶液進(jìn)行掃描，以吸光度為縱坐標(biāo)，入射光波長為橫坐標(biāo)作圖，結(jié)果顯示，波長為490 nm左右時(shí)吸光度最高（圖1），故選用490 nm作為檢測波長。

1.3.2.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備精確量取對(duì)照品溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，分別置于10 mL 具塞試管中，補(bǔ)加水至1.0 mL；加5%苯酚溶液1 mL（臨用配制），搖勻；加硫酸 5 mL，搖勻，置沸水浴中加熱20 min；取出，放入冰浴中冷卻 5 min，波長490 nm處測定吸光度；以吸光度為縱坐標(biāo)（y）、濃度為橫坐標(biāo)（x）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得吸光度和濃度的回歸方程為：y=0.391 7x-0.008 6（r=0.999 7），這說明多糖濃度在 0～100 μg/mL 時(shí)，濃度和吸光度具有良好的線性關(guān)系。

1.3.2.5樣品多糖含量的測定精確量取樣品多糖提取液1.0 mL，置于10 mL具塞試管中；加5%苯酚溶液1 mL，搖勻；加硫酸5 mL，搖勻，置沸水浴中加熱20 min；取出，放入冰浴中冷卻5 min，測定吸光度。每個(gè)樣品平行處理3次，取平均值，根據(jù)回歸方程計(jì)算葡萄糖的質(zhì)量濃度，進(jìn)一步計(jì)算多糖的含量。

1.3.2.6精密度試驗(yàn)吸取0.5 mL葡萄糖對(duì)照品溶液6份，按照多糖含量測定步驟進(jìn)行操作，測定吸光度，得到相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD值為1.64%（n=6），這說明精密度良好。

1.3.2.7重復(fù)性試驗(yàn)按照多糖供試品的制備步驟，制備6份同一樣品的多糖溶液，分別吸取各樣品溶液1 mL至試管，按照多糖含量測定步驟進(jìn)行操作，測定吸光度，得到相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD值為1.86%（n=6），這說明重復(fù)性良好。

1.3.2.8顯色穩(wěn)定性試驗(yàn)精確量取某一供試樣品溶液 1 mL 至試管，按照多糖含量測定步驟進(jìn)行操作；室溫下分別放置10、30 min和1、2、3、4 h，波長490 nm處測定吸光度，得到相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD值為2.99%，這表明供試品顯色在4 h內(nèi)穩(wěn)定。

1.3.2.9加樣回收率試驗(yàn)取某一樣品，精確加入葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品25 mg，按照多糖提取步驟制備供試樣品溶液；吸取1 mL至試管，按照多糖含量測定步驟進(jìn)行操作，測定吸光度。經(jīng)6次平行測定，得平均回收率為94.75%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD值為3.2%（n=6）。

2結(jié)果與分析

2.1鐵皮石斛供試樣品含水量的測定

由表1可見，供試的鐵皮石斛新鮮組織含水量較大，平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)88.85%；鐵皮石斛不同發(fā)育形態(tài)的含水量存在明顯差異，原球莖的含水量相對(duì)最大，變幅為97.91%～98.05%，平均為97.98%，這是因?yàn)樵蚯o組織中含大量薄壁細(xì)胞[2]，干物質(zhì)較少；分化后的植株含水量相對(duì)最少，變幅為87.14%～76.42%，平均含水量為81.61%，且隨著分化后培養(yǎng)時(shí)間的增加，含水量呈下降趨勢，這是因?yàn)榉只蟮慕M織薄壁細(xì)胞減少，分化出的莖、葉等細(xì)胞不斷積累纖維素和果膠質(zhì)等一些干物質(zhì)成分；叢生芽組織含水量為92.35%，居于中間，這與其處于前2個(gè)發(fā)育形態(tài)的過渡時(shí)期相符合。因此，實(shí)際生產(chǎn)中不同形態(tài)的組培苗得到石斛干粉的得率是不同的，應(yīng)該分別計(jì)算產(chǎn)品得率。

2.2培養(yǎng)形態(tài)與多糖含量的關(guān)系

由表2可見，不同培養(yǎng)階段供試樣品的多糖含量存在明顯差異；植株莖段的多糖含量相對(duì)最高，平均含量達(dá)到 21.71%；其次是原球莖，平均多糖含量為18.01%；叢生芽的多糖含量相對(duì)最少，平均多糖含量僅為4.74%，經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，與其他2個(gè)階段的多糖含量相比，存在顯著差異（P<0.05）；培養(yǎng)30 d的原球莖多糖含量達(dá)25.26%，培養(yǎng)120 d的植株莖段多糖含量高達(dá)26.20%，這兩者都達(dá)到藥典規(guī)定的石斛多糖含量不低于25%的標(biāo)準(zhǔn)。叢生芽的多糖含量不但低于植株莖段，甚至比原球莖時(shí)期還要低，這種現(xiàn)象主要與鐵皮石斛分化生長和發(fā)芽習(xí)性等有著內(nèi)在聯(lián)系，鐵皮石斛組培苗沒有分化以前，原球莖薄壁細(xì)胞的增殖和生長是有利于多糖積累的，但分化后大量產(chǎn)生叢生芽，出芽過程對(duì)能量的需求加大，使組織分解糖類，多糖不僅得不到積累反而會(huì)伴隨出芽的過程大量消耗；分化成植株后，隨著分化的完善，植株長出莖和葉，能有效利用光照和培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)大量積累多糖。因此，選擇最佳的培養(yǎng)形態(tài)是提高鐵皮石斛多糖含量的有效途徑之一。

2.3不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)多糖含量的影響

由表2可見，相同培養(yǎng)形態(tài)下，鐵皮石斛培養(yǎng)時(shí)間不同，多糖含量存在明顯差異。原球莖的差異相對(duì)最大，培養(yǎng)10 d時(shí)多糖含量僅為6.42%，到培養(yǎng)30 d時(shí)增加到25.26%，增幅為18.84百分點(diǎn)；其次是植株莖段，培養(yǎng)60 d時(shí)，多糖含量為16.07%，到培養(yǎng)120 d時(shí)增加到26.20%，增幅為10.13百分點(diǎn)。這說明培養(yǎng)時(shí)間和多糖的含量存在一定的正相關(guān)性，培養(yǎng)時(shí)間越長，石斛多糖的含量就越高。

2.4不同培養(yǎng)形態(tài)與多糖累積效率的關(guān)系

由圖2可見，原球莖的多糖含量從6.42%累積到 25.26% 需要20 d，組織多糖積累效率為9.42 mg/（g·d）。而植株莖段多糖含量從16.07%累積到26.20%卻需要60 d，組織多糖積累效率為1.69 mg/（g·d），原球莖多糖積累效率明顯高于植株。這與不同組織的生長特異性有關(guān)，原球莖組織中都是未分化的薄壁細(xì)胞，生長速度快，細(xì)胞分裂周期短，而已經(jīng)分化為植株莖段的組織，由于基因表達(dá)選擇特異性，這一階段植物的生長除了多糖，還伴隨有石斛堿、蛋白質(zhì)、纖維素、果膠質(zhì)等各種復(fù)雜成分統(tǒng)一增長和積累的過程。

3結(jié)論與討論

鐵皮石斛組培苗的培養(yǎng)階段是影響石斛多糖產(chǎn)量的重要因素之一。本試驗(yàn)中，鐵皮石斛原球莖培養(yǎng)30 d與植株莖段培養(yǎng)120 d時(shí)多糖的含量相對(duì)較高，分別為25.26%、26.20%，參照2010年版《中華人民共和國藥典》規(guī)定：鐵皮石斛按干燥品計(jì)算，以無水葡萄糖計(jì)，含鐵皮石解多糖不得少于25.0%[1]，鐵皮石斛這2個(gè)培養(yǎng)階段的多糖含量均達(dá)到規(guī)定要求。這與黃以平等的研究結(jié)論[3-4]相符。因此，組織培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)的鐵皮石斛原球莖和植株莖段，可以替代傳統(tǒng)栽培和野生的石斛藥材，可以解決野生藥材資源少而人工栽培生產(chǎn)周期長、產(chǎn)量低的問題[5-6]。試驗(yàn)結(jié)果還表明，鐵皮石解組織培育過程中，培養(yǎng)時(shí)間對(duì)多糖含量的影響呈正相關(guān)，原球莖和植物莖段隨培養(yǎng)時(shí)間的延長，多糖含量分別從6.42%增加到25.26%、從16.07%增加到26.20%，這與蘇江等的研究結(jié)論[7-8]較為吻合。

從多糖積累效率來看，鐵皮石斛原球莖積累多糖的速度遠(yuǎn)高于植株莖段，再加上原球莖培養(yǎng)時(shí)間相對(duì)較短，積累多糖速度快，能降低生產(chǎn)成本，可作為石斛多糖優(yōu)先選擇的生產(chǎn)來源，這也或許可以促進(jìn)鐵皮石斛價(jià)格的理性回歸。

需說明的是，鐵皮石斛原球莖培養(yǎng)一定時(shí)間，培養(yǎng)基中的全部碳源基本消耗[2]，造成培養(yǎng)液滲透壓降低，不利于鐵皮石斛的生長。另外，雖然原球莖多糖含量和植株莖段相似，但是其他營養(yǎng)成分如石斛堿、氨基酸、抗氧化酶活性等指標(biāo)是否也能與人工栽培甚至野生植株的相同還不得而知；因此，需要從延長原球莖生長時(shí)間和其他營養(yǎng)成分指標(biāo)比較等方面開展進(jìn)一步研究。

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