陳梅玲，袁文，張譜華，王靜，閔凡貴，趙維波，陳梅麗

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實驗室病原菌檢測能力的自我評估

陳梅玲，袁文，張譜華，王靜，閔凡貴，趙維波，陳梅麗

（廣東省實驗動物監(jiān)測所/廣東省實驗動物重點實驗室，廣東 廣州510663）

摘要：目的通過國際實驗動物科學(xué)協(xié)會（ICLAS）提供的盲樣對本實驗室微生物檢測能力進行自我評估。方法將ICLAS提供的7個盲樣接種到血平板培養(yǎng)并純化，依次通過革蘭染色、氧化酶試驗和觸酶試驗選擇相應(yīng)的梅里埃生化條上機進行鑒定。對于上述方法無法確認的樣品則采用PCR和基因測序的方法進一步鑒別。結(jié)果對7個盲樣進行分析后，最終確認1號為金黃色葡萄球菌，2號為銅綠假單胞菌，3號為肺炎鏈球菌，4號為欣氏鮑特菌，5號為粘質(zhì)沙雷菌，6號為牛棒狀桿菌，7號為嗜肺巴斯德桿菌，檢測結(jié)果與ICLAS提供結(jié)果一致。結(jié)論本實驗室病原菌檢測質(zhì)量可靠，實驗人員的檢測水平合格。

關(guān)鍵詞：國際實驗動物科學(xué)協(xié)會；病原菌；盲樣

實驗室能力驗證，是指利用實驗室間指定檢測數(shù)據(jù)的比對，確定實驗室從事特定測試活動的技術(shù)能力，是國際通行的實驗室質(zhì)量控制方法和認可機構(gòu)確認實驗室能力的有效技術(shù)手段［1-2］，對提高實驗室的檢測水平以及社會聲譽有重要意義［3-4］，也是對實驗室檢測能力的綜合鍛煉與提高。

2007年國際實驗動物科學(xué)協(xié)會（the international council for laboratory animal science，ICLAS）建立了實驗動物診斷實驗室績效評估項目（PEP），旨在對動物檢測實驗室的檢測能力進行監(jiān)督和自我評估。該項目向全球的動物診斷實驗室開放，每年定期向參與實驗室發(fā)送盲樣，參與實驗室通過提交檢測結(jié)果并與ICLAS結(jié)果進行比對，以驗證自身的檢測能力。此外對于出現(xiàn)問題的檢測實驗室，項目組織者

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2016-05-30 11：02 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20160530.1102.006.html可以提供相關(guān)的建議和幫助［5］。本單位作為實驗動物的監(jiān)督檢測單位，肩負廣東省乃至華南區(qū)其他部分省份實驗動物質(zhì)量的檢測工作，檢測能力的評估意義重大。為驗證病原菌實驗室檢測能力，本單位在已參加2012年ICLAS-PEP能力驗證的基礎(chǔ)上參加了2014年ICLAS-PEP病原檢測項目，此次實驗出現(xiàn)了樣品培養(yǎng)未能生長、鑒定結(jié)果的細菌不在ICLAS-PEP菌種目錄里，現(xiàn)將檢測結(jié)果和比對情況進行報道。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 ICLAS提供的7個盲樣，分別為小鼠肺勻漿（1號）、水樣（2號）、大鼠鼻腔內(nèi)容物（3號）、小鼠鼻氣管內(nèi)容物（4號）、小鼠盲腸內(nèi)容物（5號）、小鼠皮拭子（6號）、大鼠呼吸道內(nèi)容物（7號）。1.1.2 試劑 血平板（廣州市迪景微生物科技有限公司）；半固體動力生化管（北京陸橋技術(shù)責(zé)任有限公司）；生化管、桿菌肽紙片和奧卜托新紙片（杭州天和微生物試劑有限公司）；氧化酶試劑和生化鑒定條API STAPH、ID 32E、API 20 Strep、API 20NE、API CORYNE（Biomerieux公司）；RNA提取試劑盒（Invitrogen公司）；PrimeScript?RT reagent Kit （Takara公司）。

1.1.3 儀器 SPX-288生化培養(yǎng)箱（江南儀器廠）；1300生物安全柜（Thermo公司）；ATB微生物鑒定儀器（Biomerieux公司）；Tprofessional梯度PCR儀（Biometra公司）；Powerpac Basic 164-5050電泳儀（Bio-Rad公司），Gel DocTM XR+全自動凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad公司）。

1.2 方法

1.2.1 參考標準 《實驗動物 微生物學(xué)檢測方法（2）》（GB14926）及第2版《伯杰氏系統(tǒng)細菌學(xué)手冊》。

1.2.2 培養(yǎng) 分別從樣品保存管中吸取菌液10～20 μL劃線接種到血平板上，置于生化培養(yǎng)箱中36℃培養(yǎng)24～48 h后，挑取單個菌落進行純培養(yǎng)。

1.2.3 涂片染色鏡檢 挑取單個菌落涂片，革蘭染色鏡檢。

1.2.4 氧化酶試驗和觸酶試驗 挑取染色鏡檢為革蘭陰性桿狀的菌落做氧化酶試驗；取染色鏡檢為革蘭陽性球狀和革蘭陽性鏈球狀的菌落做觸酶試驗。

1.2.5 生化反應(yīng) 挑取純培養(yǎng)物制備一定濃度的菌懸液，無菌操作將菌懸液注入試條的生化反應(yīng)杯中，于29℃或36℃培養(yǎng)24 h后讀取結(jié)果。

1.2.6 嗜肺巴斯德桿菌的PCR方法 挑取樣品，提取RNA，按設(shè)置條件進行逆轉(zhuǎn)錄及PCR反應(yīng)，具體如下：94℃預(yù)變性5 min；然后進行35個循環(huán)，94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸1 min；最后72℃再次延伸10 min，120 V，25 min凝膠電泳。嗜肺巴斯德桿菌引物序列為：Forward：5′-AATTACAGCTCACTATTCGYCGTCA-3′；Reverse：5′-CCCAATGCAGTAATYAAYGTMCCCA-3′；擴增片段大小為1 039 bp。

1.2.7 基因測序方法 挑取樣品，采用擴增細菌16 S rRNA的通用引物（引物序列為：Forward：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，Reverse：5′-AAG GAGGTGATCCAGCCGCA-3′，擴增片段大小為1 540 bp）進行PCR反應(yīng)，具體條件如下：94℃預(yù)變性5 min；然后進行40個循環(huán)，94℃變性1 min，57℃退火1 min，72℃延伸2 min；最后72℃再次延伸10 min，120 V，25 min凝膠電泳。對目的擴增產(chǎn)物進行測序，使用DNASTAR軟件和NCBI中BLAST軟件進行序列比對。

2 結(jié)果

2.1 培養(yǎng)結(jié)果

細菌培養(yǎng)結(jié)果顯示，1～6號盲樣均可在血平板上正常生長，而7號盲樣在血平板上未形成任何菌落，同時后續(xù)使用營養(yǎng)肉湯搖床培養(yǎng)，均未見生長。

2.2 鏡檢

鏡檢發(fā)現(xiàn)1、3和6號盲樣為G+菌，2、4和5號盲樣為G-桿菌，7號為G-小桿菌。結(jié)果見表1。

表1 革蘭染色鏡檢特征和判定結(jié)果Table 1 Characteristics and results of Gram staining by microscopy

2.3 氧化酶試驗和觸酶試驗

根據(jù)鏡檢結(jié)果，對1和3號盲樣培養(yǎng)物進行觸酶試驗，2、4和5號盲樣培養(yǎng)物進行氧化酶試驗，并進行了初步判斷，結(jié)果見表2。

2.4 生化鑒定

通過生化條對1～6號盲樣進行鑒定，結(jié)果見表3。其中，1、2、4、5和6號盲樣的生化條鑒定結(jié)果的鑒定百分數(shù)（%ID）都在96以上，可信度高，綜合鏡檢結(jié)果可以初步確認為金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、鳥博特菌、粘質(zhì)沙雷菌和牛棒狀桿菌。3號盲樣生化條鑒定結(jié)果無效。

表2 氧化酶試驗和觸酶試驗結(jié)果Table 2 Results of oxidase and catalase tests

表3 生化條鑒定結(jié)果Table 3 Results of biochemical identification

2.5 3號盲樣的鑒定

3號盲樣鏡檢和觸酶試驗實驗初步判定為鏈球菌，但生化條鑒定結(jié)果無效。將培養(yǎng)物接種到液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，染色鏡檢為雙球菌。樣品在血平板上培養(yǎng)48 h，菌落中央可凹陷致邊緣隆起而呈臍窩狀，疑似肺炎鏈球菌，進行鑒別生化試驗。結(jié)果顯示，膽汁溶菌試驗陽性、奧卜托新（Optochin）敏感試驗陽性，膽汁七葉苷陰性，因此確定3號盲樣為肺炎鏈球菌。

2.6 4號盲樣的鑒定

4號盲樣經(jīng)梅里埃生化條鑒定結(jié)果為鳥博特菌，%ID為96.6，評價良好。但是鑒于該菌為稀有菌株，相關(guān)生化反應(yīng)（如觸酶陽性、氧化酶陽性、硝酸鹽還原陰性、尿素陰性、動力陰性）與欣氏鮑特菌一致，尚需要進一步區(qū)分。為此，項目組開展了相關(guān)的生化試驗，結(jié)果見表4。通過生化反應(yīng)仍無法確定4號盲樣的最終結(jié)果。由于現(xiàn)有的生化反應(yīng)不能區(qū)分兩種菌，項目組對此結(jié)果不能完全可信。查找相關(guān)文獻，重新進行相關(guān)生化反應(yīng)，并進一步設(shè)計引物，擴增特異片段進行基因測序，使用DNASTAR軟件和NCBI中BLAST軟件進行序列比對，發(fā)現(xiàn)樣品與欣氏鮑特菌3224的核苷酸同源性為100%，因此，確定4號盲樣為欣氏鮑特菌。

表4 4號盲樣生化管鑒定結(jié)果Table 4 Results of biochemical identification of sample 4

2.7 7號盲樣的鑒定

7號盲樣在分離培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)菌已經(jīng)死亡，無法使用常規(guī)的方法進行鑒定。將該盲樣進行革蘭染色，鏡檢發(fā)現(xiàn)為G-小桿菌，依據(jù)檢測人員工作經(jīng)驗并結(jié)合實驗動物常見病原檢測情況，疑似嗜肺巴斯德桿菌，進而采用PCR方法對其進行鑒定，產(chǎn)物電泳結(jié)果（圖1）顯示，7號盲樣擴增片段與陽性嗜肺巴斯德桿菌預(yù)期擴增結(jié)果1 039 bp特異性條帶相符，確認7號盲樣為嗜肺巴斯德桿菌。

1和2為陰性對照；3和4為陽性嗜肺巴斯德桿菌；5和6為7號盲樣。圖1 7號盲樣PCR鑒定結(jié)果Figure 1 PCR results of sample 7

2.8 與ICLAS結(jié)果比對

綜合上述試驗結(jié)果，1號為金黃色葡萄球菌，2號為銅綠假單胞菌，3號為肺炎鏈球菌，4號為欣氏鮑特菌，5號為粘質(zhì)沙雷菌，6號為牛棒狀桿菌，7號為嗜肺巴斯德桿菌，檢測結(jié)果與ICLAS提供結(jié)果完全一致。

3 討論

通過本次能力驗證發(fā)現(xiàn)，在微生物菌株的鑒定過程中，不可一味相信生化反應(yīng)條，特別是對于同種屬的菌。生化條反應(yīng)的局限性在于對多個生化反應(yīng)出現(xiàn)相同結(jié)果的不同菌株無法進行區(qū)分，這就導(dǎo)致如果單純依賴生化條進行菌株的鑒定不夠科學(xué)。此外，有些菌株可能依靠傳統(tǒng)的檢測方法難以鑒定，需借助一些其他的輔助手段，如PCR和基因測序等。PCR方法由于其快速、靈敏的特點，可為傳統(tǒng)的病原菌檢測提供強有力的補充。

通過本次ICLAS-PEP項目，可以綜合判斷本單位微生物病原菌檢測結(jié)果是可靠的，實驗人員的檢測水平和檢測能力是合格的。此外，通過此次能力驗證也提高了本單位微生物檢驗人員的分析能力。

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（責(zé)任編輯：幸建華）

中圖分類號：R372

文獻標志碼：A

文章編號：1006-8783（2016）03-0370-04

DOI：10.16809/j.cnki.1006-8783.2016041204

收稿日期：2016-04-12

基金項目：廣東省級科技計劃項目（2014A070705003）

作者簡介：陳梅玲（1985—），女，研究實習(xí)員，主要從事實驗動物的病原微生物檢測工作，Email：362265636@qq.com；通信作者：趙維波（1976—），男，副研究員，主要從事實驗動物檢測相關(guān)研究工作，Email：183775444@qq.com；陳梅麗（1971—），女，獸醫(yī)師，主要從事實驗動物標準化管理，Email：1071138433@qq.com。

Self-assessment of microbiological monitoring capacity in laboratory

CHEN Meiling，YUAN Wen，ZHANG Puhua，WANG Jin，MIN Fangui，ZHAO Weibo，CHEN Meili
（Guangdong Laboratory Animals Monitoring Institute，Guangdong Provincial Key Laboratory of Laboratory Animals，Guangzhou 510663，China）

AbstractObjective To test samples supplied by ICLAS for self-assessment of microbiological monitoring capacity in our laboratory.Methods Seven blind samples provided by ICLAS were cultured and purified in blood plates.The samples were tested by Gram staining oxidase test catalase test and the biochemical identification system.PCR and gene sequencing were used to identify the samples that did not be confirmed by the above methods.Results Samples from 1 to 7 were identified as Staphylococcus aureus Pseudomonas aeruginosa Streptococcus pneumoniae Cushing′s thibaut bacteria Serratia marcescens Corynebacterium bovis and Pasteurella pneumotropica respectively.These results were in agreement with those notified by ICLAS.

Conclusion The microbiological monitoring results in this laboratory are reliable and the monitoring level of the laboratory personnel is qualified.

Key wordsICLAS pathogen blind sample