張宏偉，張立娟，鄭冬梅，*（.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江哈爾濱50030；.天津市食品研究所有限公司，天津30609）

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親水色譜法測(cè)定硝酸鹽和亞硝酸鹽方法研究

張宏偉1，張立娟2，鄭冬梅1，*
（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江哈爾濱150030；2.天津市食品研究所有限公司，天津301609）

摘要：建立使親水色譜柱同時(shí)測(cè)定硝酸鹽和亞硝酸鹽的高效液相色譜方法。樣品勻漿后超聲提取，高速離心處理，采用親水色譜柱分離，乙酸銨和乙腈作為流動(dòng)相進(jìn)行等度洗脫，210 nm紫外檢測(cè)。該方法簡(jiǎn)便快捷、準(zhǔn)確可靠，成本低廉，適用于多種蔬菜中亞硝酸鹽和硝酸鹽的分析。

關(guān)鍵詞：蔬菜；硝酸鹽；亞硝酸鹽；親水色譜

蔬菜中含有較多的硝酸鹽，在硝酸鹽還原酶作用下硝酸鹽可能產(chǎn)生大量的亞硝酸鹽，對(duì)人產(chǎn)生毒害作用。隨著分析化學(xué)新方法和新技術(shù)的不斷出現(xiàn)和發(fā)展，食品中亞硝酸鹽的檢測(cè)也更加多元化，新的檢測(cè)方法層出不窮，常見(jiàn)方法有［1-8］：（1）光度法：包括格里斯試劑比色法、催化光度法、流動(dòng)注射系統(tǒng)-分光光度法、順序注射系統(tǒng)-分光光度法、導(dǎo)數(shù)光度法；（2）示波極譜法；（3）熒光法；（4）離子色譜法；（5）催化動(dòng)力學(xué)法、氣相色譜法以及各種傳感器技術(shù)等。我國(guó)的國(guó)標(biāo)方法為離子色譜法和格里斯試劑比色法［8］。這兩種方法基本是肉類(lèi)食品與果蔬制品中亞硝酸鹽殘留檢測(cè)的主要方法。離子色譜可以對(duì)硝酸鹽和亞硝酸鹽進(jìn)行同時(shí)分析，已經(jīng)成為國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)方法［9-10］，但離子色譜尚未在中國(guó)普及，而且耗材較貴，嚴(yán)重影響色譜法在硝酸鹽和亞硝酸鹽分析中應(yīng)用。

本研究采用高效液相色譜法對(duì)硝酸鹽和亞硝酸鹽的含量進(jìn)行檢測(cè)，利用親水色譜柱ZIC-HILIC作為實(shí)驗(yàn)的色譜柱，分別采用不同濃度的甲酸胺和醋酸銨作為流動(dòng)相，紫外檢測(cè)器于210 nm條件下檢測(cè)亞硝酸鹽的含量，通過(guò)改變不同流動(dòng)相的濃度以及pH來(lái)確定最佳的方法。

1　材料與方法

1.1材料與儀器設(shè)備

水為超純水；硝酸鉀、亞硝酸鈉、甲酸銨、乙酸銨、甲酸、冰乙酸：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；甲醇和乙腈：Merck。

1100高效液相色譜儀：Agilent，配紫外檢測(cè)器；MIXER B-400均質(zhì)儀：Buchi；KQ3200B超聲波清洗儀（250 W，40 KHz）：昆山市超聲波儀器有限公司；FE20 pH計(jì)：梅特勒-托利多儀器有限公司。

1.2樣品前處理

使用MIXER B-400均質(zhì)儀將黃瓜樣品粉碎均質(zhì)。準(zhǔn)確稱(chēng)取勻漿5.00 g，加入80 mL純水，40℃超聲提取30 min，每隔5 min振蕩1次，提取后取出放置至室溫，加水稀釋至刻度。溶液經(jīng)濾紙過(guò)濾后，取部分溶液于10 000 r/min離心15 min，取上清液1 mL使用乙腈定容至10 mL，取定容液過(guò)0.22 μm四氟乙烯濾膜后上機(jī)檢測(cè)。

1.3色譜條件

色譜柱ZIC-HILIC（MERCK）100mm×2.1mm，3.5μm，流速0.3 mL/min，柱溫30℃，紫外檢測(cè)器波長(zhǎng)210 nm［3］，流動(dòng)相為20 mmol/L pH=4.0乙酸銨，90%乙腈。

2　結(jié)果與討論

2.1試樣提取方法的選擇

為了確定較優(yōu)的亞硝酸鹽和硝酸鹽提取溫度和時(shí)間，本試驗(yàn)對(duì)提取時(shí)間和溫度進(jìn)行優(yōu)化。準(zhǔn)確稱(chēng)取黃瓜勻漿5.00g，以超純水定容到100mL，分別選用30、40、50、60℃進(jìn)行超聲水浴提取，超聲功率250 W，頻率40 KHz，提取時(shí)間為20、30、40、50 min，以60℃、50 min時(shí)亞硝酸鹽提取效率為100%計(jì)算，不同時(shí)間和溫度時(shí)的提取效率如圖1所示。

圖1　不同處理方式對(duì)亞硝酸鹽提取率的影響Fig.1　Effect of treatments on the extraction rate of nitrite

如圖1所示，試驗(yàn)結(jié)果表明，在同一個(gè)提取溫度條件下隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，亞硝酸鹽提取率呈現(xiàn)先提高再下降的趨勢(shì)，在40℃超聲提取30 min即可獲得最高的提取率，提取時(shí)間適中，因此選擇40℃超聲提取30 min為本研究的提取條件。

2.2流動(dòng)相的優(yōu)化

分別選用20 mmol/L甲酸銨，20 mmol/L乙酸銨，在其自然pH、pH=4和pH=3條件下與乙腈進(jìn)行混合，混合比例為乙腈85%和90%，由于亞硝酸根較硝酸根出峰晚，本文以分離度和亞硝酸根出峰時(shí)間為判定指標(biāo)進(jìn)行試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1和表2，最優(yōu)色譜條件下標(biāo)準(zhǔn)品圖見(jiàn)圖2。

由表1和表2可知，甲酸胺流動(dòng)相組分離度低于相同條件下的乙酸銨流動(dòng)相組，甲酸胺流動(dòng)相組亞硝酸根出峰時(shí)間長(zhǎng)于相同條件下的乙酸銨流動(dòng)相組，因此選擇乙酸銨組作為流動(dòng)相。相同條件下90%乙腈組較85%乙腈亞硝酸根離子出峰時(shí)間晚，硝酸根和亞硝酸根分離度大，同時(shí)硝酸根距離負(fù)吸收峰遠(yuǎn)，有助于自動(dòng)積分，因此選取20 mmol/L乙酸銨，乙腈濃度為90%，pH為4時(shí)，為最快捷，高效的測(cè)定亞硝酸鹽含量的方法。

表1　不同流動(dòng)相對(duì)分離度的影響Table 1　The effect of Mobile phase on the resolution of peaks

表2　不同流動(dòng)相對(duì)亞硝酸鹽出峰時(shí)間的影響Table 2　The effect of Mobile phase on the peak-time of nitrite min

圖2　標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖Fig.2　The chromatographicdetection result of standardsample

2.3方法線性試驗(yàn)、檢出限及回收率

參照國(guó)標(biāo)方法一［8］配制亞硝酸鹽和硝酸鹽混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，采用上述色譜條件檢測(cè)，以峰面積（y）對(duì)濃度（x）作圖，得到工作曲線，并由基線噪音確定出檢測(cè)限和定量限。其線性范圍、方程及相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表3。

表3　 回歸方程與檢測(cè)限Table 3　The correlation coefficients and LODs

由表3可知，該方法檢測(cè)亞硝酸根和硝酸根具有良好的線性關(guān)系。線性相關(guān)系數(shù)外都達(dá)到0.998以上，亞硝酸根和硝酸根最低檢出限分別為：0.01 mg/L和0.05 mg/L，均達(dá)到或超過(guò)國(guó)標(biāo)方法一的水平。由于亞硝酸根和硝酸根在210 nm附近有較大吸收，因此紫外檢測(cè)器在210 nm波長(zhǎng)下對(duì)這兩種離子具有較高的靈敏度，因此獲得較國(guó)標(biāo)方法更高的靈敏度。同時(shí)，紫外檢測(cè)器對(duì)Cl-不靈敏，可以降低常見(jiàn)的Cl-的干擾［11］。

2.4精密度試驗(yàn)

取濃度為0.1 mg/L亞硝酸鹽和硝酸鹽混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液按上述確定的色譜條件進(jìn)樣6次，保持每次進(jìn)樣色譜條件一致。通過(guò)分析色譜圖計(jì)算得出各生物胺色譜峰的平均值，通過(guò)統(tǒng)計(jì)分析得出標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD）和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），得出結(jié)果越小說(shuō)明精密度越高。精密度試驗(yàn)結(jié)果如表4所示。

表4　 精密度試驗(yàn)結(jié)果Table 4　The results of precision

由表4可知，亞硝酸根和硝酸根色譜峰面積的RSD在1.267 8%～1.734 3%范圍內(nèi)，說(shuō)明該方法精密度良好。

2.5回收率試驗(yàn)

采用向樣品中加標(biāo)的方法進(jìn)行回收率試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果如表5所示。

表5　回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 5　The results of recovery rate

3　結(jié)論

經(jīng)過(guò)試驗(yàn)確定分析方法為樣品勻漿加純水40℃超聲提取30 min，使用ZIC-HILIC（MERCK）100 mm× 2.1 mm，3.5 μm色譜柱，以20 mmol pH=4.0乙酸銨和90%乙腈溶液等度洗脫，流速0.3 mL/min，柱溫30℃，210 nm紫外檢測(cè)，5 min內(nèi)完成分析。該方法具有無(wú)需復(fù)雜前處理，不需固相萃取小柱，利用現(xiàn)有高效液相色譜，檢測(cè)時(shí)間短，7 min內(nèi)完成分析等優(yōu)點(diǎn)，僅需購(gòu)買(mǎi)親水色譜柱（HILIC柱）就可以開(kāi)展工作，因此具有良好的應(yīng)用推廣價(jià)值。

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DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.11.034

作者簡(jiǎn)介：張宏偉（1982—），男（漢），實(shí)驗(yàn)師，碩士，研究方向：食品科學(xué)。

*通信作者

收稿日期：2015-11-12

Research of Determination of Nitrate and Nitrite by Hydrophilic Chromatography

ZHANG Hong-wei1，ZHANG Li-juan2，ZHENG Dong-mei1，*

（1.College of Food Science，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，Heilongjiang，China；2.Food Research Institute Co.，Ltd.，Tianjin 301609，China）

Abstract：The method to determination of nitrate and nitrite in vegetables was established by HILIC column. Vegetables samples were pre-treated by ultrasonic extraction and high-speed centrifugation，separated by HILIC column which used ammonium acetate and acetonitrile as the mobile phase，isocratic elution and UV detection at 210 nm.The method was simple，rapid，accurate and reliable，cheap，and suited forthe analysis of nitrite and nitrate in vegetables.

Key words：vegetables；nitrates；nitrites；HILIC